專利名稱：缺鐵性貧血相關(guān)血清鐵濃度檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及檢測缺鐵性貧血相關(guān)血清鐵濃度的試劑盒，通過同時(shí)檢測與缺鐵性貧血密切相關(guān)的跨膜絲氨酸蛋白酶(TMPRSS6)和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2 (TfR2)的單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)基因型來評估個(gè)體缺鐵性貧血癥狀程度。
背景技術(shù)：
缺鐵性貧血是體內(nèi)鐵的儲(chǔ)存不能滿足正常紅細(xì)胞生成的需要而發(fā)生的貧血。是由于鐵攝入量不足、吸收量減少、需要量増加、鐵利用障礙或丟失過多所致。形態(tài)學(xué)表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素性貧血。缺鐵性貧血不是ー種疾病，而是疾病的癥狀。缺鐵性貧血是最多的ー種貧血，廣泛地存在于世界各地，據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)調(diào)查報(bào)告，全世界約有10 — 30%的人群有不同程度的缺鐵。男性發(fā)病率約10%，女性大于20%。亞洲發(fā)病率高于歐洲。發(fā)表在2008年4月13日的《自然ー遺傳學(xué)》(Nature Genetics)雜志網(wǎng)絡(luò)版上，來自美國的研究人員報(bào)告說，一個(gè)名為TMPRSS6的基因發(fā)生變異后，會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)ー種罕見疾病——“難治性缺鐵性貧血癥”。研究人員稱，這ー發(fā)現(xiàn)將為治療常見的鐵失調(diào)癥提供新思路。TMPRSS6是跨膜絲氨酸蛋白酶(TMPRSSs)中的亞家族中的其中ー員?？缒そz氨酸蛋白酶又名II型跨膜絲氨酸蛋白酶(TTSPs)是ー類定位于細(xì)胞膜上具有保守絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域的蛋白家族。自1998年發(fā)現(xiàn)第一個(gè)跨膜絲氨酸蛋白酶TMPRSS1 (hep sin) (Leytus等，1998)以來，至今已在人、小鼠和老鼠中發(fā)現(xiàn)二十多個(gè)成員，僅人類就有十幾種。TMPRSS表達(dá)具有明顯組織特異性，TMPRSS6主要在胎兒和成人肝臟中表達(dá)(Velasco等，2002)，而TMPRSS10主要存在于心臟(Yan等，1999)，這種表達(dá)模式說明不同TMPRSS參與不同生理過程。TMPRSS家族成員在分子量上差別巨大，如人TMPRSS1包含417個(gè)氨基酸殘基，而TMPRSS10由1042個(gè)氨基酸構(gòu)成，兩者相差I(lǐng)倍以上，但基本結(jié)構(gòu)卻高度相似，均含四部分，從N端到C端依次為短細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域、主干區(qū)和絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)域，后兩者位于胞外，不同成員區(qū)別主要集中于主干區(qū)。根據(jù)主干區(qū)不同，TMPRSS可被進(jìn)ー步分為四個(gè)亞家族HAT/DESC、h印sin/TMPRSS, matriptase 和 corin。HAT/DSEC 亞家族包括 TMPRSSlld (HAT)和 TMPRSSlle(DESC1),它們結(jié)構(gòu)最為簡單，主干區(qū)僅由單一SEA(sea urchin sperm protein, enteropeptidase, agrin)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成。H印sin/TMPRSS亞家族包括TMPRSS1 5和TMPRSS13等，是包含種類最多的ー個(gè)亞家族，主干區(qū)包含清道夫受體富含半胱氨酸(scavenger receptorcys-rich, SRCR)結(jié)構(gòu)域和低密度脂蛋白 A 類受體(low density lipoprotein receptorclass A, LDLa)結(jié)構(gòu)域。matriptase 亞家族包括 TMPRSS14 (matriptase-1 )、TMPRSS6(matriptase-2)和TMPRSS7 (matriptase-3),其主干區(qū)除含有SEA結(jié)構(gòu)域外，還包含2個(gè)CUB (complement protein subcomponents Cir/しls， urchin embryonic growth factorand bone morphogenetic protein I)結(jié)構(gòu)域及3到4個(gè)串聯(lián)重復(fù)LDLa結(jié)構(gòu)域。corin亞家族目前只發(fā)現(xiàn)ー個(gè)成員TMPRSS10 (corin)，其結(jié)構(gòu)最為復(fù)雜，主干區(qū)包含8個(gè)LDLa結(jié)構(gòu)域，2個(gè)frizzled結(jié)構(gòu)域和I個(gè)SRCR結(jié)構(gòu)域。TMPRSS6表達(dá)具有肝臟特異性，其基因突變可造成人難治性缺鐵性貧血(iron-refractory iron deficiency anemia, RDA)的發(fā)生(Finberg 等，2008),而 TMPRSS6基因突變小鼠也具有嚴(yán)重缺鐵和貧血表型，對貧血病人和突變小鼠單純給予高鐵飲食都無法完全改善貧血，這說明TMPRSS6基因突變破壞了機(jī)體在缺鐵情況下的鐵吸收，從而導(dǎo)致貧血。1999年Kawabata等分別從TF-1細(xì)胞和HL-60細(xì)胞cDNA文庫中克隆出長度分別為2. 9kb和2. 5kb的兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，它們與TfR-I氨基酸序列有高度同源性，并分別命名為轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 2_ a (transferrin receptor2- a , TfR2- a )和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體 2-0 (transferrin rec印tor2-0，TfR2-0 )。TfR2基因定位于人類7號染色體(7q22)，長度約21kb。TfR2- a轉(zhuǎn)錄本含18個(gè)外顯子，而TfR2- ^轉(zhuǎn)錄本缺乏對應(yīng)于TfR2- a轉(zhuǎn)錄本的第I至第3外顯子，故只有15個(gè)外顯子，但其外顯子1(相當(dāng)于TfR2_ a轉(zhuǎn)錄本的外顯子4)5’-端較之TfR2_ a外顯子4具有一段由142個(gè)核苷酸組成的特有序列。TfR2-0轉(zhuǎn)錄本可能是同一基因可變剪接(alternative splicing)的產(chǎn)物。小鼠TfR2基因定位于第5號染色體，cDNA長度約2. 8Kb，兩者的啟動(dòng)子序列也高度保守。由于可變剪接，小鼠TfR2基因可能存在三種不同長度的轉(zhuǎn)錄本。TfR2與TfRl基因結(jié)構(gòu)上的最大差別在于前者無3’ -端未翻譯區(qū)的IRE結(jié)構(gòu)域，而TfRl在其3’ -未翻譯區(qū)具有5個(gè)IRE結(jié)構(gòu)。Kawabata等將TfR2-a轉(zhuǎn)染入本身缺乏TfRl和TfR2的中國倉鼠卵巢(ChineseHamster Ovary, CH0)細(xì)胞，結(jié)果CHO細(xì)胞表面與生物素標(biāo)記的轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin, Tf)的結(jié)合力顯著增高，表明TfR2_a表達(dá)于CHO細(xì)胞表面并可與Tf 特異性結(jié)合，這種結(jié)合可被未標(biāo)記的Tf競爭性抑制。此外，TfR2- a轉(zhuǎn)染的CHO尚可將55Fe_Tf攝入細(xì)胞內(nèi)，其攝鐵能力類似于TfRl轉(zhuǎn)染的CH0，表明TfR2- a與TfRl在Tf結(jié)合能力和攝取Tf鐵等方面具有相似的功能，可能是細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的另ー個(gè)重要分子途徑。 野生型HFE蛋白(其突變導(dǎo)致遺傳性血色病I )可與TfRl、^ 2微球蛋白結(jié)合形成雜三聚體，降低TfRl與其配體Tf的親和性，負(fù)向調(diào)節(jié)細(xì)胞對Tf結(jié)合鐵的攝取，是調(diào)節(jié)細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的ー種重要分子。West等研究發(fā)現(xiàn)，TfRl與Tf結(jié)合的親和性為TfR2與Tf結(jié)合親和性的25倍，而且TfR2介導(dǎo)的細(xì)胞鐵轉(zhuǎn)運(yùn)是兩種不同的分子途徑。但Deaglio等通過免疫組化研究發(fā)現(xiàn)，TfR2高水平表達(dá)于腸道絨毛細(xì)胞，提示TfR2可能是參與腸道鐵吸收或鐵轉(zhuǎn)運(yùn)的一種調(diào)節(jié)蛋白或機(jī)體鐵狀況的“感應(yīng)分子”。Camaschella等首先在一個(gè)意大利家系中發(fā)現(xiàn)了ー種特殊類型的遺傳性血色病(遺傳性血色病III型)，這是由于TfR2基因6號外顯子第750號核苷酸C被置換為G，從而導(dǎo)致第250號遺傳密碼子TAC (酪氨酸)變?yōu)榻K止密碼TAG，這ー純合無義突變(Y250X)導(dǎo)致TfR2失活。TfR2基因功能的缺失導(dǎo)致鐵負(fù)荷增多的臨床表型，提示TfR2的生物學(xué)功能可能在于鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)控而非鐵攝取。Roetto等尚發(fā)現(xiàn)另外兩種TfR2基因的突變①TfR2基因第2號外顯子84 88堿基間插入ー個(gè)堿基C導(dǎo)致移碼突變，使第60號遺傳密碼編碼的谷氨酸變?yōu)椹`個(gè)終止密碼(E60X) TfR2基因4號外顯子上第515號的T與516號的A發(fā)生堿基顛換(transversion)，使172號遺傳密碼子編碼的蛋氨酸變?yōu)橘嚢彼?M172K)。Y250X使TfR2-a和TfR2-0失活，E60X使TfR2_ a失活，而M172K使TfR2_ a發(fā)生錯(cuò)義突變和可能阻礙TfR2-0的產(chǎn)生。此外，Girelli D等發(fā)現(xiàn)TfR2蛋白第594 597號丙氨酸-纈氨酸-丙氨酸-谷氨酰氨缺失[AVAQ594-597del]而失活。Hoffman等則新近發(fā)現(xiàn)TfR2外顯子10的一種少見的突變類型1391號G與1392號A發(fā)生堿基顛換，使TfR2蛋白第455號核苷酸精氨酸被谷氨酰氨置換(Arg455Gln ;R445Q)。Fleming等通過定位誘變(targetedmutagenesis)使小鼠TfR2蛋白第245號酪氨酸變?yōu)榻K止密碼TAG (Y245X，相當(dāng)于人類TfR2的Y250X)，這種純合子小鼠肝鐵含量和血清轉(zhuǎn)鐵蛋白飽和度明顯增高，而脾臟鐵含量則顯著降低。小鼠TfR2突變動(dòng)物模型鐵負(fù)荷增多的臨床表型非常類似于人類遺傳性血色病III型，直接證明了 TfR2的基因異?？梢詫?dǎo)致機(jī)體鐵符合增多，是參與鐵穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的重要分子。
發(fā)明內(nèi)容本實(shí)用新型針對目的是提供ー種采用熒光定量PCR技術(shù)同時(shí)檢測兩個(gè)血清鐵濃度相關(guān)基因SNP位點(diǎn)的試劑盒。該試劑盒由包裝盒體、襯墊、裝有檢測兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管、裝有陽性對照品的ー個(gè)試管、裝有陰性對照品的ー個(gè)試管組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液、陽性對照品和陰性對照品。其中熒光定量PCR反應(yīng)液的成分包含PCR緩沖液、MgC12、dNTPs、SNP位點(diǎn)檢測用上游引物、SNP位點(diǎn)檢測用下游引物、SNP位點(diǎn)基因型ー熒光探針、SNP位點(diǎn)基因型ニ熒光探針、Taq DNA聚合酶。其中，跨膜絲氨酸蛋白酶(TMPRSS6)上的SNP位點(diǎn)檢測引物和探針為上游引物序列5’- CCCTACCTTCCTGGCA -3’下游引物序列5’- AGCCTGATTGTCTCAA -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - GCTCTTCaTCGCTG - TAMRA -3’基因型ニ熒光探針序列5’-VIC- GCTCTTCgTCGCTG - TAMRA -3’轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2 (TfR2)上的SNP位點(diǎn)檢測引物和探針為上游引物序列5’- CCTGAGCAGGCTGGG -3’下游引物序列5’- CCCAAAATGCTGGGA -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - GCGGTACCTaATTCCTAT - TAMRA -3’基因型ニ熒光探針序列5’-VIC - GCGGTACCTcATTCCTAT -TAMRA -3’對照品分為陽性對照品和陰性對照品，陰性對照品為無菌雙蒸水樣品，陽性對照品為ロ腔粘膜細(xì)胞DNA樣品。本試劑盒保存于-20°C，盡量減少反復(fù)凍融。本實(shí)用新型試劑盒使用方法毎次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性對照和陰性對照。擴(kuò)增檢測在熒光定量PCR儀上進(jìn)行，分為6個(gè)反應(yīng)管，每ー個(gè)SNP位點(diǎn)檢測使用3個(gè)反應(yīng)管，其中I個(gè)反應(yīng)管為被檢測樣品，陽性對照和陰性對照各使用I個(gè)反應(yīng)管，每管中總體積10 iil，其中Siil PCR反應(yīng)液，2 檢測樣品(基因組DNA、陽性對照或陰性對照)。反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，再進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95°C、30秒，60°C、I分鐘。反應(yīng)完成后在熒光定量PCR儀上進(jìn)行終點(diǎn)熒光讀取，根據(jù)得到的ニ維熒光圖和實(shí)時(shí)擴(kuò)增曲線讀取被檢測樣品的SNP位點(diǎn)基因型。本實(shí)用新型提供的該試劑盒主要用于檢測血清鐵濃度相關(guān)基因SNP位點(diǎn)，從而告知被檢者患病風(fēng)險(xiǎn)數(shù)值，提前預(yù)防和控制，指導(dǎo)醫(yī)師選擇正確的臨床治療方案，有利于患者進(jìn)行針對性治療。本實(shí)用新型的特點(diǎn)是該試劑盒運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測兩個(gè)血清鐵濃度相關(guān)基因SNP位點(diǎn)基因型的目的，相對于現(xiàn)有的熒光定量PCR試劑盒只檢測ー個(gè)SNP位點(diǎn)，本實(shí)用新型試劑盒將同一疾病的所有SNP位點(diǎn)檢測整 合在ー個(gè)試劑盒內(nèi)，使用更方便而且成本更低，對個(gè)體缺鐵性貧血癥狀程度的評估也更便捷。

圖I為本實(shí)用新型的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
本實(shí)用新型結(jié)合附圖和具體實(shí)施例作進(jìn)ー步說明。應(yīng)該理解，這些實(shí)施例僅用于說明目的，而不用于限制本實(shí)用新型范圍。實(shí)施例I參見圖1，本實(shí)用新型試劑盒由包裝盒體I、襯墊2、裝有檢測兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管3、裝有陽性對照品的一個(gè)試管4、裝有陰性對照品的一個(gè)試管5組成，襯墊上設(shè)有容器孔、分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液3、陽性對照品4和陰性對照品5。其中熒光定量PCR反應(yīng)液的成分包含PCR緩沖液、MgC12、dNTPs、SNP位點(diǎn)檢測用上游引物、SNP位點(diǎn)檢測用下游引物、SNP位點(diǎn)基因型ー熒光探針、SNP位點(diǎn)基因型ニ熒光探針、Taq DNA聚合酶。本試劑盒保存于_20°C，盡量減少反復(fù)凍融。實(shí)施例2I.材料血樣總DNA提取試劑盒購于美國Qiagen公司，Taq DNA聚合酶、dNTPs等PCR相關(guān)試劑購于美國Promega公司，7900型熒光定量PCR儀為美國ABI公司產(chǎn)品。2.引物及探針跨膜絲氨酸蛋白酶(TMPRSS6)上的SNP位點(diǎn)檢測引物和探針為上游引物序列5’- CCCTACCTTCCTGGCA -3’下游引物序列5’- AGCCTGATTGTCTCAA -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - GCTCTTCaTCGCTG - TAMRA -3’基因型ニ熒光探針序列5’-VIC- GCTCTTCgTCGCTG - TAMRA -3’轉(zhuǎn)鐵蛋白受體2 (TfR2)上的SNP位點(diǎn)檢測引物和探針為上游引物序列5’- CCTGAGCAGGCTGGG -3’下游引物序列5，-CCCAAAATGCTGGGA -3’基因型ー熒光探針序列5’-FAM - GCGGTACCTaATTCCTAT - TAMRA -3’[0052]基因型ニ熒光探針序列5’-VIC - GCGGTACCTcATTCCTAT -TAMRA -3’3.樣本檢測 選取30例血液樣本，其中已確定患缺鐵性貧血的為18例。樣本用血樣總DNA提取試劑盒提取總DNA。每一例檢測為12個(gè)反應(yīng)管，每管中總體積lOiil，其中8iU PCR反應(yīng)液，姆ー個(gè)SNP位點(diǎn)檢測使用3個(gè)反應(yīng)管，I個(gè)反應(yīng)管中加入2 u I被檢測DNA,另外2個(gè)反應(yīng)管中加入2 u I陽性對照和陰性對照，在ABI7900熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)條件為50°C、2分鐘，95°C、10分鐘，再進(jìn)行60個(gè)循環(huán)的95 V、30秒，60°C、I分鐘。反應(yīng)完成后在熒光定量PCR儀上進(jìn)行終點(diǎn)熒光讀取。
權(quán)利要求1. ー種缺鐵性貧血相關(guān)血清鐵濃度基因位點(diǎn)檢測試劑盒，其特征是由包裝盒體(I)、襯墊(2)、裝有檢測兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管(3)、裝有陽性對照品的一個(gè)試管(4)、裝有陰性對照品的一個(gè)試管(5)組成，襯墊(2)上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液(3 )、陽性對照品(4 )和陰性對照品(5 )。
專利摘要本實(shí)用新型提供了一種檢測血清鐵濃度相關(guān)基因位點(diǎn)是否發(fā)生突變從而評估個(gè)體缺鐵性貧血癥狀程度的試劑盒，由包裝盒體1、襯墊2、裝有檢測兩個(gè)SNP位點(diǎn)的熒光定量PCR反應(yīng)液的兩個(gè)試管3、裝有陽性對照品的一個(gè)試管4、裝有陰性對照品的一個(gè)試管5組成，襯墊上設(shè)有容器孔，分別放置兩管熒光定量PCR反應(yīng)液3、陽性對照品4和陰性對照品5。本實(shí)用新型試劑盒運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)實(shí)現(xiàn)了同時(shí)檢測兩個(gè)血清鐵濃度相關(guān)基因SNP位點(diǎn)基因型的目的，相對于現(xiàn)有的熒光定量PCR試劑盒只檢測一個(gè)SNP位點(diǎn)，本實(shí)用新型試劑盒將與同一疾病的兩個(gè)SNP位點(diǎn)檢測整合在一個(gè)試劑盒內(nèi)，使用更方便而且成本更低，對個(gè)體缺鐵性貧血癥狀程度的評估也更便捷。
文檔編號C12Q1/68GK202401069SQ2011205694
公開日2012年8月29日 申請日期2011年12月31日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月31日
發(fā)明者任峻, 張華忠 申請人:浙江愛易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司