專利名稱：一種半定量檢測人血清中g(shù)fap濃度的膠體金試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種膠體金試紙條，尤其涉及一種半定量檢測人血清中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)濃度的膠體金試紙條。
背景技術(shù)：
流行病學(xué)調(diào)查研究表明，目前腦血管疾病與心臟病、惡性腫瘤構(gòu)成人類疾病死亡的三大原因。與西方發(fā)達國家相比，我國腦血管病的發(fā)病率和死亡率明顯高于心血管病。據(jù)估算，全國每年新發(fā)腦卒中患者約為200萬人；每年死于腦卒中的患者約150萬人；存活患者人數(shù)600萬 700萬；且70% 80%的存活者遺留癱瘓、失語等嚴重殘疾，給社會和家庭帶來沉重負擔(dān)。其中腦出血是一種致死率和致殘率均高的常見病、多發(fā)病，嚴重危害人類特別是老年人的健康，威脅病人的生命，嚴重影響病人生活質(zhì)量。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein，GFAP)是一種分子量為50 52KDa的酸性蛋白，屬細胞骨骼蛋白，是星形細胞胞質(zhì)內(nèi)的特異性蛋白，標志蛋白。 GFAP在星形膠質(zhì)細胞受到刺激引起反應(yīng)時，其表達發(fā)生變化，在星形細胞中有豐富的、唯一的表達。研究發(fā)現(xiàn)GFAP和癡呆、多發(fā)性硬化及腦卒中有明顯相關(guān)性。腦出血后神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞受到損害，大量的胞漿蛋白質(zhì)漏出細胞進入細胞間液，可溶性的GFAP通過細胞間液進入腦脊液，穿過破壞的血腦屏障進入血液循環(huán)。有研究表明腦出血患者發(fā)病6小時內(nèi)血清GFAP水平即明顯升高，而缺血性腦卒中患者6小時內(nèi)血清GFAP水平與正常對照組無明顯差異，因此認為GFAP是急性腦出血的生物學(xué)標志物。此外，還有研究表明，急性腦出血患者血清中的GFAP與腦出血體積之間有著密切的正相關(guān)關(guān)系，因此可以通過腦出血患者血清GFAP水平來判斷患者的病情和預(yù)后。目前，臨床診斷上對GFAP的檢測主要是ELISA實驗方法，該方法因其特異性、靈敏度高而在近二十年來被廣泛應(yīng)用，但同時該方法檢測方法繁瑣，所需檢驗時間較長(1 2 小時)，而且往往需要積攢到一定數(shù)量樣品之后，才能進行檢測，檢測被延誤，而膠體金法則具有很多優(yōu)勢，能夠彌補其不足a)快速全部檢測過程僅需5-10分鐘，大大縮短了檢測時間。b)簡便不需其它任何儀器設(shè)備，操作也極其簡單，可隨時隨地進行。c)檢測結(jié)果直觀。檢測結(jié)果直接用顏色顯示，肉眼判斷容易，不需要特別儀器設(shè)備，只需要試紙條，樣品只要做非常簡單的處理或不需要做前處理。d)可單份檢測對標本既能成批檢測，又可單份檢測，患者可立刻拿到結(jié)果，不必等待。e)穩(wěn)定性好金標試劑穩(wěn)定，不受溫度等外界環(huán)境的影響，可長期保存。然而，檢索結(jié)果表明，利用膠體金法檢測檢測人血清中GFAP濃度的文獻還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種快速半定量檢測人血清中膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)濃度的膠體金試紙條。本發(fā)明所述半定量檢測人血清中GFAP濃度的膠體金試紙條，是在PVC板上粘附檢測膜片、膠體金結(jié)合膜片和吸水紙層制成，其特征在于所述膠體金結(jié)合膜片上包被有膠體金標記的抗-GFAP抗體，所述檢測膜片上設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，其中檢測線上固定有抗-GFAP捕獲抗體，質(zhì)控線上固定有兔抗鼠IgG ；所述試紙條自下而上依次為加樣處、膠體金結(jié)合膜片、檢測線、質(zhì)控線、吸水紙。上述的半定量檢測人血清中GFAP濃度的膠體金試紙條中，所述膠體金標記的抗-GFAP抗體及檢測線上包被的抗-GFAP捕獲抗體為能夠識別不同表位的單克隆抗體。上述的半定量檢測人血清中GFAP濃度的膠體金試紙條中，所述膠體金結(jié)合膜片由玻璃纖維素紙制得，所述檢測膜片由硝酸纖維素膜制得。上述的半定量檢測人血清中GFAP濃度的膠體金試紙條中，所述檢測線可以設(shè)為多條且間隔設(shè)置，優(yōu)選的實施方式是4條且間隔設(shè)置，檢測線上固定的抗-GFAP捕獲抗體的包被量代表了能夠檢出的GFAP濃度，自上而下依次為16ng/ml、8ng/ml3ng/ml、2ng/ml。本發(fā)明所述半定量檢測人血清中GFAP濃度的膠體金試紙條在制備檢測試劑盒中的應(yīng)用，其中所述半定量檢測人血清中GFAP濃度的試劑盒包括以下組分1) 10條單人份檢測卡；檢測卡由試紙條外殼與試紙條構(gòu)成，試紙條由膠體金膜片 (噴有由抗-GFAP單克隆抗體標記的膠體金)、檢測膜片(檢測線包被有抗-GFAP捕獲單克隆抗體，質(zhì)控線包被有兔抗鼠IgG抗體)、吸水紙、襯膜片構(gòu)成；2)說明書一份；3)標準比色卡一張。應(yīng)用上述試劑盒半定量檢測人血清中GFAP濃度的方法，步驟如下(1)將檢測卡放置在干凈的水平臺面上，水平放置并作好標記。(2)用移液器吸取120 μ 1樣本，垂直滴加在加樣處。(3)等待檢測線處紫紅色條帶出現(xiàn)，用目測參考標準比色卡進行半定量判讀。本發(fā)明所述膠體金檢測試紙條進行半定量檢測人血清中GFAP濃度的原理是用膠體金標記抗-GFAP單克隆抗體，將該膠體金標記物包被在膠體金結(jié)合膜片上；在檢測膜片的檢測線上包被一定量的抗-GFAP捕獲單克隆抗體。當(dāng)待檢血清加到膠體金結(jié)合膜片后，血清中的GFAP與膠體金上的抗-GFAP抗體結(jié)合，該膠體金標記復(fù)合物泳動到檢測線時， GFAP蛋白會被檢測線上的抗-GFAP捕獲單克隆抗體所捕獲，膠體金聚集在檢測線上而顯色；如果待測血清中的GFAP濃度低不足以完全結(jié)合檢測線上的的抗GFAP捕獲抗體時，檢測線聚集的膠體金數(shù)量少或者未聚集膠體金，就會顯色淺或者不顯色。顯色條帶越多，條帶顏色越深，說明待測血清中的GFAP蛋白濃度越高，因此可以根據(jù)條帶的多少判定待測血清中 GFAP的含量。當(dāng)顯示5條帶時，說明滴加的一定體積的血清中的GFAP量使檢測膜片上抗體的結(jié)合位點飽和，這時，需要對血清進行稀釋，再進行檢測，而待測血清中GFAP的濃度在檢測線所代表的濃度乘以稀釋倍數(shù)即為所測得的濃度，即實現(xiàn)了對待測血清進行半定量檢測。本發(fā)明實現(xiàn)了便捷、快速、經(jīng)濟、簡單的半定量檢測血清中GFAP濃度的目的。本發(fā)明進一步優(yōu)選在檢測膜片上設(shè)置多條檢測檢測線。膠體金膜片上的距離由近到遠，檢測線顯示陽性時所代表的GFAP濃度依次增加?？筛鶕?jù)檢測線顯色的多少和位置， 判斷待測血清中GFAP的濃度范圍。本發(fā)明包被在膠體金膜片上的抗體及固定在檢測線上的抗GFAP捕獲抗體均為單克隆抗體，以盡量減少檢測過程中的交叉反應(yīng)的干擾，以提高試紙條檢測的準確性。本發(fā)明進一步優(yōu)化在檢測膜片上設(shè)置質(zhì)控線，所述質(zhì)控線上包被有羊抗鼠IgGJt為監(jiān)測試紙條有效性及試劑污染的依據(jù)。本發(fā)明檢測試紙條將膜反應(yīng)體系貼附在尺寸相應(yīng)的PVC板條上，節(jié)約成本，而又不影響檢測結(jié)果。綜上，本發(fā)明對血清中GFAP進行檢測時，可以簡便快速、準確有效的對GFAP進行半定量檢測，具有高特異性、高靈敏度、操作快速簡便、費用低廉、不需要任何儀器、省時省力等特點。


圖1本發(fā)明膠體金試紙條膜反應(yīng)層反應(yīng)體系結(jié)構(gòu)示意圖；其中1 吸水紙；2 質(zhì)控線；3 檢測線；3a 檢測濃度為16ng/ml ；3b 檢測濃度為 8ng/ml ；3c 檢測濃度為^g/ml ；3d 檢測濃度為2ng/ml ；4 膠體金結(jié)合膜片；5 加樣處。圖加本發(fā)明檢測結(jié)果解讀示意圖——表示GFAP濃度小于2ng/ml ；圖2b本發(fā)明檢測結(jié)果解讀示意圖——表示GFAP濃度在于2ng/ml ^g/ml ；圖2c本發(fā)明檢測結(jié)果解讀示意圖——表示GFAP濃度在于^g/ml 8ng/ml ；圖2d本發(fā)明檢測結(jié)果解讀示意圖——表示GFAP濃度在于8ng/ml 16ng/ml ；圖加本發(fā)明檢測結(jié)果解讀示意圖——表示GFAP濃度大于16ng/ml，應(yīng)稀釋后再檢測。
具體實施例方式實施例1步驟一檢測膜片的制備用PBS緩沖液將抗-GFAP捕獲單克隆抗體稀釋到四個不同的濃度，由高到低分別用點膜儀點在硝酸纖維素膜上，每條線點20 μ 1，線寬1 1. 5mm，線間距5mm。其被量代表能夠檢出2ng/ml3ng/ml、8ng/ml、16ng/ml。同樣方法，在檢測線后用點膜儀點上200 μ g/ ml的羊抗鼠IgG作為質(zhì)控線，線寬1 1. 5mm，距最近檢測線8mm。用含BSA的PBS緩沖液進行封閉2小時，室溫陰干，4°C保存。步驟二膠體金結(jié)合膜片的制備1)抗-GFAP 抗體單克隆抗體購自 Santa Cruz Biotechnology。2)抗-GFAP抗體-膠體金復(fù)合物的制備采用檸檬酸三鈉還原法制備直徑為20nm膠體金。用純化水將1 %氯金酸稀釋成 0.01%，在磁力攪拌器上加熱攪拌煮沸，每IOOml 0.01%氯金酸加入&11 檸檬酸三鈉， 繼續(xù)煮沸至液體呈紅色時加熱停止，冷卻至室溫，加水至原體積。膠體金標記GFAP抗體。在磁力攪拌器上用0. IM的碳酸鉀緩沖液調(diào)膠體金至 PH9. 0，按照1 3 μ g/ml膠體金加入抗-GFAP單克隆抗體，繼續(xù)攪拌lOmin，加入BSA作為穩(wěn)定劑，至終濃度為1%，靜置1小時。將上述溶液4°C下，3000r/min低速離心40min，小心吸取上清，棄去沉淀；上清再以12000r/min 4°C高速離心30min，棄上清，用0. 01M、pH7. 2 的PBS緩沖液(內(nèi)含BSA、0. 04疊氮化鈉)溶解沉淀至原體積，充分穩(wěn)定后過夜。再以 12000r/min 4°C高速離心30min，棄上清，用0. 01M、ρΗ7· 2的PBS緩沖液(內(nèi)含1% BSA、0. 04疊氮化鈉)溶解沉淀至原體積的1/5，4°C儲存?zhèn)溆谩?)膠體金-抗GFAP抗體復(fù)合物使用0. IM pH9. 0的碳酸鉀緩沖液稀釋至設(shè)定濃度，用噴涂設(shè)備涂至玻璃纖維素紙上，然后真空干燥，即得膠體金結(jié)合膜片。4)試紙條的組裝在PVC板上由下而上依次粘附檢測膜片、膠體金結(jié)合膜片，最上一層是吸水層，由 3 5層濾紙組成，外面用膠帶封住，成為手持部分。將以上組裝好的材料切成3mm寬的小條，即制得本發(fā)明所述半定量檢測人血清中 GFAP濃度的膠體金試紙條。實施例2半定量檢測人血清中GFAP濃度的膠體金試紙條的應(yīng)用(1)用試紙條檢測人血清中GFAP濃度用移液器吸取120 μ 1血清樣本，垂直滴加在膠體金試紙條的加樣處。開始計時， 等待紅色條帶出現(xiàn)，10分鐘內(nèi)與標準比色卡比對，超過20分鐘，結(jié)果無效。(2)結(jié)果解釋本膠體金試紙條中自上而下所涉及的四個濃度梯度標志線(即檢測線)為16ng/ ml、8ng/ml3ng/ml、2ng/ml。檢測結(jié)果解釋如下當(dāng)僅出現(xiàn)質(zhì)控線一條線時，說明GFAP濃度小于2ng/ml。當(dāng)出現(xiàn)含質(zhì)控線的二條線時，說明GFAP濃度在2ng/ml ^g/ml。當(dāng)出現(xiàn)含質(zhì)控線的三條線時，說明GFAP濃度在^g/ml 8ng/ml。當(dāng)出現(xiàn)含質(zhì)控線的四條線時，說明GFAP濃度在8ng/ml 16ng/ml。當(dāng)出現(xiàn)含質(zhì)控線的五條線時，說明GFAP濃度大于16ng/ml，應(yīng)稀釋后再測量。
權(quán)利要求
1.一種半定量檢測人血清中GFAP濃度的膠體金試紙條，是在PVC板上粘附檢測膜片、 膠體金結(jié)合膜片和吸水紙層制成，其特征在于所述膠體金結(jié)合膜片上包被有膠體金標記的抗-GFAP抗體，所述檢測膜片上設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，其中檢測線上固定有抗-GFAP捕獲抗體，質(zhì)控線上固定有兔抗鼠IgG;所述試紙條自下而上依次為加樣處、膠體金結(jié)合膜片、 檢測線、質(zhì)控線、吸水紙。
2.如權(quán)利要求1所述的半定量檢測人血清中GFAP濃度的膠體金試紙條，其特征在于， 所述膠體金標記的抗-GFAP抗體及檢測線上包被的抗-GFAP捕獲抗體為能夠識別不同表位的單克隆抗體。
3.如權(quán)利要求1所述的半定量檢測人血清中GFAP濃度的膠體金試紙條，其特征在于， 所述膠體金結(jié)合膜片由玻璃纖維素紙制得，所述檢測膜片由硝酸纖維素膜制得。
4.如權(quán)利要求1所述的半定量檢測人血清中GFAP濃度的膠體金試紙條，其特征在于， 所述檢測線為4條且間隔設(shè)置，檢測線上固定的抗-GFAP捕獲抗體的包被量代表能夠檢出的GFAP的濃度，自上而下依次為16ng/ml、8ng/ml3ng/ml、aig/ml。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種半定量檢測人血清中GFAP濃度的膠體金試紙條，是在PVC板上粘附檢測膜片、膠體金結(jié)合膜片和吸水紙層制成，其中所述膠體金結(jié)合膜片上包被有膠體金標記的抗-GFAP抗體，所述檢測膜片上設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，檢測線上固定有抗-GFAP捕獲抗體，質(zhì)控線上固定有兔抗鼠IgG；所述試紙條自下而上依次為加樣處、膠體金結(jié)合膜片、檢測線、質(zhì)控線、吸水紙。本發(fā)明試紙條對GFAP進行半定量檢測，具有高特異性、高靈敏度、高準確性，操作快速簡便、費用低廉、不需要任何儀器、省時省力等優(yōu)勢，應(yīng)用前景良好。
文檔編號G01N33/577GK102353787SQ201110295520
公開日2012年2月15日 申請日期2011年9月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年9月27日
發(fā)明者丁興龍, 張增麗, 朱之煒, 李夫東, 江長林, 王佳穎, 王恒, 王紅, 鄭祖惠, 韓娟 申請人:山東萊博生物科技有限公司