專(zhuān)利名稱(chēng)：用雙指示線(xiàn)免疫層析半定量診斷肌酸激酶同工酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)方法，具體是一種用雙指示線(xiàn)免疫層析半定量診斷肌酸激酶同工酶的方法。
背景技術(shù)：
隨著我國(guó)人民生活水平的提高，高血脂、高血壓、冠心病的發(fā)病率也明顯增高。急性心肌梗塞(acute myocardial infarction, AMI)是冠心病中的一個(gè)非常嚴(yán)重的類(lèi)型，為冠狀動(dòng)脈閉塞、血流中斷，使部分心肌因嚴(yán)重而持久的缺血發(fā)生局部壞死，從而導(dǎo)致心臟功能的嚴(yán)重?fù)p害，死亡率較高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有1/3-1/2的患者在送至醫(yī)院之前死亡。急性心肌梗塞在歐美多見(jiàn)，我國(guó)相對(duì)較少，且北京、天津華北地區(qū)較華南、華東稍多。在今后20年內(nèi)， 急性心肌梗塞將是全世界范圍內(nèi)患者死亡的頭號(hào)病因。
急性心肌梗塞是中老年人的常見(jiàn)急癥，如果能夠早期診斷，對(duì)降低病死率有重要意義。其在急性期死亡率較高，尤其在發(fā)病早期。如果在癥狀發(fā)生后的頭1-2小時(shí)內(nèi)處理得及時(shí)和正確，就有可能使患者脫離危險(xiǎn)。對(duì)疑似急性心肌梗塞的病人，要及時(shí)做心電圖檢查，并注意追隨觀察和對(duì)比如果能作白細(xì)胞計(jì)數(shù)和分類(lèi)、血沉、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、肌酸磷酸激酶等檢查，對(duì)早期診斷急性心肌梗塞更為有益。
肌酸激酶同工酶(CK-MB)，屬于特異性較強(qiáng)的一種心肌標(biāo)志物，肌酸激酶具有3種同工酶，它們分別是CK-MM(肌肉型)，CK-BB (腦型)及CK-MB (心肌型)。在正常人的血清中的肌酸激酶幾乎都是CK-MM，而CK-MB出現(xiàn)在心肌組織，約占15 20%。人體各組織(除腓腸肌外)，只有心肌含有較高的CK-MB，故此同工酶對(duì)診斷心肌梗塞的特異性可高達(dá)100%， 因此CK-MB是至今為止診斷心肌梗塞最佳的血清酶指標(biāo)。急性心肌梗塞后6小時(shí)升高致正常上限2倍，M小時(shí)達(dá)峰值，36小時(shí)降致基線(xiàn)，心梗發(fā)生時(shí)，血清CK-MB可增高10 25倍， 超過(guò)CK總活力增高的倍數(shù)10 12倍。在患有某些其他疾病的情況下，如肌肉疾病、中毒性休克、創(chuàng)傷，腦血管意外、甲狀腺功能低下等，也有會(huì)在血清當(dāng)中檢出CK-MB，不過(guò)在這些非心肌梗塞疾病中，血清CK-MB占總CK的百分比平均為2. 5 7. 5% (正常人< 2% )，均低于心梗的7. 5 19. 5%。在急性心肌梗塞發(fā)生時(shí)，肌酸激酶會(huì)從受損的心肌細(xì)胞里釋放，導(dǎo)致CK-MB在急性心肌梗塞的病人血清中明顯升高。通常在心肌梗塞12 M小時(shí)達(dá)高峰， 并且在48 72小時(shí)恢復(fù)正常。借助CK-MB的檢測(cè)，可檢出病人CK-MB的活性，對(duì)于提供臨床醫(yī)師早期診斷心肌梗塞是非常有價(jià)值。
急性心肌梗塞診斷方法主要有診斷根據(jù)典型的臨床表現(xiàn)，特征性的心電圖改變以及實(shí)驗(yàn)室檢查進(jìn)行診斷。心電圖上的ST段抬高和Q波出現(xiàn)是兩個(gè)高度提示急性心肌梗塞的變化，然而僅僅大約一半的急性心肌梗塞病例就診時(shí)有這些心電圖的改變，大約1/4的急性心肌梗塞病人缺乏典型的胸痛，只有恰巧在貼近梗死發(fā)生時(shí)記錄心電圖，或者在以后的檢查中發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期存在的病理性Q波才可能發(fā)覺(jué)。因胸痛懷疑心肌梗塞去急診在最后肯定是急性心肌梗塞的病人中，有一半是在最初的心電圖檢查中得不出急性心肌梗塞的診斷， 因此對(duì)大部分病人而言，臨床醫(yī)師必須通過(guò)定時(shí)地測(cè)定心臟標(biāo)記物來(lái)肯定或否定急性心肌3梗塞的診斷。而在各種心肌標(biāo)志物中，CK-MB是臨床醫(yī)生最信賴(lài)的AMI檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”，特異性較高。目前，臨床上常用的CK-MB檢測(cè)的方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)和放射性免疫法，上述方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、不利于普及而且費(fèi)用昂貴。開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速的急性心肌梗塞診斷方法具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)意義。
免疫膠體金技術(shù)是20世紀(jì)70年代初期由Faulk和Taylor始創(chuàng)，最初用于免疫電鏡技術(shù)。膠體金標(biāo)記技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物或顯色劑，于抗原抗體反應(yīng)的一種新型免疫標(biāo)記技術(shù)，現(xiàn)在已成功用于電鏡、流式細(xì)胞儀、免疫印跡、蛋白染色、體外診斷制劑的制造等領(lǐng)域。目前金標(biāo)記技術(shù)常與膜載體配合，形成特定的免疫檢測(cè)方式，如免疫滲濾試驗(yàn)和免疫層析試驗(yàn)等。免疫層析試紙條就是此技術(shù)用于體外快速診斷的一個(gè)重要發(fā)展方向， 是在現(xiàn)代單克隆抗體技術(shù)、膠體金免疫層析技術(shù)和新材料技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的新型檢測(cè)技術(shù)。近年來(lái)該技術(shù)發(fā)展迅速，已經(jīng)在臨床診斷特別是床邊檢測(cè)(POCT)中得到了廣泛應(yīng)用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測(cè)。
利用膠體金的檢測(cè)方法測(cè)定血清中CK-MB作為急性心肌梗塞的診斷，已被開(kāi)發(fā)， 其檢測(cè)下限為5ng/mL。但是對(duì)于臨床上單獨(dú)使用5ng/mL這一標(biāo)準(zhǔn)不能直接、快速區(qū)分急性心肌梗塞嚴(yán)重程度，所以開(kāi)發(fā)能夠檢測(cè)CK-MB 5 lOng/mL這一 CK-MB診斷灰區(qū)的半定量膠體金試紙也是十分必要的。目前國(guó)內(nèi)外均無(wú)相關(guān)的試紙條出售。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、快速的急性心肌梗塞診斷方法具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和社會(huì)價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)采用膠體金免疫層析法，建立快速檢測(cè)CK-MB的方法。并且能夠半定量檢測(cè)5ng/mL 10ng/mL這一 CK-MB灰區(qū)范圍。
本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記抗CK-MB單克隆抗體1并均勻涂布于膠金墊上，作為示蹤標(biāo)記物。在硝酸纖維素膜上，兩個(gè)不同濃度的CK-MB單克隆抗體2固定于兩個(gè)檢測(cè)線(xiàn)(即T線(xiàn))，羊抗鼠二抗固定于質(zhì)控線(xiàn) (即C線(xiàn))。依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙并裝入檢測(cè)卡中。金標(biāo)抗體與相應(yīng)的抗原、抗體發(fā)生特異性結(jié)合被截留而顯色，根據(jù)T線(xiàn)、C線(xiàn)顯色與否來(lái)判斷陰陽(yáng)性結(jié)果。
本發(fā)明方法包括如下步驟
一、膠體金溶液配制
1.配制氯金酸溶液；
2.配制2%檸檬酸三鈉溶液；
3.將0. 02%的氯金酸溶液加熱至沸騰，迅速加入2%的檸檬酸三鈉2mL ；
4.溶液由淺藍(lán)色，深藍(lán)，再加熱出現(xiàn)酒紅色，繼續(xù)煮沸IOmin ；
停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫。
二、膠體金標(biāo)記物的制備
1.取兩個(gè)1. 5mL試管，分別加入ImL膠體金溶液；
2.加入適量硼砂緩沖液把pH調(diào)整為8. 0 ；
3.加入20 μ g/mLCK-MB單克隆抗體1，使其達(dá)到最小蛋白濃度，混勻，振蕩30min ；
4.加入 20 μ L 的 10 % BSA,混勻，振蕩 30min ；CN 102539769 A
5. 12000rpm離心5min，輕輕吸除上清；
6.用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；
7.重復(fù)5.步操作；
8.重復(fù)6.步操作；
9.重復(fù)5.步操作；
10.用fix buffer配制在540nm處OD (光密度)值為0. 5 1. 0的膠體金免疫復(fù)合物；
11.玻璃纖維素膜點(diǎn)樣，形成膠金墊，真空凍干3小時(shí)。
三、在硝酸纖維素膜上劃線(xiàn)
1. Tl線(xiàn)用濃度為1. Omg/mL的CK-MB單克隆抗體2劃線(xiàn)，用于檢出5ng/mL的 CK-MB ；
2. T2線(xiàn)用濃度為0. 6mg/mL的CK-MB單克隆抗體2劃線(xiàn)，用于檢出lOng/mL的 CK-MB ；
3. C線(xiàn)用2. Omg/mL羊抗鼠多克隆抗體劃線(xiàn)；
4.將硝酸纖維素膜置于40°C烘箱干燥3天。
四、膠體金試紙條的組裝
1.將樣品墊、膠金墊、NC膜和吸收墊4部分按順序組裝(見(jiàn)附圖1)；
2.將其組裝好后用剪刀剪成4mm/條后進(jìn)行檢測(cè)。
五、檢測(cè)
試紙平放，將樣品加到檢測(cè)條的樣本墊上，由于毛細(xì)效應(yīng)，液體的層析方向向前， 與固定在τ線(xiàn)、C線(xiàn)上的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合被截留而顯色。5min后，根據(jù)T線(xiàn)、C線(xiàn)的顯色情況判定陰陽(yáng)性結(jié)果。C線(xiàn)與靠近C線(xiàn)的檢測(cè)帶出現(xiàn)紅色為樣本中CK-MB水平大于5ng/mL(見(jiàn)附圖2)，C線(xiàn)與兩條檢測(cè)帶都出現(xiàn)紅色為樣本中CK-MB水平大于10ng/mL(見(jiàn)附圖3)，只有 C線(xiàn)出現(xiàn)紅色的為陰性(見(jiàn)附圖4)，T線(xiàn)和C線(xiàn)均不顯色則試紙條無(wú)效。
本發(fā)明檢測(cè)對(duì)象單一且針對(duì)性強(qiáng)，準(zhǔn)確率高。檢測(cè)速度快，所需時(shí)間短，只需5min， 不需經(jīng)培訓(xùn)的專(zhuān)業(yè)人員就可使用本發(fā)明方法來(lái)檢測(cè)，滿(mǎn)足醫(yī)院、門(mén)診等部門(mén)快速、準(zhǔn)確地診斷心肌梗塞的要求，并且便于基層推廣和運(yùn)用。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例試紙條的圖示
圖2為本發(fā)明實(shí)施例試紙條的陽(yáng)性結(jié)果(CK-MB水平大于5ng/mL)
圖3為本發(fā)明實(shí)施例試紙條的陽(yáng)性結(jié)果(CK-MB水平大于lOng/mL)
圖4為本發(fā)明實(shí)施例試紙條的陰性結(jié)果具體實(shí)施方式
下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說(shuō)明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和具體的操作過(guò)程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。
下面實(shí)施例中，未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。
本實(shí)例先用2%的檸檬酸三鈉溶液制備20nm的金水，并標(biāo)記CK-MB單克隆抗體 1噴金標(biāo)墊，CK-MB單克隆抗體2、羊抗鼠多克隆抗體分別包被至檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))、質(zhì)控線(xiàn)(C 線(xiàn))，然后組裝成試紙條，置37°C烘箱烘干并裁成4mm/條，室溫干燥保存?zhèn)溆谩?br> 實(shí)施例
1.準(zhǔn)備CK-MB單克隆抗體1和2。并清洗實(shí)驗(yàn)所需的玻璃器皿。
2.膠體金的制備
先將0. 02 %氯金酸溶液溶液加熱煮沸，迅速加入2 %的檸檬酸三鈉2mL ；
溶液顏色由淺藍(lán)色變?yōu)樯钏{(lán)，繼續(xù)加熱出現(xiàn)酒紅色，繼續(xù)煮沸IOmin ；出現(xiàn)透明的酒紅色，停止加熱，繼續(xù)攪拌至室溫。這樣就制備了 20nm的膠體金溶液。然后用電鏡鏡檢， 確保制備的金顆粒盡量使其大小一致、均勻，顆粒直徑在20nm左右，否則重新制作。
3.膠體金標(biāo)記物的制備
取兩個(gè)1. 5mL試管，分別加入ImL膠體金溶液；向其中加入適量硼砂緩沖液把pH 調(diào)整為8. 0 ；加入20μ g/mL CK-MB單克隆抗體1，使其達(dá)到最小蛋白濃度，混勻，于振蕩儀上快速振蕩30min ；加入20 μ L的10% BSA,混勻，振蕩30min ；于離心機(jī)中12000rpm，離心5min，輕輕吸除上清；用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀；于離心機(jī)中 12000rpm，離心5min，輕輕吸除上清；用ImL wash buffer溶液重懸浮松散的膠體金沉淀； 于離心機(jī)中12000rpm，離心5min，輕輕吸除上清；用fix buffer配制在MOnm處OD (光密度)值為0. 5 1. 0的膠體金免疫復(fù)合物；在玻璃纖維素膜上點(diǎn)樣，形成膠金墊，真空凍干 3小時(shí)。
4.膠體金試紙條的組裝
分別將1. Omg/mL和0. 6mg/mL的CK-MB單克隆抗體2劃在硝酸纖維素膜的檢測(cè)線(xiàn) (T線(xiàn))上，將2. Omg/mL羊抗鼠多克隆抗體劃在質(zhì)控線(xiàn)(C線(xiàn))上。然后將硝酸纖維素膜置于烘箱中40°C干燥3天。然后將各個(gè)部分按附圖1組裝成試紙條。
5.膠體金試紙條的使用及結(jié)果判讀
檢測(cè)前，先提取被檢者的血清樣本。
然后把試紙條試紙平放，將樣品加到檢測(cè)條的樣本墊上，由于毛細(xì)效應(yīng)，液體的層析方向向前，與固定在τ線(xiàn)、C線(xiàn)上的物質(zhì)發(fā)生結(jié)合被截留而顯色。5min后，根據(jù)T線(xiàn)、C線(xiàn)的顯色情況判定陰陽(yáng)性結(jié)果。C線(xiàn)與靠近C線(xiàn)的檢測(cè)帶出現(xiàn)紅色為樣本中CK-MB水平大于 5ng/mL(見(jiàn)附圖2)，C線(xiàn)與兩條檢測(cè)帶都出現(xiàn)紅色為樣本中CK-MB水平大于lOng/mL(見(jiàn)附圖3)，只有C線(xiàn)出現(xiàn)紅色的為陰性(見(jiàn)附圖4)，T線(xiàn)和C線(xiàn)均不顯色則試紙條無(wú)效。
實(shí)施例可直接檢測(cè)樣品中的CK-MB，使用方法不需要專(zhuān)業(yè)培訓(xùn)，操作方便、快速， 5min即可獲得結(jié)果，可達(dá)到快速、簡(jiǎn)便、及時(shí)地檢測(cè)CK-MB的目的。
權(quán)利要求
1.一種用雙指示線(xiàn)免疫層析半定量診斷肌酸激酶同工酶的方法，其特征在于，采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，標(biāo)記抗CK-MB單克隆抗體1并均勻涂布于膠體金墊上，作為示蹤標(biāo)記物。在硝酸纖維素膜上，兩個(gè)不同濃度的CK-MB單克隆抗體2固定于兩個(gè)檢測(cè)線(xiàn)(即T線(xiàn))，羊抗鼠二抗固定于質(zhì)控線(xiàn)(即C線(xiàn))。依次將樣本墊、膠金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙組裝，剪成膠體金試紙并裝入檢測(cè)卡中。金標(biāo)抗體與相應(yīng)的抗原、抗體發(fā)生特異性結(jié)合被截留而顯色，根據(jù)T線(xiàn)、C線(xiàn)顯色與否來(lái)判斷陰陽(yáng)性結(jié)果。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用雙指示線(xiàn)免疫層析半定量診斷肌酸激酶同工酶的方法，其特征在于，抗體劃線(xiàn)濃度為T(mén)l線(xiàn)用濃度為1. Omg/mL的CK-MB單克隆抗體2劃線(xiàn)，用于檢出5ng/mL的CK-MB ； T2線(xiàn)用濃度為0. 6mg/mL的CK-MB單克隆抗體2劃線(xiàn)，用于檢出lOng/mL的CK-MB ； C線(xiàn)用2. Omg/mL羊抗鼠多克隆載體劃線(xiàn)； 將硝酸纖維素膜置于40°C烘箱干燥3天。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用雙指示線(xiàn)免疫層析半定量診斷肌酸激酶同工酶的方法，其特征在于，運(yùn)用不同濃度的抗體溶液在相同的基質(zhì)上劃線(xiàn)，以膠體金方法檢測(cè)多個(gè)不同濃度水平物質(zhì)的方法。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種生物工程技術(shù)領(lǐng)域的檢測(cè)方法，具體是一種用雙指示線(xiàn)免疫層析半定量診斷肌酸激酶同工酶的方法。急性心肌梗塞(acute myocardial infarction，AMI)是冠心病中的一個(gè)非常嚴(yán)重的類(lèi)型，是中老年人的常見(jiàn)急癥，死亡率較高，據(jù)統(tǒng)計(jì)，約有1/3-1/2的患者在送至醫(yī)院之前死亡。在今后20年內(nèi)，急性心肌梗塞將是全世界范圍內(nèi)患者死亡的頭號(hào)病因。CK-MB是臨床醫(yī)生最信賴(lài)的AMI檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”，特異性較高，目前，臨床上常用的CK-MB檢測(cè)的方法為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和放射性免疫法等方法，上述方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、不利于普及而且費(fèi)用昂貴。免疫膠體金技術(shù)近年來(lái)發(fā)展迅速，得到了廣泛應(yīng)用，如傳染病、早孕、癌癥等的檢測(cè)。本發(fā)明采用膠體金免疫層析法，建立快速檢測(cè)CK-MB的方法。并且能夠半定量檢測(cè)5ng/mL～10ng/mL這一CK-MB灰區(qū)范圍。
文檔編號(hào)G01N33/558GK102539769SQ20111043372
公開(kāi)日2012年7月4日 申請(qǐng)日期2011年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月22日
發(fā)明者劉寅, 岳曉燕, 張有青, 王晶, 羅云萍, 霍五奎, 馬雪明 申請(qǐng)人:正元盛邦(天津)生物科技有限公司