抗人β2微球蛋白的血液凈化吸附劑及其制備方法和用圖
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種新的抗人β2微球蛋白的血液凈化吸附劑、其制備方法和用途。本發(fā)明是利用環(huán)氧活化瓊脂糖凝膠，通過(guò)在瓊脂糖凝膠表面定向固載單域抗體，具體以瓊脂糖凝膠微球Sepharose CL?6B作為載體，經(jīng)過(guò)環(huán)氧活化后偶聯(lián)單域抗體制備成吸附劑。本發(fā)明提供的吸附劑對(duì)β2微球蛋白具有很高的結(jié)合能力，可應(yīng)用于血液凈化及β2微球蛋白領(lǐng)域，可以有效地避免非特異性吸附，在促進(jìn)和改善對(duì)透析相關(guān)淀粉樣變等疾病的診斷和治療等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景。
【專利說(shuō)明】
抗人跤微球蛋白的血液凈化吸附劑及其制備方法和用途
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種新穎的醫(yī)用吸附劑，特別是適用于 血液灌流清除體內(nèi)02微球蛋白的吸附劑其制備方法和用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 02微球蛋白是由淋巴細(xì)胞、血小板、多形核白細(xì)胞產(chǎn)生的一種小分子球蛋白，分子 質(zhì)量為11.8kDa，它是細(xì)胞表面人類淋巴細(xì)胞抗原(HLA)的齡連(輕鏈)部分(為一條單鏈多 肽），廣泛存在于血漿、尿液、腦脊液、唾液以及初乳中，含量很低。在健康人中02微球蛋白以 相對(duì)穩(wěn)定的速率合成，其血清中02微球蛋白濃度與排泄率和合成速度兩者相關(guān)，健康人群 其血清濃度相對(duì)穩(wěn)定，一般為 1 ? 5~3mg/l (Driieke et ? al，Progress In Uremic Toxin Research:Beta2_Microglobulin，Seminars in dialysis,ffiley Online Library，2009， pp. 378-380.)。在健康人體內(nèi)02微球蛋白合成的速率大約為2.4mg/kg/cL02微球蛋白可以 從腎小球自由濾過(guò)，99.9%在近端腎小管吸收，并在腎小管上皮細(xì)胞中分解破壞。某些疾病 情況下能使02微球蛋白的合成增加。在晚期腎病病人的血清中其含量可以達(dá)到20~50mg/ 1，有時(shí)甚至?xí)哌_(dá)l〇〇mg/l。
[0003] 02微球蛋白在體液內(nèi)的濃度增高會(huì)導(dǎo)致透析相關(guān)性淀粉樣變。1986年，Gejyo等發(fā) 現(xiàn)腕管綜合征患者局部有K微球蛋白的沉淀，被稱為02微球蛋白相關(guān)的淀粉樣變[Gejyo F et.al:Serum levels of 02-microglobylin as a new form of amyloid protein in patients undergoing long-term hemodialysis.The New England Journal of Medicine 1986 3 14:585~586]。其發(fā)病原因是由于血中02微球蛋白的水平升高，部分02 微球蛋白的裂解產(chǎn)物提高了剩余02微球蛋白的疏水性，導(dǎo)致剩余02微球蛋白分子聚集，繼 而在各種組織中沉淀下來(lái)，以大關(guān)節(jié)的滑膜組織為主。另外，糖基化產(chǎn)物(AGE)對(duì)02微球蛋 白的修飾作用也被認(rèn)為是02微球蛋白沉淀的重要原因。因此，血液中02微球蛋白去除的抗 體在研究及醫(yī)療領(lǐng)域均具有重要意義。
[0004] 血液凈化去除02微球蛋白的方法有透析、透析濾過(guò)、全血灌流等方法。使用普通血 液透析的方法對(duì)的去除效果并不是十分理想，因?yàn)檠和肝鲋饕峭ㄟ^(guò)擴(kuò)散方式清除溶 質(zhì)，對(duì)02微球蛋白這種中分子物質(zhì)的去除效果不明顯，甚至有研究表明經(jīng)過(guò)透析后尿毒癥 患者體內(nèi)的02微球蛋白水平甚至?xí)猩叩默F(xiàn)象[Ameer,Modalities for the Removal of 02-Microglobulin from Blood，Seminars in dialysis，Wiley Online Library, 2001，pp. 103-106]。透析濾過(guò)通過(guò)擴(kuò)散與對(duì)流方式相結(jié)合去除02微球蛋白去除效果略好于 透析[Ritz E，Bommer J，Bete-2_microglob]ilin derived amyloid problems and perspectives，Blood purify，1988;6(2): 61~68]。血液灌流是將患者的血液引出體外并 經(jīng)過(guò)裝有02微球蛋白吸附劑血液灌流器，清除02微球蛋白，達(dá)到血液凈化目的。血液灌流方 法中使用的配基有疏水性配基[Furuyoshi S，et.al，New Adsorption Column(Lixelle)to Eliminate(02-Microglobulin for Direct Hemoperfusion.Therapeutic Apheresis 2 (1998)13-17.]和親和配基兩種。疏水性配基結(jié)合體積排阻的方法雖然能夠有效清除02微 球蛋白，但存在著選擇性不高的缺點(diǎn)。血液灌流中使用的親和配基有IgG[Mogi M，et.al， Selective removal of 02-microglobulin from human plasma by high-performance immune affinity chromatography.Journal of Chromatography B:Biomedical Sciences and Applications 496(1989)194-200]和單鏈可變區(qū)抗體（scFv)兩種 [Guillermo A.Ameer G,A novel immune adsorption device for removing b2~ microglobylin from whole blood,Kidney International，Vol?59，2001，1544~1550]〇 單鏈可變區(qū)抗體是利用噬菌體表面展示技術(shù)制備的小分子抗體片段，它沒(méi)有完整抗體的Fc 段，只包含VH和VL片段以及中間的連接肽。scFv與IgG相比，具有分子小、免疫原性低、穿透 力強(qiáng)，單位體積固載密度高、易于表達(dá)和生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)。如果能夠在scFv的基礎(chǔ)上進(jìn)一步縮小 所使用的抗體分子大小，則可以提高抗體配基對(duì)K微球蛋白的去除效果。
[0005] 近年來(lái)，在對(duì)駱駝科動(dòng)物的研究中發(fā)現(xiàn)，雙峰駝、單峰駝、羊駝和美洲駝中存在一 種天然缺少輕鏈，僅由重鏈組成、但具有完整功能的抗體，稱為重鏈抗體(heavy chain antibody，hcAb)，其可變區(qū)仍具有很好的抗原識(shí)別和結(jié)合能力，與抗原結(jié)合的親和力和常 規(guī)抗體相當(dāng)。重鏈抗體的可變區(qū)（variable domains of the hcAb，簡(jiǎn)稱為VHH)，分子量為 15kDa，僅為常規(guī)抗體的1/10,是目前可以得到的具有完整抗體功能的最小分子片段，稱為 單域抗體(single domain antibody，sdAb)。更為獨(dú)特的是，胳盤單域抗體的抗原結(jié)合區(qū)僅 由VHH的三個(gè)超變區(qū)（H1~H3)組成，在空間上形成了與常規(guī)抗體典型結(jié)構(gòu)不同的抗原結(jié)合 域。其中H3的平均長(zhǎng)度比常規(guī)抗體長(zhǎng)，在空間上呈突出的指狀結(jié)構(gòu)。因此，單域抗體可以結(jié) 合一些常規(guī)抗體無(wú)法接近的抗原表位。另外，由于在框架區(qū)FR2中有四個(gè)位點(diǎn)被親水性氨基 酸替換，重組的VHH在大腸桿菌中可以獲得高表達(dá)。
[0006] 目前，尚未有以單域抗體為配基血液凈化去除02微球蛋白的報(bào)道，本發(fā)明以單域 抗體為配基，合成了一種K微球蛋白吸附劑。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有的02微球蛋白吸附劑的不足，提供了一種02微球蛋白吸附劑，通 過(guò)在瓊脂糖凝膠表面定向固載單域抗體，具體以瓊脂糖凝膠微球Sepharose CL-6B作為載 體，經(jīng)過(guò)環(huán)氧活化后偶聯(lián)單域抗體，可以有效的特異性去除血液中的02微球蛋白。其特征是 一種生物相容性好，吸附量高，同時(shí)，由于抗體的高選擇性，可以有效地避免非特異性吸附， 可用于血液灌流的吸附劑。
[0008] 所述抗人02微球蛋白的吸附劑的制備方法，其具備包括以下步驟：
[0009] (1)瓊脂糖凝膠分別經(jīng)水和0.35mol/L的NaOH溶液清洗;再按順序?qū)傊悄z： 0.3~0.4mol/L NaOH或K0H溶液:1，4-丁二醇縮水甘油醚按照體積比為3:8:5的比例依次混 合;在18~20 °C的搖床中，170轉(zhuǎn)/分反應(yīng)30分鐘后，順次經(jīng)水、丙酮、水清洗；
[0010] ⑵將單域抗體與pH 9的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液混合，使其終濃度為3~5mg/mL;
[0011] (3)向步驟（1)制備的瓊脂糖凝膠中加入其5倍體積的步驟(2)制備的單域抗體溶 液，在30 °C的搖床中，170轉(zhuǎn)/分反應(yīng)2小時(shí)后，充分水洗，按瓊脂糖凝膠5倍體積的量，再加入 pH 9的6%的乙醇胺溶液，30°C的搖床中，170轉(zhuǎn)/分反應(yīng)4小時(shí)，充分清洗，制得終產(chǎn)品。
[0012] 對(duì)于上文所述的抗人02微球蛋白的吸附劑的制備方法，優(yōu)選情況下，所用瓊脂糖 凝膠為Sepharose CL-6B。以Sepharose CL-6B作為載體，該材料易于修飾，生物相容性好。
[0013] 對(duì)于上文所述的抗人02微球蛋白的吸附劑的制備方法，優(yōu)選情況下，步驟(2)所用 單域抗體使用專利CN 104098694中的方法制備得到的單域抗體，其親和常數(shù)達(dá)到107以上。
[0014] 對(duì)于上文所述的抗人02微球蛋白的吸附劑的制備方法，優(yōu)選情況下，步驟(1)所述 的丙酮清洗指先用梯度濃度遞增的丙酮清洗、再用梯度濃度遞減的丙酮清洗。優(yōu)選的技術(shù) 方案中，凝膠經(jīng)過(guò)水洗，30 %，70 %，100 %丙酮依次洗后再重新經(jīng)70%，30%丙酮，雙蒸水清 洗置換為水。
[0015] 對(duì)于上文所述的抗人02微球蛋白的吸附劑的制備方法，優(yōu)選情況下，所述清洗均 為3次以上的充分清洗。
[0016] 本發(fā)明的另一方面，在于保護(hù)對(duì)于上文所述的方法制備的02微球蛋白吸附劑，以 及所述的K微球蛋白吸附劑在血液凈化去除02微球蛋白方面的應(yīng)用。該吸附劑對(duì)02微球蛋 白的理論吸附容量達(dá)到1.04mg/mL，親和常數(shù)達(dá)到10 7L/mol以上。經(jīng)過(guò)5次再生之后，吸附劑 仍然保持60%以上的吸附能力。保存1個(gè)月之后，吸附劑仍然保持了80%以上的吸附能力。
[0017] 本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明通過(guò)在瓊脂糖凝膠微球表面固載特異性識(shí)別02微球蛋 白的單域抗體，制備了可用于血液灌流的敗微球蛋白吸附劑。生物學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該抗體 對(duì)02微球蛋白具有很高的特異性結(jié)合能力，微球蛋白去除率達(dá)到92.8%，可應(yīng)用于血液 凈化，有助于促進(jìn)和改善對(duì)透析相關(guān)淀粉樣變等疾病的診斷和治療。
【附圖說(shuō)明】
[0018]圖1為吸附劑對(duì)02微球蛋白吸附能力的檢測(cè)結(jié)果，其中A為吸附劑對(duì)02微球蛋白的 吸附等溫線;B為Scatchard法作圖線性回歸結(jié)果。
[0019]圖2吸附劑的重復(fù)使用效果評(píng)價(jià)。
[0020]圖3保存時(shí)間對(duì)吸附性能的影響。
【具體實(shí)施方式】
[0021]下述非限定性實(shí)施例可以使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員更全面地理解本發(fā)明，但不以 任何方式限制本發(fā)明。實(shí)施例中所用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)的方法，所使用的 材料，試劑如無(wú)特殊說(shuō)明，均可以從商業(yè)途徑得到。
[0022]實(shí)施例1瓊脂糖凝膠的環(huán)氧活化
[0023] 稱取30mL保存于20%乙醇的Sepharose CL 6B瓊脂糖凝膠，經(jīng)雙蒸水充分清洗除 去乙醇后，使用0.35mol/L NaOH溶液清洗三次后，放置于三角瓶中。
[0024] 向三角瓶中依次加入體積為80mL的0.35mol/L NaOH溶液和50mL的1，4_丁二醇縮 水甘油醚。在18~20 °C的搖床中以170轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速，反應(yīng)30min。
[0025]反應(yīng)結(jié)束后，依次使用雙蒸水，30%丙酮，70 %丙酮，100 %丙酮，丙酮依次洗后再 重新經(jīng)70%，30%丙酮，雙蒸水清洗凝膠置換為水，每步清洗各洗三次。
[0026]實(shí)施例2單域抗體的偶聯(lián)：
[0027]使用專利CN 104098694中的方法制備得到的單域抗體，通過(guò)超濾將單域抗體的溶 液環(huán)境置換為pH 9的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液，使其終濃度為3~5mg/mL。
[0028]在三角瓶中加入一定質(zhì)量的環(huán)氧活化后的瓊脂糖凝膠，加入5倍凝膠體積的單域 抗體溶液，在30°C，170轉(zhuǎn)/分的搖床中反應(yīng)2小時(shí)。
[0029] 反應(yīng)結(jié)束后，雙蒸水洗凝膠，清洗五次。將凝膠置于三角瓶中，加入5倍凝膠體積的 6%的乙醇胺溶液(pH 9)，在30°C的搖床中170轉(zhuǎn)/分的搖床中，反應(yīng)4小時(shí)。
[0030] 反應(yīng)結(jié)束后，雙蒸水洗凝膠，清洗五次。將凝膠置于0.05 %的疊氮鈉水溶液中于4 °c保存。
[0031] 實(shí)施例3吸附劑對(duì)02微球蛋白的吸附等溫線和親和常數(shù)的測(cè)定
[0032]將基因工程表達(dá)的02微球蛋白（表達(dá)方法參照《人02微球蛋白基因在大腸桿菌中 的穩(wěn)定、高效表達(dá)》，周最明等，第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2002年第11期）溶液用稀釋緩沖液(PBS 緩沖液，pH7 ? 4)分別稀釋至 4yg/mL、16yg/mL、24yg/mL、3 2yg/mL、48yg/mL、64yg/mL、72yg/ mL、96iig/mL、128iig/mL，取各稀釋液5mL及納米抗體偶聯(lián)密度為4mg/mL的吸附劑0. lmL加入 至15mL樣品瓶中，樣品瓶封口后放入搖床中，在37°C，150r/min的條件下親和吸附2小時(shí)。吸 附結(jié)束后，1000r/min離心5分鐘，取上清用微量BCA法測(cè)量上清中蛋白濃度。計(jì)算吸附前蛋 白總量和吸附后蛋白總量的差值即可得出吸附劑對(duì)02微球蛋白的吸附量。利用Scatchard 法作圖，線性回歸得到吸附劑對(duì)02微球蛋白的最大理論吸附容量和親和常數(shù)，經(jīng)過(guò)計(jì)算得 吸附劑對(duì)02微球蛋白的最大理論吸附容量1.04mg/mL，親和常數(shù)1.16 X 107L/mol。
[0033]實(shí)施例4吸附劑對(duì)血清中02微球蛋白的吸附
[0034] 對(duì)血清中02微球蛋白的吸附：取800uL透析患者的血清樣品（樣品中02微球蛋白濃 度約為32.07mg/L)，裝入離心管中，加入40uL吸附劑，顛倒混勾30min后1000r/min離心1分 鐘，取500uL上清用02微球蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)量血清中殘留&微球蛋白濃度。
[0035]吸附后血清中總蛋白的測(cè)定:取800uL透析患者的血清樣品（樣品中總蛋白濃度為 68.3g/L)，裝入離心管中，加入40uL吸附劑，顛倒混勾30min后1000r/min離心1分鐘，取 500uL上清測(cè)量總蛋白濃度。
[0036]吸附結(jié)果如下：
[0038]實(shí)施例5吸附劑的重復(fù)使用效果評(píng)價(jià)
[0039] 抗體固載量為5mg/mL的吸附劑體積0. lmL加入樣品瓶中，加入5mL 0. lmg/mL02微 球蛋白溶液(PBS，pH = 7.4)，樣品瓶封口后放入搖床中，在37°C，150r/min的條件下親和吸 附2h。
[0040] 每次吸附結(jié)束后使用10mM的甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH=2.1)充分再生，后重新進(jìn)行 吸附。用差量法計(jì)算吸附劑對(duì)K微球蛋白的吸附量。
[0041] 吸附結(jié)果如圖2所示，經(jīng)過(guò)5次再生之后，吸附劑仍然保持了一定的結(jié)合能力。
[0042] 實(shí)施例6保存時(shí)間對(duì)吸附性能的影響
[0043]合成的吸附材料在0.05%的疊氮鈉水溶液中保存于4°C冰箱中，測(cè)量不同的保存 時(shí)間對(duì)溶液中B2M飽和吸附量的影響。
[0044]飽和吸附量使用靜態(tài)吸附的方法測(cè)量:抗體固載量為5mg/mL的吸附劑體積0. lmL 加入樣品瓶中，加入5mL 0. lmg/mLB2M溶液(PBS，pH=7.4)，樣品瓶封口后放入搖床中，在37 °C，150r/min的條件下親和吸附2h。用差量法計(jì)算吸附劑對(duì)02微球蛋白的吸附量。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 抗人β2微球蛋白的血液凈化吸附劑的制備方法，其特征在于，具備包括以下步驟： (1) 瓊脂糖凝膠分別經(jīng)水和〇. 35mol/L的NaOH溶液清洗;再按順序?qū)傊悄z:0.3~ 0.4mol/L NaOH或K0H溶液：1，4-丁二醇縮水甘油醚按照體積比為3:8:5的比例依次混合;在 18~20 °C的搖床中，170轉(zhuǎn)/分反應(yīng)30分鐘后，順次經(jīng)水、丙酮、水清洗； (2) 將單域抗體與pH=9的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖液混合，使其終濃度為3~5mg/mL; (3) 向步驟（1)制備的瓊脂糖凝膠中加入其5倍體積的步驟(2)制備的單域抗體溶液，在 30 °C的搖床中，170轉(zhuǎn)/分反應(yīng)2小時(shí)后，充分水洗，按瓊脂糖凝膠5倍體積的量，再加入pH=9 的6 %的乙醇胺溶液，30 °C的搖床中，170轉(zhuǎn)/分反應(yīng)4小時(shí)，充分清洗，制得終產(chǎn)品。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人β2微球蛋白的吸附劑的制備方法，其特征在于，所用瓊脂 糖凝膠為Sepharose CL-6B。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人β2微球蛋白的吸附劑的制備方法，其特征在于，步驟（1) 所述的丙酮清洗指先用梯度濃度遞增的丙酮清洗、再用梯度濃度遞減的丙酮清洗。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗人β2微球蛋白的吸附劑的制備方法，其特征在于，所述清洗 均為3次以上的充分清洗。5. 如權(quán)利要求1所述方法制備的β2微球蛋白吸附劑。6. 如權(quán)利要求5所述的β2微球蛋白吸附劑在血液凈化去除β2微球蛋白方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】B01J20/28GK106000350SQ201610313113
【公開(kāi)日】2016年10月12日
【申請(qǐng)日】2016年5月12日
【發(fā)明人】賈凌云, 暴曉博, 任軍, 徐麗
【申請(qǐng)人】大連理工大學(xué)