本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及流式細(xì)胞儀的熒光檢測及光譜分析方法，特別涉及一種流式細(xì)胞儀的熒光補(bǔ)償方法。

背景技術(shù)：

流式細(xì)胞儀是一種集激光技術(shù)、電子物理技術(shù)、光電測量技術(shù)、電子計(jì)算機(jī)技術(shù)、細(xì)胞熒光化學(xué)技術(shù)和單克隆抗體技術(shù)為一體的新型高科技儀器。對(duì)懸液中處于高速、直線流動(dòng)的單細(xì)胞或其他顆粒，通過檢測散射光信號(hào)和(或)標(biāo)記的熒光信號(hào)，實(shí)現(xiàn)高速逐一的多參數(shù)定量分析。在細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞周期動(dòng)力學(xué)、免疫學(xué)、血液學(xué)及腫瘤學(xué)等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用。

流式細(xì)胞儀的原理是單細(xì)胞懸液經(jīng)特異性熒光染料染色后進(jìn)入流式照射室，在流式照射室的分析點(diǎn)，激光照射到細(xì)胞發(fā)生散射和折射，發(fā)射出散射光，細(xì)胞所攜帶的熒光素被激發(fā)并發(fā)射出熒光、前向散射光(FSC)和側(cè)向散射光(SSC)。通過光電轉(zhuǎn)換器件將熒光及散射光轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，前向散射光通過光電二極管轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，側(cè)向散射光通過光電倍增轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，熒光則被聚光器收集，不同顏色的熒光被雙色反光鏡轉(zhuǎn)向不同的光電倍增管檢測器，將熒光信號(hào)轉(zhuǎn)換成電信號(hào)，散射光信號(hào)和熒光信號(hào)經(jīng)過放大后，再經(jīng)過數(shù)據(jù)化處理，輸入計(jì)算機(jī)并儲(chǔ)存，根據(jù)細(xì)胞的散射光和熒光進(jìn)行分析。

流式細(xì)胞儀多色熒光分析是指對(duì)檢測樣本同時(shí)標(biāo)記多種熒光染料進(jìn)行檢測，目前所使用的各種熒光染料的激發(fā)或發(fā)射波長具有寬發(fā)射譜的性質(zhì)，經(jīng)光學(xué)濾片濾光后，發(fā)射光譜范圍仍有一定的干擾重疊。目前，主要是按照各個(gè)接收波長范圍內(nèi)的信號(hào)強(qiáng)度即光強(qiáng)值進(jìn)行熒光補(bǔ)償。然而，光強(qiáng)具有波長相關(guān)性無法真實(shí)反應(yīng)激發(fā)光及熒光團(tuán)的對(duì)應(yīng)關(guān)系。

因此，為了解決流式細(xì)胞儀多色分析過程中熒光光譜重疊造成測量誤差的問題，需要一種能有效解決上述問題的流式細(xì)胞儀熒光檢測和分析補(bǔ)償方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種流式細(xì)胞儀熒光補(bǔ)償方法，包括以下步驟：步驟1)單陽性樣本測試；步驟2)計(jì)算各通道熒光泄漏系數(shù)及熒光泄漏矩陣；步驟3)計(jì)算熒光補(bǔ)償矩陣，根據(jù)熒光泄漏矩陣K求得補(bǔ)償矩陣K K^-1；步驟4)補(bǔ)償修正；步驟5)多色分析測試，對(duì)多色熒光染料染色的樣本進(jìn)行測試，記錄各個(gè)檢測通道的信號(hào)幅值；步驟6)熒光補(bǔ)償。

優(yōu)選地，在所述步驟1)中對(duì)各個(gè)單陽性樣本進(jìn)行熒光檢測，調(diào)整傳感器增益及后續(xù)處理電路的增益使檢測通道的信號(hào)幅值在合適的范圍內(nèi)，調(diào)整完成后傳感器增益及后續(xù)處理電路的增益在后續(xù)的測試過程中將保持不變。記錄檢測通道信號(hào)幅值及其他泄漏通道的泄漏信號(hào)幅值。

優(yōu)選地，在所述步驟2)中對(duì)單個(gè)單陽性樣本進(jìn)行熒光檢測，通過步驟1)中檢測通道信號(hào)幅值與其他泄漏通道的泄漏信號(hào)幅值求出單個(gè)單陽性樣本的檢測通道相對(duì)于其他泄漏通道的泄漏系數(shù)k_ij；多個(gè)單陽性樣本的泄漏系數(shù)按照一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系得到多個(gè)單陽性樣本檢測的熒光泄漏矩陣K。

優(yōu)選地，所述熒光泄漏矩陣K為：

K矩陣為熒光泄漏矩陣,其中k_ij(i＝1,...,n；j＝1,...,n；)是熒光信號(hào)FL_i泄漏到熒光檢測器PMT_j的熒光泄漏比率，F(xiàn)L矩陣為待求真實(shí)熒光信號(hào)矩陣。

優(yōu)選地，所述泄漏矩陣的逆矩陣K^-1為“補(bǔ)償矩陣”。

優(yōu)選地，在所述步驟4)中由得到的熒光檢測波長范圍內(nèi)光強(qiáng)與光子數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，得出各個(gè)檢測通道的修正系數(shù)，并將多個(gè)檢測通道的修正系數(shù)按照一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系組成修正矩陣，利用修正矩陣對(duì)熒光補(bǔ)償矩陣進(jìn)行修正。

優(yōu)選地，所述步驟6)中對(duì)根據(jù)步驟5)中各個(gè)檢測通道的信號(hào)幅值及步驟4)獲得的修正后的熒光補(bǔ)償矩陣對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行運(yùn)算，得到熒光補(bǔ)償后的熒光檢測結(jié)果。

根據(jù)本發(fā)明的用于流式細(xì)胞儀的熒光補(bǔ)償方法，可以解決流式細(xì)胞儀多色分析過程中熒光光譜重疊造成測量誤差的問題，能有效解決現(xiàn)有領(lǐng)域中的流式細(xì)胞儀熒光檢測和分析補(bǔ)償。

應(yīng)當(dāng)理解，前述大體的描述和后續(xù)詳盡的描述均為示例性說明和解釋，并不應(yīng)當(dāng)用作對(duì)本發(fā)明所要求保護(hù)內(nèi)容的限制。

附圖說明

參考隨附的附圖，本發(fā)明更多的目的、功能和優(yōu)點(diǎn)將通過本發(fā)明實(shí)施方式的如下描述得以闡明，其中：

圖1為本發(fā)明流式細(xì)胞儀熒光補(bǔ)償方法的一個(gè)較佳實(shí)施方式示意圖；

圖2為流式細(xì)胞儀多色分析過程中的熒光重疊示意圖；

圖3為兩色熒光信號(hào)檢測及泄漏示意圖；

圖4為四色熒光信號(hào)檢測及泄漏示意圖。

具體實(shí)施方式

在下文中，將參考附圖描述本發(fā)明的實(shí)施例。在附圖中，相同的附圖標(biāo)記代表相同或類似的部件，或者相同或類似的步驟。

通過參考示范性實(shí)施例，本發(fā)明的目的和功能以及用于實(shí)現(xiàn)這些目的和功能的方法將得以闡明。然而，本發(fā)明并不受限于以下所公開的示范性實(shí)施例；可以通過不同形式來對(duì)其加以實(shí)現(xiàn)。說明書的實(shí)質(zhì)僅僅是幫助相關(guān)領(lǐng)域技術(shù)人員綜合理解本發(fā)明的具體細(xì)節(jié)。

針對(duì)本發(fā)明結(jié)合示意圖進(jìn)行詳細(xì)描述，在詳述本發(fā)明實(shí)施例時(shí)，為便于說明，表示器件結(jié)構(gòu)的剖面圖會(huì)不依一般比例作局部放大，而且所述示意圖只是示例，其在此不應(yīng)限制本發(fā)明保護(hù)的范圍。此外，在實(shí)際制作中應(yīng)包含長度、寬度及深度的三維空間尺寸。

為了解決流式細(xì)胞儀多色分析過程中熒光光譜重疊造成測量誤差的問題，本發(fā)明提出一種利用熒光光子數(shù)代替熒光光強(qiáng)的修正方法進(jìn)行熒光補(bǔ)償。

圖1為根據(jù)本發(fā)明的用于對(duì)流式細(xì)胞儀進(jìn)行熒光補(bǔ)償方法的一個(gè)較佳實(shí)施方式示意圖。如圖1所示，根據(jù)本發(fā)明的流式細(xì)胞儀熒光補(bǔ)償方法，包括以下步驟：

步驟101：單陽性樣本測試；

具體地，在所述步驟101中對(duì)各個(gè)單陽性樣本進(jìn)行熒光檢測，調(diào)整流式細(xì)胞儀的傳感器增益及后續(xù)處理電路的增益使檢測通道的信號(hào)幅值在合適的范圍內(nèi)，調(diào)整完成后傳感器增益及后續(xù)處理電路的增益在后續(xù)的測試過程中將保持不變。記錄檢測通道信號(hào)幅值及其他泄漏通道的泄漏信號(hào)幅值。

步驟102：計(jì)算各通道熒光泄漏系數(shù)及熒光泄漏矩陣；

具體地，在所述步驟2)中對(duì)單個(gè)單陽性樣本進(jìn)行熒光檢測，通過步驟101中檢測通道信號(hào)幅值與其他泄漏通道的泄漏信號(hào)幅值求出單個(gè)單陽性樣本的檢測通道相對(duì)于其他泄漏通道的泄漏系數(shù)k_ij；多個(gè)單陽性樣本的泄漏系數(shù)按照一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系得到多個(gè)單陽性樣本檢測的熒光泄漏矩陣K。熒光泄漏矩陣K的計(jì)算方法如下。

當(dāng)根據(jù)本發(fā)明的流式細(xì)胞儀檢測n種不同的熒光素分子時(shí)，任何一種熒光素的發(fā)射光都可能進(jìn)入到其它的熒光檢測通道，F(xiàn)L₁,…,FL_n分別代表n種熒光染料經(jīng)激光照射后發(fā)射的熒光信號(hào)，PMT₁,…,PMTn分別代表n個(gè)目標(biāo)熒光檢測器實(shí)際測量的熒光信號(hào)，則任何一個(gè)通道檢測到的熒光信號(hào)PMT₁,…,PMTn可以表示為：

PMT＝K×FL (1)

式(1)表明檢測器實(shí)際測量的熒光信號(hào)等于熒光泄漏矩陣和熒光染料實(shí)際發(fā)射信號(hào)的乘積(不考慮檢測樣本自發(fā)熒光產(chǎn)生噪聲信號(hào))。式(1)中：

K矩陣為熒光泄漏矩陣,其中k_ij(i＝1,...,n；j＝1,...,n；)是熒光信號(hào)FL_i泄漏到熒光檢測器PMT_j的熒光泄漏比率，F(xiàn)L矩陣為待求真實(shí)熒光信號(hào)矩陣。

步驟103：計(jì)算熒光補(bǔ)償矩陣，根據(jù)步驟102得到的熒光泄漏矩陣K求得補(bǔ)償矩陣K^-1；補(bǔ)償矩陣K^-1的計(jì)算方法如下：

通過以上分析可得全矩陣補(bǔ)償算法測得真實(shí)熒光強(qiáng)度的數(shù)學(xué)模型為：

FL＝K^-1×PMT (2)

全矩陣補(bǔ)償是通過將由光檢測器測出的實(shí)際熒光強(qiáng)度定義為矩陣并將預(yù)定的泄漏矩陣的逆作用于該矩陣，從而計(jì)算出從期望的熒光染料發(fā)出的熒光的真實(shí)強(qiáng)度。通過分析單獨(dú)標(biāo)記的各微粒的熒光波長分布得到泄漏矩陣，在泄漏矩陣中，各熒光染料的熒光波長分布被表示為列向量，并對(duì)這些列向量依次排列，泄漏矩陣的逆矩陣K^-1即為“補(bǔ)償矩陣”。

步驟104：補(bǔ)償修正；

具體地，在所述步驟104中由得到的熒光檢測波長范圍內(nèi)光強(qiáng)與光子數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，得出各個(gè)檢測通道的修正系數(shù)，并將多個(gè)檢測通道的修正系數(shù)按照一定的對(duì)應(yīng)關(guān)系組成修正矩陣。利用修正矩陣對(duì)熒光補(bǔ)償矩陣進(jìn)行修正。

步驟105：進(jìn)行多色分析測試，對(duì)多色熒光染料染色的樣本進(jìn)行測試，記錄各個(gè)檢測通道的信號(hào)幅值；

步驟106：進(jìn)行熒光補(bǔ)償。

具體地，在所述步驟106中對(duì)根據(jù)步驟105中各個(gè)檢測通道的信號(hào)幅值及步驟104獲得的修正后的熒光補(bǔ)償矩陣對(duì)檢測結(jié)果進(jìn)行運(yùn)算，得到熒光補(bǔ)償后的熒光檢測結(jié)果。

為了更加精細(xì)的分析細(xì)胞特性而進(jìn)行多色法熒光測量，即使用多種熒光染料標(biāo)記微粒，并且使用具有不同接收光波段的多個(gè)光檢測器(如PMT)測量從每種熒光染料所發(fā)射的熒光。利用多色法熒光測量時(shí)，通過根據(jù)使用的熒光染料的熒光波長選擇在光檢測器側(cè)的濾光片進(jìn)行熒光的檢測。然而目前所使用的各種熒光染料的激發(fā)或發(fā)射波長具有寬發(fā)射譜的性質(zhì)，經(jīng)光學(xué)濾片濾光后，發(fā)射光譜范圍仍有一定的干擾重疊。因此，若將這些染料組合進(jìn)行多色測量，即使使用濾光片將從熒光染料發(fā)出的熒光分成各個(gè)波段，從非目標(biāo)熒光染料發(fā)出的熒光也可能泄漏到目標(biāo)熒光檢測器。如果發(fā)生熒光泄漏，在光檢測器處測量的熒光強(qiáng)度和來自目標(biāo)熒光染料的真實(shí)熒光強(qiáng)度之間將存在差異，導(dǎo)致測量誤差。

根據(jù)本發(fā)明，為了補(bǔ)償測量誤差，需要對(duì)檢測器的實(shí)際測量值進(jìn)行熒光補(bǔ)償。熒光補(bǔ)償是修正熒光信號(hào)滲漏的過程，其目的是從熒光目標(biāo)檢測器中除去除匹配熒光以外的任何干擾熒光信號(hào)。由488nm激光激發(fā)的熒光染料(FITC、PE、ECD、PE-Cy5、PE-Cy7)熒光發(fā)射光譜交叉重疊示意圖如圖2所示。圖3為兩色熒光信號(hào)檢測及泄漏示意圖；圖4為四色熒光信號(hào)檢測及泄漏示意圖。

根據(jù)本發(fā)明的用于流式細(xì)胞儀的熒光補(bǔ)償方法，可以解決流式細(xì)胞儀多色分析過程中熒光光譜重疊造成測量誤差的問題，能有效解決現(xiàn)有領(lǐng)域中的流式細(xì)胞儀熒光檢測和分析補(bǔ)償。

結(jié)合這里披露的本發(fā)明的說明和實(shí)踐，本發(fā)明的其他實(shí)施例對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員都是易于想到和理解的。說明和實(shí)施例僅被認(rèn)為是示例性的，本發(fā)明的真正范圍和主旨均由權(quán)利要求所限定。