專利名稱：熒光強度補償方法及熒光強度計算裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種熒光強度補償方法及熒光強度計算裝置，更具體地，涉及一種用于精確地計算從微粒上多重標記的多種熒光染料的每一種發(fā)出的熒光的強度的熒光強度控制方法。
背景技術：
為了測量諸如細胞的微粒的特性，現(xiàn)有裝置(如流式細胞儀)使用熒光染料標記微粒、向熒光染料照射激光束以激發(fā)熒光染料以及測量由激發(fā)的熒光染料發(fā)出的熒光的強度或圖譜(pattern)。近年來，為了更精確地分析例如細胞的特性，使用其中用多種熒光染料標記微粒并使用具有不同接收光波段的多個光檢測器(如PD (光電二極管)或PMT (光電倍增管)測量從熒光染料發(fā)出的激光束的多色法測量。在多色法測量中，為了檢測熒光， 根據(jù)所使用的熒光染料的熒光波長為光檢測器選取一個濾光片。然而，當前使用的熒光染料(如FITC(異硫氰酸熒光素))或PE (藻紅蛋白)在熒光光譜中具有重疊的頻段。因此，在使用這些熒光染料的組合進行多色法測量的情況下，即使使用濾光片將從各熒光染料發(fā)出的熒光分離為不同的頻段，光檢測器仍可檢測到從不想要的熒光染料中漏入(spillover)的熒光。如果發(fā)生熒光漏入，則光檢測器檢測到的熒光強度偏離從期望的熒光染料發(fā)出的熒光的真實強度。因此，產(chǎn)生測量誤差。為了補償測量誤差，通過從由光檢測器測出的熒光強度減去漏入的熒光的強度來執(zhí)行熒光補償。通過以電的方式或數(shù)學的方式補償脈沖來執(zhí)行熒光補償，使得由光檢測器測出的熒光強度變?yōu)槠谕麩晒獾恼鎸崯晒鈴姸?。一種以數(shù)學方式補償熒光強度的方法，是通過將由光檢測器測出的熒光強度(檢測值)定義為向量并將預定的漏入矩陣的逆矩陣作用于該向量來執(zhí)行。以此方式，可算出從期望的熒光染料發(fā)出的熒光的真實強度(參照圖3和圖4，及日本未審查專利申請公開第 2003-83894號)。通過分析被單標記的各微粒的熒光波長分布來生成漏入矩陣。在漏入矩陣中，各熒光染料的熒光波長分布被表示為列向量，并對這些列向量進行排列。漏入矩陣的逆矩陣也被稱作“補償矩陣”。在圖3和圖4中，示出了使用五種熒光染料(FITC、PE、E⑶、 PC5和PC7)和五個光檢測器進行五色法測量的示例。

發(fā)明內(nèi)容
在使用補償矩陣對熒光強度進行補償?shù)姆椒ㄖ?，允許負值用作矩陣的元素。因此， 補償?shù)臒晒鈴姸瓤梢詾樨摗＿@是因為包含在各光檢測器的檢測值中的噪聲會影響矩陣元素的值。然而，實際上，從各熒光染料發(fā)出的熒光的強度不為負。此外，如果從一種熒光染料發(fā)出的熒光的強度被計算為負值，則從其它熒光染料發(fā)出的熒光的強度的計算值在正方向上出現(xiàn)誤差。如果在要分析的微粒群中存在一種熒光染料的熒光強度為負的子群，則在二維相關圖(細胞直方圖)中不繪出該子群，其中在二維相關圖中熒光染料的熒光強度標繪在對數(shù)軸上(具有對數(shù)尺度)。因此，用戶可能誤解二維相關圖上標繪的群少于實際的群。此外，在現(xiàn)有的熒光強度補償方法中，在將從微粒發(fā)出的自身熒光的強度的檢測值當作背景值并從各光檢測器的檢測值中減去自身熒光的強度時，將整個群的自身熒光強度的平均值用于計算。然而，子群與子群間的自身熒光的強度和圖譜是不同的。因此，從所有群的每一個中減去相同平均值的計算引起熒光強度的計算值誤差。具體地，如果要分析的子群間的自身熒光差異顯著，則誤差增加。因此，本發(fā)明提供了一種在使用多個光檢測器對用多種熒光染料多重標記的微粒進行多色法測量時，精確地計算從各熒光染料發(fā)出的熒光的強度并向用戶呈現(xiàn)算得的強度的技術。根據(jù)本發(fā)明的實施方式，一種熒光強度補償方法包括向用熒光波段彼此重疊的多種熒光染料多重標記的微粒照射光、激發(fā)熒光染料并使用具有不同接收波段的光檢測器接收由激發(fā)的熒光染料產(chǎn)生的熒光；以及通過在對算得的熒光強度賦予預定限制條件下補償所述光檢測器的檢測值來計算所述熒光染料的熒光強度。在計算熒光強度過程中，可通過使用從標記有一種熒光染料的微粒獲得的單染色光譜和從未標記任何一種熒光染料的微粒獲得的自身熒光光譜的線性和對測量光譜進行近似來計算各熒光染料的熒光強度和自身熒光強度，該測量光譜是通過收集各光檢測器的檢測值所獲得的。通過在考慮微粒自身熒光成分時執(zhí)行計算，可精確地計算子群間相互不同的自身熒光成分，因此，可避免由子群之間的自身熒光強度不同引起的測量誤差。限制條件可以為算得的各熒光染料的各熒光強度和自身熒光強度大于或等于預定最小值(例如，零)。通過在這樣的限制條件下執(zhí)行計算，能夠避免由熒光染料的熒光強度的算得的負值引起的測量誤差的發(fā)生和二維相關圖(細胞直方圖)中群的減少。該限制條件可以還包括算得的各熒光染料的各熒光強度和自身熒光強度小于或等于預定最大值的條件。用單染色光譜和自身熒光光譜的線性和進行的近似可使用最小二乘方法來執(zhí)行。 更具體地，通過求得使以下的評價函數(shù)為最小值的參數(shù)= 1 Μ)來計算各熒光染料的各熒光強度和自身熒光強度
權利要求
1.一種熒光強度補償方法，包括向用熒光波段彼此重疊的多種熒光染料多重標記的微粒照射光以激發(fā)所述熒光染料， 并使用具有不同接收波段的光檢測器接收由激發(fā)的熒光染料產(chǎn)生的熒光；以及通過在對算得的熒光強度賦予預定限制條件下補償所述光檢測器的檢測值來計算所述熒光染料的熒光強度。
2.根據(jù)權利要求1所述的熒光強度補償方法，其中，在計算熒光強度的過程中，通過使用從標記有一種所述熒光染料的微粒獲得的單染色光譜和從未標記任何一種所述熒光染料的微粒獲得的自身熒光光譜的線性和對測量光譜進行近似來計算各個所述熒光染料的熒光強度和自身熒光強度，所述測量光譜是通過收集所述光檢測器的檢測值來獲得的。
3.根據(jù)權利要求1所述的熒光強度補償方法，其中，所述限制條件為算得的各個所述熒光染料的各個熒光強度和自身熒光強度大于或等于預定最小值。
4.根據(jù)權利要求3所述的熒光強度補償方法，其中，所述限制條件還包括算得的各個所述熒光染料的各個熒光強度和自身熒光強度小于或等于預定最大值的條件。
5.根據(jù)權利要求4所述的熒光強度補償方法，其中，在計算熒光強度的過程中，使用單染色光譜和自身熒光光譜的線性和對所述測量光譜的近似采用最小二乘方法來執(zhí)行。
6.根據(jù)權利要求5所述的熒光強度補償方法，其中，在計算熒光強度的過程中，通過求得使下式的評價函數(shù)為最小值的參數(shù)4來計算各個所述熒光染料的各個熒光強度和自身熒光強度 其中，k = 1 M，Xk(Xi)表示第k種熒光染料的單染色光譜或自身熒光光譜中第i個光檢測器的檢測值，Yi表示測量光譜中第i個光檢測器的檢測值，及ο i表示第i個光檢測器的檢測值的加權倒數(shù)。
7. 一種熒光強度計算裝置，包括測量單元，被配置為向用熒光波段彼此重疊的多種熒光染料多重標記的微粒照射光以激發(fā)所述熒光染料，并使用具有不同接收波段的光檢測器接收由激發(fā)的熒光染料產(chǎn)生的熒光；以及計算單元，被配置為通過在對算得的熒光強度賦予預定限制條件下補償所述光檢測器的檢測值來計算所述熒光染料的熒光強度。
全文摘要
本發(fā)明公開了熒光強度補償方法及熒光強度計算裝置，該熒光強度補償方法包括，向用熒光波段彼此重疊的多種熒光染料多重標記的微粒照射光以激發(fā)熒光染料，并使用具有不同接收波段的光檢測器接收由激發(fā)的熒光染料產(chǎn)生的熒光；以及通過在對算得的熒光強度賦予預定限制條件下補償所述光檢測器的檢測值來計算所述熒光染料的熒光強度。
文檔編號G01J3/36GK102435313SQ201110249799
公開日2012年5月2日 申請日期2011年8月26日 優(yōu)先權日2010年9月3日
發(fā)明者酒井啟嗣 申請人:索尼公司