專利名稱：抗體片段修飾的微梁制備方法和基于抗體片段修飾的微梁免疫傳感檢測系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗體片段修飾的微懸臂梁(以下也簡稱為微梁)，及其制備方法。本發(fā)明還公開了基于所述抗體片段修飾的微梁的免疫傳感檢測系統(tǒng)和檢測方法，所述系統(tǒng)和方法可應(yīng)用于食品安全、環(huán)境污染、生物醫(yī)學(xué)、科學(xué)研究和生產(chǎn)制造等領(lǐng)域的監(jiān)控和檢測。
背景技術(shù)：
免疫傳感技術(shù)的原理是基于檢測抗原抗體的特異性配對反應(yīng)，即針對需要檢測的某種靶標(biāo)分子(抗原)，通過生物免疫(把抗原注入小動物體內(nèi)產(chǎn)生的)方法,產(chǎn)生出相應(yīng)的探針分子(抗體)，提取、純化出這種探針分子，再利用抗原抗體的特異性結(jié)合去檢測樣品中的靶分子。已有的免疫傳感技術(shù)如酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA，原理是利用抗原與抗體的特異性反應(yīng)與酶標(biāo)的催化放大來進行)和免疫熒光法(IF，原理是用熒光片段標(biāo)記抗 原或抗體)，均需要標(biāo)記物來示蹤抗原抗體的反應(yīng)結(jié)果，就是說僅有抗體，并不能建立相應(yīng)的檢測方法，還需要有酶標(biāo)物或熒光標(biāo)記物或蛋白復(fù)合物。而一些難制備的靶標(biāo)分子的標(biāo)記物價格昂貴，或幾乎不可能制備或購買。同時酶聯(lián)免疫試劑盒和蛋白芯片的檢測從原理操作上都要求每一步反應(yīng)完后進行清洗，標(biāo)記過程繁瑣耗時，是事后的檢測，不能實時，原位、在線的檢測?；诒砻鎽?yīng)力檢測的微懸臂梁免疫傳感技術(shù)是近年出現(xiàn)的一種新的免疫生化傳感方法[1]，其原理是把探針(抗原或抗體)分子用直接或間接的方式固定(修飾)到微梁一側(cè)的鍍金層上，當(dāng)被檢測樣品液中的靶分子與微梁金表面上的探針分子發(fā)生免疫生化反應(yīng)時，會使微梁表面應(yīng)力改變，從而導(dǎo)致微梁彎曲變形，通過光學(xué)或電學(xué)方法檢測這種變形的過程，可得到免疫生化反應(yīng)的實時信息。基于免疫特異性識別建立的微梁免疫傳感技術(shù)與傳統(tǒng)的需要標(biāo)記物的免疫傳感方法相比，它無需使用任何酶標(biāo)、熒光物質(zhì)和放射性作為反應(yīng)示蹤劑，消除了標(biāo)記過程的影響，靈敏度高(比酶聯(lián)免疫試驗高數(shù)倍[2_4])，還可以通過監(jiān)測微梁變形來實時、定量的監(jiān)測抗原抗體的反應(yīng)過程，得到更豐富的免疫生化反應(yīng)的信息。經(jīng)過這些年的發(fā)展，微梁傳感被作為一種新興技術(shù)，在生物工程和環(huán)境污染監(jiān)測技術(shù)等方面與傳統(tǒng)的方法進行對比研究，如RNA轉(zhuǎn)錄因子、酶、汞排放及揮發(fā)性化合物等，優(yōu)于常規(guī)的酶聯(lián)免疫方法。但即使如此，微懸臂梁免疫傳感技術(shù)的檢測靈敏度還不足以在成本方面獲得相對于常規(guī)酶聯(lián)免疫法的巨大優(yōu)勢，即如果微懸臂梁免疫傳感技術(shù)的靈敏度或檢測極限只比酶聯(lián)免疫法高數(shù)倍，而微懸臂梁免疫傳感技術(shù)的設(shè)備成本與酶聯(lián)免疫相對較高，使得微懸臂梁免疫傳感技術(shù)難以商業(yè)化。目前，國內(nèi)外文獻報道的方法主要是利用具有雙功能基團的疏基化試劑的疏基(-SH)抓住微梁表面的金表面，和另一功能團抓住抗體，實現(xiàn)抗體在微梁鍍金層上的固定。例如先將巰基化試劑11-羧酸硫醇結(jié)合到微梁的金表面，活化其上的羧基，使之與抗體上的氨基結(jié)合來固定抗體(圖2)?；蛴靡环N巰基化試劑鹽酸硫醇亞胺，通過與抗體反應(yīng)，使抗體連接一個帶巰基的分子基團，再通過這個巰基將抗體聯(lián)結(jié)到微梁的金表面上(中國專利CN101407548)(見圖3)。這些方法固定抗體，存在如下共同的問題，(I)Y字形抗體(見圖I)的Fe段或Fab段的頂端部，會等概率的被固定在金表面上(見圖2、3)，沒有方向性[5]。而當(dāng)Fab段的頂端被固定在金表面上時，結(jié)合位點被遮擋，限制了抗體的抗原結(jié)合位點與抗原的充分結(jié)合，從而降低了微梁傳感靈敏度；(2)抗體與微梁之間存在不同數(shù)目C原子的單鏈分子，降低了抗原抗體反應(yīng)產(chǎn)生的應(yīng)力傳遞到梁上的效率。由此可見，中國專利CN101407548中公開的方法的靈敏度與酶聯(lián)免疫法相比僅提高數(shù)倍，還無法達到商業(yè)化或用于極微量被分析物的檢測。因此，在本領(lǐng)域中存在著改進微梁表面與抗體的結(jié)合和設(shè)計從而進一步提高微梁免疫傳感靈敏度和效率的需求。

發(fā)明內(nèi)容
綜上所述，在已有的微梁免疫傳感技術(shù)報道中，最突出的問題就是檢測靈敏度。影響微梁免疫傳感器靈敏度的因素主要有三個方面①抗體的靈敏度(或抗體與抗原結(jié)合的親和性)、②微梁上抗體的固定方法和③微梁的設(shè)計與信號讀出。由于抗體的靈敏度和微梁的規(guī)格與信號讀出方式在微梁免疫傳感器系統(tǒng)成型之后就無法改變，唯一可變的是微梁表面抗體的固定方法。一種合適的微梁表面抗體的修飾方法，能使固定在微梁表面的抗體與樣品溶液中的抗原充分結(jié)合，并能高效地將抗原抗體結(jié)合所產(chǎn)生的應(yīng)力變化傳遞到微梁表面。抗體在微梁表面固定的方向性、密度、活性以及抗體與微梁表面之間的聯(lián)接分子的長度與剛性都有可能影響最終檢測的靈敏度。鑒于現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明用于解決上述問題的技術(shù)方案是通過I)減少抗體分子結(jié)合位點以外的抗體分子質(zhì)量和體積，2)取消使用連接微梁鍍金表面與抗體分子的過渡分子層(巰基化試劑)，3)提供一種制備鍍金表面上定向固定有抗體片段的微梁的方法，達到提高微梁免疫檢測方法的靈敏度目的。抗體Ig分子的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1，包括兩個相同的抗原結(jié)合片段(Fab)和一個可結(jié)晶片段(Fe), Fab和Fe通過中間的鉸鏈區(qū)連接,構(gòu)成Y字形結(jié)構(gòu)。Fab的頂端為與抗原分子的結(jié)合位點。在免疫球蛋白抗體分子的“Y”字形四肽鏈結(jié)構(gòu)(圖I)中，由兩條完全相同的重鏈和兩條完全相同的輕鏈以二硫鍵連接而成。對于Fe段修飾在微梁的鍍金表面上時(抗體修飾的定向性好)，抗體對稱(Fab段)的兩個上端部抗原結(jié)合位點與抗原結(jié)合后產(chǎn)生的應(yīng)力，通過抗體Y字型的腿部(Fe段)傳遞到鍍金微梁表面?？贵w(IgG)的分子量約150kDa，如果被檢測的抗原分子分子量為數(shù)百Da，抗體抗原質(zhì)量比近1000。參與抗原分子結(jié)合的位點由重鏈和輕鏈的高變區(qū)(VH和VL)構(gòu)成，其與抗原分子的質(zhì)量比約150，而抗體分子上不參加與抗原分子結(jié)合的Fe段，其與抗原分子的質(zhì)量比近400。因此我們設(shè)想，如果能夠減少結(jié)合位點以外的抗體分子質(zhì)量和體積，保持抗體的結(jié)合位點朝向固定表面的外法線方向，就能夠提高應(yīng)力的傳遞效率和抗體在微梁表面的有效修飾密度，從而提高微梁免疫傳感的靈敏度。為此，在第一個方面，本發(fā)明提供了一種制備微懸臂梁的方法，包括以下步驟I)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁；2) 二硫鍵還原步驟使用二硫鍵還原劑處理所述抗體，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的半抗體片段；
3)固定步驟將步驟2)獲得的半抗體片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金表面上固定有所述半抗體片段的微懸臂梁。在第二個方面，本發(fā)明還提供了一種制備微懸臂梁的方法，包括以下步驟I)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁；2)酶解步驟用蛋白酶將所述抗體裂解成F(ab’)2片段和多個小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合；3) 二硫鍵還原步驟使用二硫鍵還原劑處理所述F(ab’)2片段，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的Fab’片段；4)固定步驟將步驟3)獲得的Fab’片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金表面上固定有所述Fab’片段的微懸臂梁。 在第三個方面，本發(fā)明還提供了一種制備微懸臂梁的方法，包括以下步驟I)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁；2) 二硫鍵還原步驟使用二硫鍵還原劑處理所抗體，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的半抗體片段；3)酶解步驟用蛋白酶將所述半抗體片段裂解成Fab’片段和多個小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合；4)固定步驟將步驟3)獲得的Fab’片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金層上固定有所述Fab’片段的微懸臂梁。在第四個方面，本發(fā)明提供了一種應(yīng)力傳感元件，其包括基于應(yīng)力的微懸臂梁，所述微懸臂梁的鍍金層上固定有抗體的半抗體片段或Fab’片段。所述微懸臂梁優(yōu)選通過本發(fā)明的方法制備而成。在第五個方面，本發(fā)明提供了一種基于應(yīng)力的微懸臂梁免疫傳感檢測系統(tǒng)，其包括本發(fā)明的應(yīng)力傳感元件。在第六個方面，本發(fā)明提供了一種使用微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)免疫傳感檢測待測樣品的方法，包括以下步驟I)提供對靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)，所述微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)包括反應(yīng)池和帶有鍍金層的基于應(yīng)力的微懸臂梁；2)使用二硫鍵還原劑處理所述抗體，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的半抗體片段；3)將步驟2)獲得的半抗體片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金層上固定有所述半抗體片段的微懸臂梁；4)將步驟3)獲得的固定有所述半抗體片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)的反應(yīng)池中；5)將待測樣品加入至步驟4)獲得的微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)中，檢測待測樣品中是否存在所述靶抗原。在第七個方面，本發(fā)明還提供了一種使用微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)免疫傳感檢測待測樣品的方法，包括以下步驟I)提供對靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)，所述微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)包括反應(yīng)池和帶有鍍金層的基于應(yīng)力的微懸臂梁；
2)用蛋白酶將所述抗體裂解成F(ab’)2片段和多個小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合；3)使用二硫鍵還原劑處理所述F (ab’)2片段，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的Fab’片段；4)將步驟3)獲得的Fab’片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金層上固定有所述Fab’片段的微懸臂梁；5)將步驟4)獲得的固定有所述Fab’片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)的反應(yīng)池中；6)將待測樣品加入至步驟5)獲得的微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)中，檢測待測樣品中是否存在所述靶抗原。在第八個方面，本發(fā)明還提供了一種使用微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)免疫傳感檢測待測樣品的方法，包括以下步驟I)提供對靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)，所述微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)包括反應(yīng)池和帶有鍍金層的基于應(yīng)力的微懸臂梁；2)使用二硫鍵還原劑處理所述抗體，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的半抗體片段；3)用蛋白酶將所述半抗體片段裂解成Fab’片段和多個小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合；4)將步驟3)獲得的Fab’片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金層上固定有所述Fab’片段的微懸臂梁；5)將步驟4)獲得的固定有所述Fab’片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)的反應(yīng)池中；6)將待測樣品加入至步驟5)獲得的微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)中，檢測待測樣品中是否存在所述靶抗原。本發(fā)明的有益效果鑒于微梁免疫傳感檢測技術(shù)中抗體固定的重要性及巰基化試劑參與抗體固定的復(fù)雜性，本發(fā)明用二硫鍵還原劑將抗體拆分成帶有巰基的對稱的半抗體片段，或在拆分之前或之后通過蛋白酶消化從而獲得Fab’片段，然后將獲得的半抗體片段或Fab’片段通過自帶的雙巰基固定到微梁的金表面上。結(jié)果表明，本發(fā)明的方法與現(xiàn)有的微梁免疫方法相比較具有以下優(yōu)點I)半抗體片段或Fab’片段通過自帶的雙巰基，直接固定到微梁鍍金表面，一步完成，操作簡單；2)半抗體片段或Fab’片段與微梁表面之間沒有附加的其它的分子，有利于應(yīng)力傳遞；3)減少了抗體抗原結(jié)合位點以外的抗體分子質(zhì)量和體積；4)減小了抗體的抗原結(jié)合位點到梁表面距離，提高應(yīng)力的傳遞效率；5)半抗體片段或Fab’片段與微梁表面之間的雙巰基固定的較單巰基分子鏈聯(lián)結(jié)的剛性要大，更有益于抗原抗體反應(yīng)的作用力傳遞到梁上；6)通過自身雙巰基一步完成固定，固定的抗原結(jié)合位點密度高,穩(wěn)定性好；
7)鍍金表面上固定的抗體的方向性好，易于與抗原結(jié)合。


圖I為典型的抗體分子結(jié)構(gòu)示意圖。圖2為羧酸硫醇類化合物和雙功能交聯(lián)劑法固定抗體示意圖。圖3為鹽酸硫醇亞胺法固定抗體示意圖。圖4為基于自身巰基(-SH)定向固定半抗體片段示意圖。圖5胃蛋白酶水解抗體形成抗體F (ab ’)2片段示意圖。圖6為通過自身巰基(-SH)定向固定抗體Fab’片段示意圖?！?br> 圖7為先用巰基乙胺將抗體拆分成半抗體，再用胃蛋白酶水解半抗體形成抗體Fab’片段,最后通過自身巰基(-SH)定向固定抗體Fab’片段示意圖。圖8為抗人參皂苷GS-Re巰基化抗體修飾微梁，檢測不同濃度抗原時微梁尖端的時間位移曲線。圖9為抗人參皂苷GS-Re半抗體片段修飾微梁，檢測不同濃度抗原時微梁尖端的時間位移曲線。
具體實施例方式定義抗體抗體(antibody)指機體的免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細胞或記憶細胞增殖分化成的漿細胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。典型的抗體分子具有4條多肽鏈的對稱結(jié)構(gòu)，包括2條較長、相對分子量較大的相同的重鏈(H鏈)；2條較短、相對分子量較小的相同的輕鏈(L鏈)。鏈間由二硫鍵和非共價鍵聯(lián)結(jié)形成一個由4條多肽鏈構(gòu)成的單體分子。輕鏈有K和λ兩種,重鏈有μ、δ、Y、ε和α五種。整個抗體分子可分為恒定區(qū)和可變區(qū)兩部分。在給定的物種中，不同抗體分子的恒定區(qū)都具有相同的或幾乎相同的氨基酸序列?？勺儏^(qū)位于"Y"的兩臂末端。在可變區(qū)內(nèi)有一小部分氨基酸殘基變化特別強烈，這些氨基酸的殘基組成和排列順序更易發(fā)生變異區(qū)域稱高變區(qū)。高變區(qū)位于分子表面，最多由17個氨基酸殘基構(gòu)成，少則只有2 3個。高變區(qū)氨基酸序列決定了該抗體結(jié)合抗原的特異性。一個抗體分子上的兩個抗原結(jié)合部位是相同的，位于兩臂末端稱抗原結(jié)合片段(antigen-binding fragment, Fab)。" Y"的柄部稱結(jié)晶片段(crystalline fragment, Fe),糖結(jié)合在 Fe 上。從結(jié)構(gòu)上來說，在本發(fā)明中，提及抗體時均指全抗體，即包括4條鏈和Fe段的抗體結(jié)構(gòu)(見圖I)。此外，從功能上來說，本發(fā)明中的“抗體”或“抗體片段”是指對靶抗原特異的抗體或抗體片段，即與抗原具有特異結(jié)合能力的抗體或抗體片段，如未特別說明，本發(fā)明中的抗體一般指單克隆抗體，抗體片段包括半抗體片段、F(ab’ )2片段、Fab’片段和Fab
坐寸ο半抗體片段如圖4中所示，通過二硫鍵還原劑將全抗體拆分成各自帶有巰基的對稱的片段，每個半抗體片段包含一條完整的輕鏈和一條完整重鏈以及Fe片段。F(ab’ )2 :如圖5中所示，Ig(immunoglobulin,免疫球蛋白)被胃蛋白酶水解在鉸鏈區(qū)重鏈間二硫鍵近C處切斷，形成一個雙價抗原結(jié)合片段簡稱F (ab’)2片段和一些小片段pFc'。由于F(ab’)2片段保留了結(jié)合相應(yīng)抗原的生物學(xué)活性，又避免了 Fe片段的抗原性可能引起的副作用，因而被廣泛用作生物制品。如白喉抗霉素和破傷風(fēng)抗霉素，經(jīng)胃蛋白酶水解后，因去掉了 Fe片段的抗原性而減少了超敏反應(yīng)的發(fā)生。pFc'片段最終被降解，無生物學(xué)活性。Fab (fragment of antigen binding):木瓜蛋白酶使Ig在鉸鏈區(qū)重鏈間二硫鍵近N端處切斷，形成兩個相同的單價抗原結(jié)合片段簡稱Fab段(如圖I中所示)，一個可結(jié)晶的片段簡稱 Fe (fragment crystallizable)段。Fab’ 是帶巰基的單價抗原結(jié)合片段(如圖6中所示，F(xiàn)(ab’ )2被二硫鍵還原劑拆分的各自帶有巰基的片段)?？乖Y(jié)合位點如圖I中所示，抗體分子與抗原相結(jié)合的部位，由Ig輕、重鏈的CDR1、CDR2 和 CDR3 組成。 抗原是一類能誘導(dǎo)免疫系統(tǒng)發(fā)生免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物(抗體或效應(yīng)細胞)發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì)?？乖哂忻庖咴院头磻?yīng)原性兩種性質(zhì)。根據(jù)抗原性質(zhì)分為兩類完全抗原和不完全抗原。完全抗原(complete antigen)是一類既有免疫原性，又有免疫反應(yīng)性的物質(zhì)。如大多數(shù)蛋白質(zhì)、細菌、病毒、細菌外毒素等都是完全抗原。不完全抗原，即半抗原(hapten)是只具有免疫反應(yīng)性，而無免疫原性的物質(zhì)，故又稱不完全抗原。二硫鍵還原劑二硫鍵又稱S-S鍵，是2個SH基被氧化而形成的-S-S-形式的硫原子間的鍵。在巰基乙胺(2-MEA)、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇等的硫化合物存在下能與之發(fā)生作用，還原成巰基(-SH)。這些硫化物就是本發(fā)明中所說的二硫鍵還原劑。在微量的二硫鍵還原劑存在的情況下抗體的重鏈間的二硫鍵被還原而其它的二硫鍵不被破壞。微懸臂梁(微梁)典型的微懸臂梁由氮化硅制成，如商品化的三角形微懸臂梁(Veeco Instruments)(尺寸長200um,腿寬20um,厚O. 6um)，單側(cè)鍍有60nm的金；抗體通常通過巰基化試劑的巰基(-SH)與金的共價結(jié)合以及巰基化試劑的另外一端(含有-COOH或-NH2等活性基團)與抗體結(jié)合來固定到微梁表面?；诒砻鎽?yīng)力檢測的微懸臂梁免疫傳感系統(tǒng)微懸臂梁免疫傳感系統(tǒng)主要由激光器、分光鏡、微懸臂梁、光電位置敏感器(PSD)、溫度控制系統(tǒng)、蠕動泵、以及數(shù)據(jù)分析處理裝置組成。典型的微懸臂梁免疫檢測方法的步驟如下將微懸臂梁固定到反應(yīng)池中，以蠕動泵控制流動緩沖液通過反應(yīng)池，待反應(yīng)池中氣泡排凈后以O(shè). lmL/min的速度流動緩沖液通過反應(yīng)池。反應(yīng)池的溫度控制在37 ±0.01 °C，室溫控制在27 ±0.01 °C。激光器發(fā)出一束激光經(jīng)分光鏡后照射在微懸臂梁的尖端，經(jīng)微懸臂梁反射后再經(jīng)分光鏡反射后照在PSD的靶面上。當(dāng)微懸臂梁的位移信號穩(wěn)定后，加入緩沖液稀釋的樣品溶液，PSD實時記錄微懸臂梁的尖端位移。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案在本發(fā)明中，抗體類型可以包括IgM、IgG、IgA、IgD、IgE。此外，抗體可以通過本領(lǐng)域中已知的任何方法制備，包括但不限于免疫法、雜交瘤法、化學(xué)合成法、基因工程法等。所述抗體還可以是基因工程修飾的雜合抗體，諸如人源化抗體，駱駝源化抗體等針對某種哺乳動物改造的抗體，例如人-鼠雜合抗體等。本發(fā)明中提到的待測樣品可以是生物樣品，例如來自于哺乳動物尤其是人的樣品，包括組織樣品(如病理組織切片、活檢、毛發(fā)、拭子等)、細胞樣品(如細胞涂片、血液涂片等)、體液樣品(如血液、尿液、腦脊液、唾液等)、排泄物(例如嘔吐物、汗液、糞便等)。所述待測樣品還可以是環(huán)境樣品，諸如土壤樣品、水樣、浮塵等；其他生產(chǎn)領(lǐng)域中獲得的樣品，諸如污水樣品、食品樣品等。本發(fā)明中所提及的抗原包括但不限于完全抗原和半抗原，其可以是本領(lǐng)域中所知曉的在本發(fā)明中所提到的待測樣品中可能存在的需要檢測的任何類型的抗原。本發(fā)明中提到的二硫鍵還原劑可以是巰基乙胺(2-MEA)、2_巰基乙醇、二硫蘇糖醇等。使用二硫鍵還原劑還原二硫鍵從而拆分抗體的方法和條件是本領(lǐng)域中公知的，例如，可以根據(jù)靶抗原的類型、大小和性質(zhì)等，遵照本領(lǐng)域中的已知方法或市售的相關(guān)試劑盒的說明書來選擇具體的二硫鍵還原劑和濃度、抗體濃度，兩者的用量和質(zhì)量比，溫育條件和溫育時間等。在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，在用二硫鍵還原劑處理抗體或抗體片段之后，可以進行透析去除未反應(yīng)的二硫鍵還原劑，以免影響帶巰基的抗體片段與微梁鍍金層的結(jié)合和固定。在本發(fā)明中，在酶解步驟中使用的蛋白酶可以根據(jù)要被水解的抗體的種類或其他 因素任意地選擇，只要其水解產(chǎn)物中包括帶有巰基的抗原抗體結(jié)合片段從而可以直接固定在微梁金表面上，所述抗原抗體結(jié)合片段包括不限于單價或二價的抗原抗體結(jié)合片段，諸如F(ab’)2、Fab’等。可選的蛋白酶諸如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶等，也可以使用兩者的組合。在本發(fā)明中，采用蛋白酶水解抗體Ig的方法和反應(yīng)條件是本領(lǐng)域公知的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以根據(jù)要水解的抗體的種類來確定合適的蛋白酶和相應(yīng)的水解條件。例如，當(dāng)選擇胃蛋白酶時，胃蛋白酶可以發(fā)揮其活性的環(huán)境，一般是指pH 2 5和在25 60°C下的環(huán)境。胃蛋白酶的最適pH和最適溫度根據(jù)其來源而定,一般為pH 2左右和37°C左右(可以根據(jù)市售產(chǎn)品的要求來確定)。在本發(fā)明中可以使用的胃蛋白酶的來源不受限制，只要其可以將抗體分子裂解為F(ab’)2片段或?qū)肟贵w片段裂解為Fab’片段。在本發(fā)明中，抗體或抗體片段與胃蛋白酶的質(zhì)量比不受限制，只要足以將抗體或抗體片段充分地水解為Fab’片段。兩者的質(zhì)量比可以根據(jù)常規(guī)方法來選擇，也可以同時參考所選擇胃蛋白酶的活性、所選擇的抗體類型等因素，一般可以在10 : I 200 : I的范圍內(nèi)選擇。另外，還可以選擇木瓜蛋白酶。在合適的條件下木瓜蛋白酶也可以將抗體水解為F(ab’)2片段，例如，在文獻Μ中在偏酸性(pH5. 5)的環(huán)境中在37°C下18小時木瓜蛋白酶可以將小鼠IgG1水解成F(ab’)2片段。在本發(fā)明中，抗體或抗體片段與木瓜蛋白酶的質(zhì)量比不受限制，只要足以將抗體或抗體片段充分地水解為Fab’片段。兩者的質(zhì)量比可以根據(jù)常規(guī)方法來選擇，也可以同時參考所選擇木瓜蛋白酶的活性、所選擇的抗體類型等因素，一般可以在10 I 200 I的范圍內(nèi)選擇。當(dāng)使用胃蛋白酶和木瓜蛋白酶的混合物時，由于兩者的活性環(huán)境均為酸性，因此根據(jù)具體的應(yīng)用適當(dāng)?shù)卣{(diào)整兩者的質(zhì)量比，從而可以根據(jù)需要調(diào)整所需的水解活性和水解時間。在本發(fā)明中，酶解步驟可以在拆分抗體之前或之后進行。當(dāng)在拆分抗體之前用蛋白酶水解時，即用蛋白酶水解抗體時，得到一個帶有兩個Fab’片段的F(ab’)2片段和多個小分子片段。當(dāng)在拆分抗體之后用蛋白酶水解時，即用蛋白酶水解半抗體片段時，得到了一個Fab’片段和多個小分子片段。兩種處理方式最終均可以得到帶有雙巰基的Fab’片段。在本發(fā)明中，抗體或抗體片段與微梁的鍍金層的結(jié)合可以使用本領(lǐng)域公知的方法和條件，例如在適于兩者結(jié)合的條件下溫育一段時間來結(jié)合(參見下面的實施例或市售產(chǎn)品的說明書)。在本發(fā)明中使用的微梁可以根據(jù)本領(lǐng)域中的公知方法自行制備，也可以購買市售商品，對此在本發(fā)明中并無任何限制。下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步說明，但需要說明的是下面的實施例不限制本發(fā)明的范圍。實施例實施例I固定半抗體片段的微梁實驗I利用巰基乙胺將抗體拆分成帶巰基的半抗體片段I.準(zhǔn)確稱取人參皂苷GS-Re單克隆抗體(購自美國USBiological公司)7. Omg溶于I. OmL PBS (含O. 15M NaCl和5. OmM EDTA, pH 6. 5)中得到濃度為7. Og/L的抗體溶液；2.稱取Img巰基乙胺(購自美國Sigma公司)溶于I. OmL水中得到濃度為I. Og/L的抗體拆分試劑；3.將I. OmL上述步驟I的抗體溶液和291. 2 μ L上述步驟2的抗體拆分試劑混合，室溫下反應(yīng)I. 5小時。4.用 2OmM 的 PBS 緩沖液(含 O. 15Μ NaCl 和 5· OmM EDTA, pH 6. 5)對上述步驟3的反應(yīng)液透析48小時，期間每3小時更換一次透析液，得到帶巰基的半抗體片段。用甘油等體積稀釋后-20°C保存。實驗2半抗體片段與微梁金表面的結(jié)合將洗凈并用氮氣吹干的鍍有金層的微梁(購自美國Veeco公司)放入酶標(biāo)板小孔中，加入150 μ L濃度為5. Omg/mL的實驗I步驟I獲得的抗人參皂苷GS-Re單克隆抗體片段，37°C溫育I小時，即得到固定有半抗體片段的微梁。實驗3直接競爭ELISA方法評價半抗體片段與微梁金表面的結(jié)合情況具體步驟如下I.清洗用鑷子小心取出上述固定了半抗體片段的微梁，用洗滌液(每IL洗滌液中含有 8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96g Na2HPO4 · 12H20、I. OmL Tween-20，其余為水)沖洗數(shù)
次，氮氣吹干；2.封閉將氮氣吹干后的微梁分別放入酶標(biāo)板中，加入100 μ L質(zhì)量百分含量為5%的BSA溶液(用PBS溶解)封閉，37°C溫育30分鐘；3.清洗用鑷子小心取出微梁，用洗滌液沖洗數(shù)次，氮氣吹干；4.競爭將氮氣吹干后的微梁分別放入酶標(biāo)板的兩個小孔中(做好標(biāo)記，抑制孔與非抑制孔)，抑制孔加入50 μ L經(jīng)樣品稀釋液(含有終濃度為O. Imo 1/L ρΗ7. 5的PBS、
O.I %體積百分含量的吐溫-20和O. I %質(zhì)量百分含量的明膠)稀釋的濃度為100mg/L的人參皂苷GS-Re溶液(購自美國Sigma公司)，非抑制孔加入50 μ L樣品稀釋液作為對照；然后再分別加入濃度為I. Omg/L的人參皂苷GS-Re過氧化物酶聯(lián)結(jié)物(購自美國Sigma公司)，37°C溫育30分鐘；5.清洗用鑷子小心取出上述抑制孔與非抑制孔中的微梁，用洗滌液沖洗數(shù)次，
氮氣吹干。6.顯色將氮氣吹干后的兩根微梁分別放入酶標(biāo)板的兩個小孔中，每孔加入100 μ L顯色溶液(TMB底物使用液與底物緩沖液按I : 9的體積比混勻，每IOmL上述混合液中加入4. Omg過氧化脲)，室溫顯色；7.終止15分鐘后，每孔加入50 μ L終止液(2. OM的硫酸溶液)終止反應(yīng)，取出微梁，450nm波長處分別讀取OD值。實驗設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明，抑制孔和非抑制孔的450nm波長下的吸光度值分別為O. 121和O. 727，說明抗人參皂苷GS-Re半抗體片段能有效結(jié)合微梁的金表面上并具有活性。實驗4微梁傳感器效果監(jiān)測
I.清洗無水乙醇、丙酮和PBS分別流經(jīng)微梁傳感系統(tǒng)，流速O. 5mL/min ；2.固定微梁將步驟2中固定有抗人參皂苷GS-Re抗體片段的微梁固定到微梁傳感系統(tǒng)的反應(yīng)池中，流動PBS通過反應(yīng)池子。排除反應(yīng)池中的氣泡后以O(shè). lmL/min流動PBS。3.調(diào)節(jié)光路調(diào)節(jié)激光器與PSD(光電位置敏感器)的位置使激光器發(fā)出的激光照在微梁的尖端反射后被PSD接收。4.樣品測定當(dāng)PSD接收的微梁偏轉(zhuǎn)信號穩(wěn)定后，加入2mL PBS稀釋的人參皂苷GS-Re標(biāo)準(zhǔn)樣品。通過PSD實時記錄微梁尖端位移信息。圖9為抗人參皂苷GS-Re半抗體片段修飾微梁，檢測不同濃度抗原時微梁尖端的時間位移曲線。檢測了三個濃度I. 0ng/mL、0. lng/mL、0. 02ng/mL的樣品得到的微梁尖端位移幅值分別為77、58和32nm。不同濃度的人參皂苷GS-Re標(biāo)準(zhǔn)樣品可以產(chǎn)生不同程度的微梁位移，說明抗人參皂苷GS-Re半抗體片段能有效結(jié)合到微梁的金表面上并能對人參皂苷GS-Re進行定量檢測。并且具有很高的檢測靈敏度(圖8為利用鹽酸硫醇亞胺做為巰基化試劑來巰基化抗體后將抗體固定到微梁上(中國專利CN101407548)對人參皂苷進行檢測的結(jié)果)。結(jié)論用本發(fā)明的半抗體片段修飾的微梁和完整抗體修飾的微梁進行實驗測試對比，檢測不同濃度的人參皂苷GS-Re抗原時，微梁尖端的時間位移響應(yīng)曲線(圖9和圖8)顯示，在微梁位移響應(yīng)為20納米左右時，半抗體片段修飾和巰基化抗體修飾的檢測人參皂苷GS-Re抗原濃度分別為O. 02ng/mL和O. 5ng/mL,靈敏度提高了約20倍。實施例2抗體Fab’片段修飾的微梁實驗I抗體F(ab’)2片段的制備I.用O. lmol/L檸檬酸緩沖液(ρΗ3· 5)溶解人參皂苷GS-Re單克隆抗體(IgG)(購自美國 USBiological 公司)至 10mg/ml ；2.用O. lmol/L朽1檬酸緩沖液(ρΗ3· 5)溶解胃蛋白酶(pepsin)(購自美國Sigma公司)至lmg/ml ；3.將IgG:胃蛋白酶按質(zhì)量比100 I混合，放在37°C水浴箱中2小時，然后加入3mol/L Tris使pH在7左右以終止反應(yīng)。4.用 2OmM 的 PBS 緩沖液(含 O. 15M NaCl 和 5· OmM EDTA, pH 6. 5)對上述步驟3的反應(yīng)混合液透析48小時，期間每3小時更換一次透析液，得到抗體F(ab’)2片段。
實驗2抗體片段Fab’的制備I.用去離子水溶解巰基乙胺(2-MEA)(購自美國Sigma公司)至lmg/ml ；2.將步驟I中制備的F(ab’ )2 :2_MEA按質(zhì)量比20 I進行混合，放在37°C水浴箱中2小時；3.用 20mM 的 PBS 緩沖液(含 O. 15M NaCl 和 5. OmM EDTA, pH 6. 5)對上述步驟 2的反應(yīng)混合液透析48小時，期間每3小時更換一次透析液，得到抗體Fab’片段。用甘油等體積稀釋后保存在-20°C環(huán)境下。實驗3將Fab’抗體片段修飾到微梁金表面上將洗凈并用氮氣吹干的鍍有金膜的微梁(購自美國Veeco公司)放入酶標(biāo)板小孔中，加入150 μ L濃度為5. Omg/mL的上述步驟2制得的Fab’抗體片段溶液，放在37°C水浴箱中2小時，即得到固定有抗體Fab’片段的微梁。·實驗4ELISA直接競爭法效果檢測I.清洗用鑷子小心取出上述固定了抗體Fab’片段的微懸臂梁，用洗滌液(每IL洗滌液中含有 8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96gNa2HP04 · 12H20U. OmL Tween-20，其余為水)沖洗數(shù)次，氮氣吹干；2.封閉將氮氣吹干后的微懸臂梁分別放入酶標(biāo)板中，加入ΙΟΟμ L質(zhì)量百分含量為5%的BSA溶液(用PBS溶解)封閉，37°C溫育30分鐘；3.清洗用鑷子小心取出微懸臂梁，用洗滌液沖洗數(shù)次，氮氣吹干；4.競爭將氮氣吹干后的微懸臂梁分別放入酶標(biāo)板的兩個小孔中(做好標(biāo)記，抑制孔與非抑制孔)，抑制孔加入50 μ L經(jīng)樣品稀釋液(含有終濃度為O. lmol/L pH7. 5的PBS,O. 1%體積百分含量的吐溫-20和O. 1%質(zhì)量百分含量的明膠)稀釋的濃度為IOOmg/L的人參皂苷GS-Re溶液(購自美國Sigma公司)，非抑制孔加入50 μ L樣品稀釋液作為對照；然后再分別加入濃度為I. Omg/L的人參皂苷GS-Re過氧化物酶聯(lián)結(jié)物(購自美國Sigma公司)，37°C溫育30分鐘;5.清洗用鑷子小心取出上述抑制孔與非抑制孔中的微懸臂梁，用洗滌液沖洗數(shù)次，氮氣吹干；6.顯色將氮氣吹干后的兩根微懸臂梁分別放入酶標(biāo)板的兩個小孔中，每孔加入100 μ L顯色溶液(TMB底物使用液與底物緩沖液按I : 9的體積比混勻，每IOmL上述混合液中加入4. Omg過氧化脲)，室溫顯色；7.終止15分鐘后，每孔加入50 μ L終止液(2. OM的硫酸溶液)終止反應(yīng)，取出微懸臂梁，450nm波長處分別讀取OD值。實驗設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明，抑制孔和非抑制孔的450nm波長下的吸光度值分別為0. 178和0. 853，說明抗人參皂苷GS-Re抗體Fab’片段能有效結(jié)合微懸臂梁的金表面上。實驗5微梁傳感器效果檢測I.清洗無水乙醇、丙酮和PBS分別流經(jīng)微梁傳感系統(tǒng)，流速0. 5mL/min ；2.固定微梁將實驗3中修飾有抗人參皂苷GS-Re抗體片段Fab’的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感系統(tǒng)的反應(yīng)池中，流動PBS通過反應(yīng)池子。排除反應(yīng)池中的氣泡后以
0.lmL/min 流動 PBS。3.調(diào)節(jié)光路調(diào)節(jié)激光器與PSD(光電位置敏感器)的位置使的激光器發(fā)出的激光照在微梁的尖端并被PSD接收。4.樣品測定當(dāng)PSD接收的微梁偏轉(zhuǎn)信號穩(wěn)定后，加入2mL PBS稀釋的人參皂苷GS-Re標(biāo)準(zhǔn)樣品。通過PSD實時記錄微梁尖端位移信息。檢測了三個濃度I. 0ng/mL、0. lng/mL、0. 01ng/mL的樣品得到的微梁尖端位移幅值分別為79、61和21nm ;不同濃度的人參皂苷GS-Re標(biāo)準(zhǔn)樣品可以產(chǎn)生不同程度的微懸臂梁位移，說明抗人參皂苷GS-Re抗體Fab’片段能有效結(jié)合到微懸臂梁的金表面上并能對人參皂苷GS-Re進行檢測。結(jié)論 用本發(fā)明的抗體Fab ’片段修飾的微梁和完整抗體修飾的微梁進行實驗測試對比，檢測不同濃度的人參皂苷GS-Re抗原時，在微梁位移響應(yīng)為20納米左右時，抗體Fab’片段修飾和巰基化抗體修飾檢測人參皂苷GS-Re抗原濃度分別為O. 01ng/mL和O. 5ng/mL,靈敏度提高了近40倍。實施例3抗體Fab’片段修飾的微梁實驗I利用巰基乙胺將抗體拆分成帶巰基的半抗體片段I.準(zhǔn)確稱取人參皂苷GS-Re單克隆抗體(購自美國USBiological公司)7. Omg溶于I. OmL PBS (含O. 15M NaCl和5. OmM EDTA，pH 6. 5)中得到濃度為7. Og/L的抗體溶液；2.稱取Img巰基乙胺(購自美國Sigma公司)溶于I. OmL水中得到濃度為I. Og/L的抗體拆分試劑；3.將I. OmL上述步驟I的抗體溶液和291. 2 μ L上述步驟2的抗體拆分試劑混合，室溫下反應(yīng)I. 5小時。4.用 20mM 的 PBS 緩沖液(含 O. 15M NaCl 和 5. OmM EDTA, pH 6. 5)對上述步驟 3的反應(yīng)液透析48小時，期間每3小時更換一次透析液，得到帶巰基的半抗體片段。用甘油等體積稀釋后-20°C保存。實驗2抗體Fab’片段的制備I.用O. lmol/L朽1檬酸緩沖液(ρΗ3· 5)溶解胃蛋白酶(pepsin)(購自美國Sigma公司)至lmg/ml ；2.將步驟I中制備的半抗體片段與胃蛋白酶按質(zhì)量比100 I混合反應(yīng)，放在37°C水浴箱中2小時，然后加入3mol/L Tris使pH在7左右以終止反應(yīng)。3.用 20mM 的 PBS 緩沖液(含 O. 15M NaCl 和 5. OmM EDTA, pH 6. 5)對上述步驟 2的反應(yīng)混合液透析48小時，期間每3小時更換一次透析液，得到抗體Fab’片段。用甘油等體積稀釋后保存在-20°C環(huán)境下。實驗3將抗體Fab’片段修飾到微梁金表面上將洗凈并用氮氣吹干的鍍有金膜的微梁(購自美國Veeco公司)放入酶標(biāo)板小孔中，加入150 μ L濃度為5. Omg/mL的上述步驟2制得的抗體Fab’片段溶液，放在37°C水浴箱中2小時，即得到固定有抗體Fab’片段的微梁。實驗4ELISA直接競爭法效果檢測I.清洗用鑷子小心取出上述固定了抗體Fab’片段的微懸臂梁，用洗滌液(每IL洗滌液中含有 8. Og NaCUO. 2g KH2PO4,2. 96g Na2HPO4 · 12H20、I. OmL Tween-20，其余為水)沖洗數(shù)次，氮氣吹干；
2.封閉將氮氣吹干后的微懸臂梁分別放入酶標(biāo)板中，加入ΙΟΟμ L質(zhì)量百分含量為5%的BSA溶液(用PBS溶解)封閉，37°C溫育30分鐘；
3.清洗用鑷子小心取出微懸臂梁，用洗滌液沖洗數(shù)次，氮氣吹干；4.競爭將氮氣吹干后的微懸臂梁分別放入酶標(biāo)板的兩個小孔中(做好標(biāo)記，抑制孔與非抑制孔)，抑制孔加入50 μ L經(jīng)樣品稀釋液(含有終濃度為O. lmol/L pH 7. 5的PBS,O. I %體積百分含量的吐溫-20和O. 1%質(zhì)量百分含量的明膠)稀釋的濃度為100mg/L的人參皂苷GS-Re溶液(購自美國Sigma公司)，非抑制孔加入50 μ L樣品稀釋液作為對照；然后再分別加入濃度為I. 0mg/L的人參皂苷GS-Re過氧化物酶聯(lián)結(jié)物(購自美國Sigma公司)，37°C溫育30分鐘;5.清洗用鑷子小心取出上述抑制孔與非抑制孔中的微懸臂梁，用洗滌液沖洗數(shù)次，氮氣吹干；6.顯色將氮氣吹干后的兩根微懸臂梁分別放入酶標(biāo)板的兩個小孔中，每孔加入100 μ L顯色溶液(TMB底物使用液與底物緩沖液按I : 9的體積比混勻，每IOmL上述混合液中加入4. Omg過氧化脲)，室溫顯色；7.終止15分鐘后，每孔加入50 μ L終止液(2. OM的硫酸溶液)終止反應(yīng)，取出微懸臂梁，450nm波長處分別讀取OD值。實驗設(shè)三次重復(fù)，結(jié)果表明，抑制孔和非抑制孔的450nm波長下的吸光度值分別為0. 152和0. 763，說明抗人參皂苷GS-Re抗體Fab’片段能有效結(jié)合微懸臂梁的金表面上。實驗5微梁傳感器效果檢測I.清洗無水乙醇、丙酮和PBS分別流經(jīng)微梁傳感系統(tǒng)，流速0. 5mL/min ；2.固定微梁將實驗3中修飾有抗人參皂苷GS-Re抗體Fab’片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感系統(tǒng)的反應(yīng)池中，流動PBS通過反應(yīng)池子。排除反應(yīng)池中的氣泡后以
0.lmL/min 流動 PBS。3.調(diào)節(jié)光路調(diào)節(jié)激光器與PSD(光電位置敏感器)的位置使的激光器發(fā)出的激光照在微梁的尖端并被PSD接收。4.樣品測定當(dāng)PSD接收的微梁偏轉(zhuǎn)信號穩(wěn)定后，加入2mL PBS稀釋的人參皂苷GS-Re標(biāo)準(zhǔn)樣品。通過PSD實時記錄微梁尖端位移信息。檢測三個濃度I. 0ng/mL、0. lng/mL、0. 015ng/mL的樣品得到的微梁尖端位移幅值分別為68、42和22nm ;不同濃度的人參皂苷GS-Re標(biāo)準(zhǔn)樣品可以產(chǎn)生不同程度的微懸臂梁位移，說明抗人參皂苷GS-Re抗體Fab’片段能有效結(jié)合到微懸臂梁的金表面上并能對人參皂苷GS-Re進行檢測。結(jié)論通過先拆分后酶解的方法制備的本發(fā)明的抗體Fab’片段修飾的微梁和完整抗體修飾的微梁進行實驗測試對比，檢測不同濃度的人參皂苷GS-Re抗原時，在微梁位移響應(yīng)為20納米左右時，抗體Fab’片段修飾和巰基化抗體修飾檢測人參皂苷GS-Re抗原濃度分別為0. 015ng/mL和0. 5ng/mL,靈敏度提高了近33倍。通過上述非限制性的實施例，可以看出，本發(fā)明的方法和通過本發(fā)明的方法制備的微懸臂梁在免疫傳感檢測技術(shù)中與現(xiàn)有技術(shù)的微梁法相比可以提高20-40倍，相當(dāng)于常規(guī)酶聯(lián)免疫法的200-400倍，實現(xiàn)了本發(fā)明的目的，即在食品安全、環(huán)境污染、生物醫(yī)學(xué)、科學(xué)研究和生產(chǎn)制造等領(lǐng)域中監(jiān)控和檢測極微量被分析物的可能性和實用性，完全可以實現(xiàn)實際的商業(yè)化應(yīng)用。參考文獻[l]Koutilya R. Buchapudi, Xin Huang, Xin Yang，HaiFeng Ji and ThomasThundat, Microcantilever biosensors for chemicals and bioorganisms. Analyst,2011，136，1539-1556[2]Weiming Tan，Yuan Huang，Tiegui Nan，Changguo Xue,Zhaohu Li，QingchuanZhang, and Baomin Wang, Development of Protein A Functionalized MicrocantileverImmunosensors for the Analyses ofSmaII Molecules at part per trillion Levels.Analysis Chemistry,2010，82(2)，615-620[3] Hongwei Zhao ；Changguo Xue ；Tiegui Nan ；Guiyu Tan ；Zhaohu Li; Qing X. Li ；Qingchuan Zhang ；Baomin Wang, Detection of Copper Ions UsingMicrocantilever Immunosensors and Enzyme-linked Immunosorbent Assay, AnalyticaChimica Acta，2010，676，81-86，[4]Changguo Xue, Hongwei Zhao, Yanyun Chen, Baomin Wang, QingchuanZhang, Xiaoping Wu, Development of sulfhydrylated antibody functionalizedmicrocantilever immunosensor for taxol， Sensors and Actuators B，2011，156，863-866[5] A. Kausai te-Minkst imi ene，A. Ramanav i c i ene，J. Kirlyte , andA. Ramanavicius. Comparative Study of Random and Oriented AntibodyImmobilization Techniques on the Binding Capacity of Immunosensor. AnalysisChemistry,2010，82，6401-6408[6] [J]仇凱等，木瓜蛋白酶制備抗人肝癌抗F(ab’)2&Fab片段。第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，1995 ；16(6) :414-416。
權(quán)利要求
1.一種制備微懸臂梁的方法，包括以下步驟 1)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁； 2)二硫鍵還原步驟使用二硫鍵還原劑處理所述抗體，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的半抗體片段； 3)固定步驟將步驟2)獲得的半抗體片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金表面上固定有所述半抗體片段的微懸臂梁。
2.一種制備微懸臂梁的方法，包括以下步驟 1)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁； 2)酶解步驟用蛋白酶將所述抗體裂解成F(ab’)2片段和多個小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合； 3)二硫鍵還原步驟使用二硫鍵還原劑處理所述F(ab’ )2片段，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的~■硫鍵還原成疏基，從而得到兩個對稱的帶有疏基的Fab’片段； 4)固定步驟將步驟3)獲得的Fab’片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金表面上固定有所述Fab’片段的微懸臂梁。
3.一種制備微懸臂梁的方法，包括以下步驟 1)提供抗體和帶有鍍金層的微懸臂梁； 2)二硫鍵還原步驟使用二硫鍵還原劑處理所抗體，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的半抗體片段； 3)酶解步驟用蛋白酶將所述半抗體片段裂解成Fab’片段和多個小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合； 4)固定步驟將步驟3)獲得的Fab’片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金層上固定有所述Fab’片段的微懸臂梁。
4.一種應(yīng)力傳感元件，其包括基于應(yīng)力的微懸臂梁，所述微懸臂梁的鍍金層上固定有抗體的半抗體片段或Fab’片段。
5.一種基于應(yīng)力的微懸臂梁免疫傳感檢測系統(tǒng)，其包括權(quán)利要求4的應(yīng)力傳感元件。
6.一種使用微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)免疫傳感檢測待測樣品的方法，包括以下步驟 1)提供對靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)，所述微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)包括反應(yīng)池和帶有鍍金層的基于應(yīng)力的微懸臂梁； 2)使用二硫鍵還原劑處理所述抗體，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的半抗體片段； 3)將步驟2)獲得的半抗體片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金層上固定有所述半抗體片段的微懸臂梁； 4)將步驟3)獲得的固定有所述半抗體片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)的反應(yīng)池中； 5)將待測樣品加入至步驟4)獲得的微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)中，檢測待測樣品中是否存在所述靶抗原。
7.一種使用微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)免疫傳感檢測待測樣品的方法，包括以下步驟 I)提供對靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)，所述微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)包括反應(yīng)池和帶有鍍金層的基于應(yīng)力的微懸臂梁；2)用蛋白酶將所述抗體裂解成F(ab’)2片段和多個小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合； 3)使用二硫鍵還原劑處理所述F(ab’)2片段，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的Fab’片段； 4)將步驟3)獲得的Fab’片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金層上固定有所述Fab’片段的微懸臂梁； 5)將步驟4)獲得的固定有所述Fab’片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)的反應(yīng)池中； 6)將待測樣品加入至步驟5)獲得的微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)中，檢測待測樣品中是否存在所述靶抗原。
8.一種使用微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)免疫傳感檢測待測樣品的方法，包括以下步驟 1)提供對靶抗原特異的抗體和微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)，所述微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)包括反應(yīng)池和帶有鍍金層的基于應(yīng)力的微懸臂梁； 2)使用二硫鍵還原劑處理所述抗體，使得所述抗體鉸鏈區(qū)的二硫鍵還原成巰基，從而得到兩個對稱的帶有巰基的半抗體片段； 3)用蛋白酶將所述半抗體片段裂解成Fab’片段和多個小分子片段，所述蛋白酶選自胃蛋白酶、木瓜蛋白酶或其組合； 4)將步驟3)獲得的Fab’片段與鍍有金層的微懸臂梁結(jié)合，得到鍍金層上固定有所述Fab’片段的微懸臂梁； 5)將步驟4)獲得的固定有所述Fab’片段的微懸臂梁固定到微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)的反應(yīng)池中； 6)將待測樣品加入至步驟5)獲得的微懸臂梁傳感檢測系統(tǒng)中，檢測待測樣品中是否存在所述靶抗原。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項所述的方法、應(yīng)力傳感元件或免疫傳感檢測系統(tǒng)，其特征在于所述二硫鍵還原劑選自巰基乙胺、2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇中的一種或多種。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法、應(yīng)力傳感元件或免疫傳感檢測系統(tǒng)，其特征在于所述抗體為IgM、IgG、IgA、IgD、IgE中的任一種。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種抗體片段修飾的微懸臂梁，其鍍金表面上定向固定有半抗體片段或抗體的Fab’片段，提高了基于表面應(yīng)力效應(yīng)的微懸臂梁免疫檢測方法的靈敏度。本發(fā)明還公開了所述微懸臂梁的制備方法、基于所述抗體片段修飾的微懸臂梁的免疫傳感檢測系統(tǒng)和檢測方法。
文檔編號G01L1/04GK102951598SQ20111023888
公開日2013年3月6日 申請日期2011年8月19日 優(yōu)先權(quán)日2011年8月19日
發(fā)明者張青川, 吳尚犬, 鄔林, 伍小平 申請人:中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)