專利名稱：用雙指示線免疫層析半定量診斷心肌肌鈣蛋白Ⅰ的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，具體是一種用雙指示線免疫層析半定量診斷心肌肌鈣蛋白I的方法。
背景技術(shù)：
隨著我國人民生活水平的提高，高血脂、高血壓、冠心病的發(fā)病率也明顯增高。急性心肌梗塞(acute myocardial infarction, AMI)是冠心病中的一個(gè)非常嚴(yán)重的類型，為冠狀動(dòng)脈閉塞、血流中斷，使部分心肌因嚴(yán)重而持久的缺血發(fā)生局部壞死，從而導(dǎo)致心臟功能的嚴(yán)重?fù)p害，死亡率較高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有1/3-1/2的患者在送至醫(yī)院之前死亡。急性心肌梗塞在歐美多見，我國相對(duì)較少，且北京、天津華北地區(qū)較華南、華東稍多。在今后20年內(nèi)， 急性心肌梗塞將是全世界范圍內(nèi)患者死亡的頭號(hào)病因。急性心肌梗塞是中老年人的常見急癥，如果能夠早期診斷，對(duì)降低病死率有重要意義。其在急性期死亡率較高，尤其在發(fā)病早期。如果在癥狀發(fā)生后的頭1-2小時(shí)內(nèi)處理得及時(shí)和正確，就有可能使患者脫離危險(xiǎn)。對(duì)疑似急性心肌梗塞的病人，要及時(shí)做心電圖檢查，并注意追隨觀察和對(duì)比如果能作白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類、血沉、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、肌酸磷酸激酶等檢查，對(duì)早期診斷急性心肌梗塞更為有益。肌鈣蛋白系心肌和橫紋肌的收縮調(diào)節(jié)蛋白，由三個(gè)亞基即TnCJnI、TnT組成，心肌中主cTnl和cTnT兩種亞型，其靈敏度高、 特異性強(qiáng)，發(fā)病后持續(xù)時(shí)間長，是目前心肌損傷較好的確定指標(biāo)。相比之下cTnl較cTnT心肌特異性更強(qiáng)。心肌損傷后4-8小時(shí)即可在外周血中測得cTnl異常，其增高可持續(xù)5-8天 (cTnl)。長期以來，傳統(tǒng)的心肌酶譜特別是肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)是臨床診斷AMI的重要指標(biāo)，但CK、CK-MB等并非心臟特有的酶，其增高也非特異性的。心肌肌鈣蛋白I(cTnl)是心肌僅有的特異抗原，作為心肌細(xì)胞損傷的標(biāo)志，在血循環(huán)中的高度特異性和和敏感性，越來越受到人們的關(guān)注。心肌肌鈣蛋白I是目前公認(rèn)的、特異性最高且持續(xù)時(shí)間最長的診斷心梗的可靠指標(biāo)，用于心肌損傷特別是微小損傷的診斷，也是心臟手術(shù)時(shí)心肌缺血的可靠指標(biāo)，也可用于評(píng)價(jià)心肌的保護(hù)性措施。這表明，未來我國對(duì)于高質(zhì)量的心肌梗塞診斷產(chǎn)品，尤其是心肌肌鈣蛋白I診斷產(chǎn)品的需求將越來越大。急性心肌梗塞診斷方法主要有診斷根據(jù)典型的臨床表現(xiàn)，特征性的心電圖改變以及實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行診斷。心電圖上的ST段抬高和Q波出現(xiàn)是兩個(gè)高度提示急性心肌梗塞的變化，然而僅僅大約一半的急性心肌梗塞病例就診時(shí)有這些心電圖的改變，大約1/4 的急性心肌梗塞病人缺乏典型的胸痛，只有恰巧在貼近梗死發(fā)生時(shí)記錄心電圖，或者在以后的檢查中發(fā)現(xiàn)長期存在的病理性Q波才可能發(fā)覺。因胸痛懷疑心肌梗塞去急診在最后肯定是急性心肌梗塞的病人中，有一半是在最初的心電圖檢查中得不出急性心肌梗塞的診斷，因此對(duì)大部分病人而言，臨床醫(yī)師必須通過定時(shí)地測定心臟標(biāo)記物來肯定或否定急性心肌梗塞的診斷。而在各種心肌標(biāo)志物中，心肌肌鈣蛋白I(cTnl)是心肌僅有的特異抗原， 作為心肌細(xì)胞損傷的標(biāo)志，在血循環(huán)中的高度特異性和和敏感性，是目前公認(rèn)的、特異性最高且持續(xù)時(shí)間最長的診斷心梗的可靠指標(biāo)。目前，臨床上常用的cTnl檢測的方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和放射性免疫法，上述方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、不利于普及而且費(fèi)用昂貴。開發(fā)簡單、快速的急性心肌梗塞診斷方法具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。免疫膠體金技術(shù)是20世紀(jì)70年代初期由Faulk和Taylor始創(chuàng)，最初用于免疫電鏡技術(shù)。膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物或顯色劑，于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，現(xiàn)在已成功用于電鏡、流式細(xì)胞儀、免疫印跡、蛋白染色、體外診斷制劑的制造等領(lǐng)域。目前金標(biāo)記技術(shù)常與膜載體配合，形成特定的免疫檢測方式，如免疫滲濾試驗(yàn)和免疫層析試驗(yàn)等。免疫層析試紙條就是此技術(shù)用于體外快速診斷的一個(gè)重要發(fā)展方向， 是在現(xiàn)代單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的新型檢測技術(shù)。近年來該技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)在臨床診斷特別是床邊檢測(POCT)中得到了廣泛應(yīng)用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測。利用膠體金的檢測方法測定血清中cTnl作為急性心肌梗塞的診斷，已被開發(fā)，其檢測下限為Ing/mL。但是對(duì)于臨床上單獨(dú)使用Ing/mL這一標(biāo)準(zhǔn)不能直接、快速區(qū)分心肌梗塞嚴(yán)重程度，所以開發(fā)能夠檢測cTnl 1 5ng/mL這一 cTnl診斷灰區(qū)的半定量膠體金試紙也是十分必要的。目前國內(nèi)外均無相關(guān)的試紙條出售。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的開發(fā)簡單、快速的急性心肌梗塞診斷方法具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用膠體金免疫層析法，建立快速檢測cTnl的方法。并且能夠半定量檢測Ing/mL 5ng/mL這一 cTnl灰區(qū)范圍。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記抗cTnl單克隆抗體1并均勻涂布于膠金墊上，作為示蹤標(biāo)記物。在硝酸纖維素膜上，兩個(gè)不同濃度的cTnl單克隆抗體2固定于兩個(gè)檢測線(即T線)，羊抗鼠二抗固定于質(zhì)控線 (即C線)。依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙并裝入檢測卡中。金標(biāo)抗體與相應(yīng)的抗原、抗體發(fā)生特異性結(jié)合被截留而顯色，根據(jù)T線、C線顯色與否來判斷陰陽性結(jié)果。本發(fā)明方法包括如下步驟一、膠體金溶液配制1.配制氯金酸溶液；2.配制2%檸檬酸三鈉溶液；3.將0. 02%的氯金酸溶液加熱至沸騰，迅速加入2%的檸檬酸三鈉2mL ；4.溶液由淺藍(lán)色，深藍(lán)，再加熱出現(xiàn)酒紅色，繼續(xù)煮沸IOmin ；停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫。二、膠體金標(biāo)記物的制備1.取兩個(gè)1. 5mL試管，分別加入ImL膠體金溶液；2.加入適量硼砂緩沖液把pH調(diào)整為7. 5 ；3.加入20μ g/mLcTnl單克隆抗體1，使其達(dá)到最小蛋白濃度，混勻，振蕩30min ；4.加入 20 μ L 的 10 % BSA,混勻，振蕩 30min ；5. 12000rpm離心5min，輕輕吸除上清；
6.用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；7.重復(fù)5.步操作；8.重復(fù)6.步操作；9.重復(fù)5.步操作；10.用fix buffer配制在MOnm處OD (光密度)值為0. 5 1. 0的膠體金免疫復(fù)合物；11.玻璃纖維素膜點(diǎn)樣，形成膠金墊，真空凍干3小時(shí)。三、在硝酸纖維素膜上劃線1. Tl線用濃度為1. Omg/mL的cTnl單克隆抗體2劃線，用于檢出Ing/mL的cTnl ；2.T2線用濃度為0. 25mg/mL的cTnl單克隆抗體2劃線，用于檢出5ng/mL的cTnl ；3. C線用2. Omg/mL羊抗鼠多克隆抗體劃線；4.將硝酸纖維素膜置于40°C烘箱干燥3天。四、膠體金試紙條的組裝1.將樣品墊、膠金墊、NC膜和吸收墊4部分按順序組裝(見附圖1)；2.將其組裝好后用剪刀剪成4mm/條后進(jìn)行檢測。五、檢測試紙平放，將樣品加到檢測條的樣本墊上，由于毛細(xì)效應(yīng)，液體的層析方向向前， 與固定在T線、C線上的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合被截留而顯色。5min后，根據(jù)T線、C線的顯色情況判定陰陽性結(jié)果。C線與靠近C線的檢測帶出現(xiàn)紅色為樣本中cTnl水平大于Ing/mL(見附圖2)，C線與兩條檢測帶都出現(xiàn)紅色為樣本中cTnl水平大于5ng/mL(見附圖3)，只有C 線出現(xiàn)紅色的為陰性(見附圖4)，T線和C線均不顯色則試紙條無效。本發(fā)明檢測對(duì)象單一且針對(duì)性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高。檢測速度快，所需時(shí)間短，只需5min， 不需經(jīng)培訓(xùn)的專業(yè)人員就可使用本發(fā)明方法來檢測，滿足醫(yī)院、門診等部門快速、準(zhǔn)確地診斷心肌梗塞的要求，并且便于基層推廣和運(yùn)用。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例試紙條的圖示圖2為本發(fā)明實(shí)施例試紙條的陽性結(jié)果(cTnl水平大于Ing/mL)圖3為本發(fā)明實(shí)施例試紙條的陽性結(jié)果(cTnl水平大于5ng/mL)圖4為本發(fā)明實(shí)施例試紙條的陰性結(jié)果
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下面實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。本實(shí)例先用2%的檸檬酸三鈉溶液制備20nm的金水，并標(biāo)記cTnl單克隆抗體1噴金標(biāo)墊，cTnl單克隆抗體2、羊抗鼠多克隆抗體分別包被至檢測線(T線)、質(zhì)控線(C線)，然后組裝成試紙條，置37°C烘箱烘干并裁成4mm/條，室溫干燥保存?zhèn)溆谩?shí)施例1.準(zhǔn)備cTnl單克隆抗體1和2。并清洗實(shí)驗(yàn)所需的玻璃器皿。2.膠體金的制備先將0. 02 %氯金酸溶液溶液加熱煮沸，迅速加入2 %的檸檬酸三鈉2mL ；溶液顏色由淺藍(lán)色變?yōu)樯钏{(lán)，繼續(xù)加熱出現(xiàn)酒紅色，繼續(xù)煮沸IOmin ；出現(xiàn)透明的酒紅色，停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫。這樣就制備了 20nm的膠體金溶液。然后用電鏡鏡檢， 確保制備的金顆粒盡量使其大小一致、均勻，顆粒直徑在20nm左右，否則重新制作。3.膠體金標(biāo)記物的制備取兩個(gè)1. 5mL試管，分別加入ImL膠體金溶液；向其中加入適量硼砂緩沖液把pH 調(diào)整為7. 5 ；加入20μ g/mL cTnl單克隆抗體1，使其達(dá)到最小蛋白濃度，混勻，于振蕩儀上快速振蕩30min ；加入20yL的10% BSA，混勻，振蕩30min ；于離心機(jī)中12000rpm，離心5min，輕輕吸除上清；用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；于離心機(jī)中 12000 rpm，離心5min，輕輕吸除上清；用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀； 于離心機(jī)中12000rpm，離心5min，輕輕吸除上清；用fix buffer配制在MOnm處OD (光密度)值為0. 5 1. 0的膠體金免疫復(fù)合物；在玻璃纖維素膜上點(diǎn)樣，形成膠金墊，真空凍干 3小時(shí)。4.膠體金試紙條的組裝分別將1. Omg/mL和0. 25mg/mL的cTnl單克隆抗體2劃在硝酸纖維素膜的檢測線 (T線)上，將2. Omg/mL羊抗鼠多克隆抗體劃在質(zhì)控線(C線)上。然后將硝酸纖維素膜置于烘箱中40°C干燥3天。然后將各個(gè)部分按附圖1組裝成試紙條。5.膠體金試紙條的使用及結(jié)果判讀檢測前，先提取被檢者的血清樣本。然后把試紙條試紙平放，將樣品加到檢測條的樣本墊上，由于毛細(xì)效應(yīng)，液體的層析方向向前，與固定在T線、C線上的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合被截留而顯色。5min后，根據(jù)T線、C線的顯色情況判定陰陽性結(jié)果。C線與靠近C線的檢測帶出現(xiàn)紅色為樣本中cTnl水平大于 lng/mL(見附圖2)，C線與兩條檢測帶都出現(xiàn)紅色為樣本中cTnl水平大于5ng/mL(見附圖 3)，只有C線出現(xiàn)紅色的為陰性(見附圖4)，T線和C線均不顯色則試紙條無效。實(shí)施例可直接檢測樣品中的cTnl，使用方法不需要專業(yè)培訓(xùn)，操作方便、快速， 5min即可獲得結(jié)果，可達(dá)到快速、簡便、及時(shí)地檢測cTnl的目的。
權(quán)利要求
1.一種用雙指示線免疫層析半定量診斷心肌肌鈣蛋白I的方法，其特征在于，采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記抗CTnI單克隆抗體1并均勻涂布于膠體金墊上，作為示蹤標(biāo)記物。在硝酸纖維素膜上，兩個(gè)不同濃度的cTnl單克隆抗體2固定于兩個(gè)檢測線 (即T線)，羊抗鼠二抗固定于質(zhì)控線(即C線)。依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙并裝入檢測卡中。金標(biāo)抗體與相應(yīng)的抗原、抗體發(fā)生特異性結(jié)合被截留而顯色，根據(jù)T線、C線顯色與否來判斷陰陽性結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用雙指示線免疫層析半定量診斷心肌肌鈣蛋白I的方法，其特征在于，抗體劃線濃度為Tl線用濃度為1. Omg/mL的cTnl單克隆抗體2劃線，用于檢出Ing/mL的cTnl ； T2線用濃度為0. 25mg/mL的cTnl單克隆抗體2劃線，用于檢出5ng/mL的cTnl ； C線用2. Omg/mL羊抗鼠多克隆載體劃線； 將硝酸纖維素膜置于40°C烘箱干燥3天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用雙指示線免疫層析半定量診斷心肌肌鈣蛋白I的方法，其特征在于，運(yùn)用不同濃度的抗體溶液在相同的基質(zhì)上劃線，以膠體金方法檢測多個(gè)不同濃度水平物質(zhì)的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測方法，具體是一種用雙指示線免疫層析半定量診斷心肌肌鈣蛋白I的方法。急性心肌梗塞(acute myocardial infarction，AMI)是冠心病中的一個(gè)非常嚴(yán)重的類型，是中老年人的常見急癥，死亡率較高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有1/3-1/2的患者在送至醫(yī)院之前死亡。在今后20年內(nèi)，急性心肌梗塞將是全世界范圍內(nèi)患者死亡的頭號(hào)病因。心肌肌鈣蛋白I是目前公認(rèn)的、特異性最高且持續(xù)時(shí)間最長的診斷心梗的可靠指標(biāo)，目前，臨床上常用的cTnI檢測的方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和放射性免疫法等方法，上述方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、不利于普及而且費(fèi)用昂貴。免疫膠體金技術(shù)近年來發(fā)展迅速，得到了廣泛應(yīng)用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測。本發(fā)明采用膠體金免疫層析法，建立快速檢測cTnI的方法。并且能夠半定量檢測1ng/mL～5ng/mL這一cTnI灰區(qū)范圍。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102565417SQ201110433728
公開日2012年7月11日 申請(qǐng)日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者劉寅, 岳曉燕, 張有青, 王晶, 羅云萍, 霍五奎, 馬雪明 申請(qǐng)人:正元盛邦(天津)生物科技有限公司