專利名稱：測(cè)定三聚氰胺含量的電化學(xué)免疫傳感器及制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)和分析化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種三聚氰胺的檢測(cè)裝置和方法，具體地說(shuō)是一種應(yīng)用于測(cè)定食品和飼料中違禁添加物三聚氰胺的電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法，以及利用該傳感器定量檢測(cè)三聚氰胺含量的方法。
背景技術(shù)：
三聚氰胺(Melamine)是一種重要的化工原料，常用于制造防火阻燃材料三聚氰胺樹脂，也可用作減水劑和甲醛清潔劑等，在部分亞洲國(guó)家，還被用來(lái)制造化肥。由于牛奶和飼料工業(yè)常用的蛋白質(zhì)含量檢測(cè)方法“凱氏定氮法”，是通過測(cè)定含氮量來(lái)估算蛋白質(zhì)含量，要求蛋白質(zhì)平均含氮量為16 %左右，而三聚氰胺的含氮量約為66 %，因此三聚氰胺常被不法商人用作添加劑，以提升牛奶和飼料中的蛋白質(zhì)含量指標(biāo)，使劣質(zhì)牛奶和飼料通過檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)的檢測(cè)。研究表明，三聚氰胺能誘發(fā)動(dòng)物腎衰竭并導(dǎo)致死亡。三聚氰胺在體內(nèi)的代謝屬于不活潑代謝或惰性代謝，即它在體內(nèi)不會(huì)迅速發(fā)生任何類型的代謝變化。單胃動(dòng)物以原體形式或同系物形式排出三聚氰胺，而不是代謝產(chǎn)物的形式。2008年發(fā)生的三聚氰胺毒奶粉事件，使得分析化學(xué)領(lǐng)域掀起了研究三聚氰胺檢測(cè)方法的熱潮，國(guó)內(nèi)外開始對(duì)三聚氰胺及其檢測(cè)產(chǎn)生高度關(guān)注。三聚氰胺的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有重量法、升華法等，但只限于對(duì)三聚氰胺原料的檢測(cè)。 近幾年發(fā)展起來(lái)的方法有高效液相色譜法、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法、酶聯(lián)免疫吸附法等。但是這些分析方法需要大型分析儀器，操作過程繁瑣，前處理過程復(fù)雜， 不能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。三聚氰胺的檢測(cè)的方法中還包括電化學(xué)檢測(cè)方法，如CN20102(^99766. 1公開了一種用于快速檢測(cè)三聚氰胺的修飾電極，包括基底電極；設(shè)置于基底電極外表面的PDDA 膜；以及設(shè)置于PDDA膜外表面的FDU膜。CN201010235974. X公開了一種用于三聚氰胺檢測(cè)的碳納米管修飾電極制備方法，將碳納米管分散在DMF、四氫呋喃、甲醇、乙醇、水等溶劑中，再將此納米管溶液和殼聚糖、Nafion、聚乙烯醇等粘合劑混合，分散均勻后將其涂在電極表面制成碳納米管修飾電極。該電極能夠檢測(cè)三聚氰胺，最低檢測(cè)限為10-13mol/L。 CN200810234859. 3披露了一種奶制品中三聚氰胺的電化學(xué)快速檢測(cè)方法，其特征在于采用電化學(xué)法，以含碳的材料作為工作電極，將奶制品溶于酸性電解質(zhì)溶液中，在較正的電位下作循環(huán)伏安掃描電解1 10分鐘，根據(jù)所制得的伏安曲線，對(duì)奶制品中是否含有三聚氰胺進(jìn)行初步定性分析和定量分析。所述檢測(cè)方法，在靈敏度和特異性方面還有待進(jìn)一步提高。自上世紀(jì)80年代以來(lái)，生物傳感器的研究與開發(fā)呈現(xiàn)出突飛猛進(jìn)的局面，各類傳感器應(yīng)運(yùn)而生。其中，與測(cè)定抗原抗體反應(yīng)有關(guān)的傳感器稱為免疫傳感器?？乖贵w結(jié)合前后可導(dǎo)致多種信號(hào)的改變，如在重量、光學(xué)、熱學(xué)、電化學(xué)等方面。免疫傳感器在檢測(cè)三聚氰胺上已得到廣泛應(yīng)用，如各種基于抗體和抗原反應(yīng)的用于三聚氰胺檢測(cè)的免疫試劑(盒)。由于電化學(xué)分析具有的以下特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)，如可以實(shí)現(xiàn)在體檢測(cè)，不受樣品顏色、濁度的影響(即樣品可以不經(jīng)處理，不需分離)，且所需儀器設(shè)備相對(duì)簡(jiǎn)單，因此應(yīng)用前景看好。本發(fā)明旨在通過一種三聚氰胺檢測(cè)的直接電化學(xué)生物免疫傳感器的制備，建立一種檢出限低、線性范圍寬、靈敏度和特異性高、快速現(xiàn)場(chǎng)測(cè)定三聚氰胺含量的方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法，所述的傳感器具有很高的靈敏度和專一性，可用于三聚氰胺檢測(cè)。本發(fā)明的另一目的還在于提供一種簡(jiǎn)單、快速、高效測(cè)定牛奶等食品中違禁添加物三聚氰胺殘留量的檢測(cè)方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的采用的技術(shù)方案如下
一種檢測(cè)三聚氰胺的電化學(xué)免疫傳感器，包括基底電極，其特征在于所述的基底電極表面修飾石墨烯-三聚氰胺-殼聚糖復(fù)合物，并以牛血清蛋白封閉非特異性活性位點(diǎn)。所述的基底電極優(yōu)選玻碳電極。本發(fā)明的另一目的是提供一種所述免疫傳感器的制備方法，技術(shù)方案如下
一種檢測(cè)三聚氰胺的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征在于將石墨烯的殼聚糖懸浮液超聲分散后與三聚氰胺混合，將混合液滴涂在電極表面，利用殼聚糖將石墨烯和三聚氰胺包被并固定于電極表面，并將電極浸泡在牛血清蛋白(BSA)溶液中，封閉電極表面的非特異性的活性位點(diǎn)。所述的基底電極優(yōu)選玻碳電極。所述的免疫傳感器的制備，更具體和更優(yōu)選的方法包括如下步驟
1)石墨烯-殼聚糖懸浮液的配制將0.05M的HCl加熱至80 90°C，加入稱量好的殼聚糖，攪拌溶解，冷卻后加入濃度為0. IM的NaOH，調(diào)節(jié)pH至5，配得lmg/mL的殼聚糖溶液；
準(zhǔn)確稱取5g石墨烯樣品于2mL殼聚糖溶液中，超聲分散lh，制得石墨烯-殼聚糖懸浮
液；
2)玻碳電極處理直徑為3mm的玻碳電極用分別用1.0和0. 3Mm的Al2O3粉乳液打磨拋光后，分別在乙醇和水中各超聲清洗:3min ；
3)電極表面修飾將4μ L石墨烯-殼聚糖懸浮液與2 μ L濃度為0. 2mg/mL的三聚氰胺水溶液混合，滴涂于步驟2)制得的玻碳電極表面，40°C下烘干30min ；
4)非特異性的活性位點(diǎn)封閉表面修飾后的電極于37°C下浸泡在5%的BSA溶液中 30min，以封閉剩余的活性位點(diǎn)，制得所述的電化學(xué)免疫傳感器。所述的石墨烯的制備，可以氧化石墨(GO)作為前驅(qū)體，通過氧化石墨的還原和石墨烯的功能化得到性能優(yōu)異的石墨烯。上述免疫傳感器可用于測(cè)定三聚氰胺的含量。電極在含有三聚氰胺抗體和游離的己烯雌酚的溶液中孵育時(shí)，溶液中游離的三聚氰胺和固定在電極表面的三聚氰胺與溶液中三聚氰胺抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)，三聚氰胺抗體與電極表面固定的三聚氰胺反應(yīng)后， 抗體吸附在電極表面。游離的三聚氰胺濃度越高，固定在電極上的三聚氰胺結(jié)合的抗體越少。WK3Fe(CN)6為探針，進(jìn)行差分脈沖伏安(DPV)掃描，抗體在電極表面的吸附，會(huì)使 !^e (CN)63_Λ_氧化還原峰電流值降低。因此利用競(jìng)爭(zhēng)性免疫反應(yīng)機(jī)制，不同濃度的三聚氰胺孵育后的電極，在1(3狗(0幻6溶液中差分脈沖伏安法(DPV)得到的曲線峰電流不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著三聚氰胺濃度在孵育液中的增加，DPV峰電流增大，且峰電流增大值與三聚氰胺濃度呈線性，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)三聚氰胺的定量檢測(cè)。因此，本發(fā)明還涉及一種基于所述的免疫傳感器檢測(cè)三聚氰胺的方法，包括以下步驟
1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的含有不同濃度游離三聚氰胺的PH為 7. 4的磷酸緩沖溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中含有相同濃度的三聚氰胺抗體；
2)建立工作曲線將免疫傳感器分別浸入標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育，孵育后用磷酸緩沖溶液沖洗免疫傳感器，在K3[Fe (CN)6]溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安(DPV)掃描，記錄響應(yīng)電流；空白標(biāo)樣的響應(yīng)電流為Ici,含有游離三聚氰胺的標(biāo)樣的響應(yīng)電流為Ix，響應(yīng)電流的增加Δ I (Δ I=Ix-I0)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺濃度C成正比，繪制Δ I-C標(biāo)準(zhǔn)曲線，或采用線性回歸法得到Δ I-C線性回歸方程；
3)三聚氰胺測(cè)定將待測(cè)樣品配制為含有與步驟1)相同濃度三聚氰胺抗體的磷酸緩沖溶液，按照與步驟2)相同的方法對(duì)免疫傳感器進(jìn)行孵育和差分脈沖伏安掃描，記錄響應(yīng)電流；根據(jù)響應(yīng)電流的增加Δ I和標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到三聚氰胺含量。所述的KJFe(CN)6]溶液的濃度優(yōu)選為2 mM。免疫反應(yīng)條件優(yōu)選在37°C下孵育60 min。所述的三聚氰胺抗體的濃度優(yōu)選4 μ g/mL。所述的步驟3)優(yōu)選采用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)定。上述方法檢測(cè)三聚氰胺含量，最低檢測(cè)限為0. 2 ng/ml，線性范圍5 1500 ng/ml。本發(fā)明的免疫傳感器及其三聚氰胺含量檢測(cè)方法基于以下原理。由于石墨烯擁有優(yōu)異的電學(xué)性能，其重要用途之一是可以用來(lái)制備高性能的納米復(fù)合材料，但石墨烯難溶于水及常用的有機(jī)溶劑。有研究表明，石墨烯在殼聚糖中分散時(shí)， 兩者之間將發(fā)生有效的負(fù)荷轉(zhuǎn)移，兩者之間的相互作用使得石墨烯在殼聚糖中呈分子水平分散，具有很好的分散效果。本發(fā)明將石墨烯的殼聚糖溶液超聲分散后，與三聚氰胺混合并滴涂在電極上，利用殼聚糖的粘性將石墨烯和三聚氰胺包被并固定于電極上，并將電極浸泡在BSA溶液中，以封閉非特異性的活性位點(diǎn)。免疫傳感器的電極表面修飾見圖1。同時(shí)，本發(fā)明對(duì)三聚氰胺的檢測(cè)是基于抗體和抗原之間特定反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)模式。(a) 當(dāng)電極浸入含有三聚氰胺抗體和游離三聚氰胺的溶液中時(shí)，固定在電極上的三聚氰胺抗原與溶液中游離的三聚氰胺與三聚氰胺抗體發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)。(b)基于三聚氰胺抗體和抗原之間特定反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)模式，當(dāng)電極浸入到含有特定抗體的溶液時(shí)，三聚氰胺抗體與抗原的特異反應(yīng)使抗體吸附在電極上。(c)抗體-抗原復(fù)合物在電極表面的形成導(dǎo)致電極產(chǎn)生位阻， 減少了電極活動(dòng)區(qū)域，阻礙了探針離子到達(dá)電極，峰值電流下降。因此，可以根據(jù)免疫傳感器各階段電化學(xué)信號(hào)的差異對(duì)溶液中游離的三聚氰胺進(jìn)行檢測(cè)。本發(fā)明的免疫傳感器檢測(cè)三聚氰胺的原理如圖2所示。本發(fā)明通過石墨烯/殼聚糖復(fù)合納米材料固定三聚氰胺抗原于基底電極上，制備一種三聚氰胺的非標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器，利用Kfe(CN)6為探針，以循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法監(jiān)測(cè)免疫反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)三聚氰胺進(jìn)行定性與定量檢測(cè)。本發(fā)明的傳感器具有高度的靈敏度和專一性，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、高效，適用范圍廣泛，檢測(cè)限可達(dá)到0.2 ng/ml，線性范圍5 1500 ng/ml，是一種簡(jiǎn)單、快速、高效測(cè)定牛奶等食品中違禁添加物三聚氰胺殘留量的檢測(cè)方法。


圖1本發(fā)明的免疫傳感器電極表面修飾示意圖。圖2本發(fā)明的免疫傳感器檢測(cè)三聚氰胺的原理，(a)將修飾好的電極浸入含有游離三聚氰胺和三聚氰胺抗體的溶液中進(jìn)行孵育，(b)以[Fe (CN)6] 為探針進(jìn)行電化學(xué)檢測(cè)，(c)通過監(jiān)測(cè)電信號(hào)的變化檢測(cè)三聚氰胺濃度。 圖3石墨烯的SEM電鏡照片。圖4不同修飾電極(a)裸電極，(b)三聚氰胺/殼聚糖修飾電極，(C)石墨烯/三聚氰胺/殼聚糖修飾電極，(d)石墨烯/三聚氰胺/殼聚糖修飾電極在含有三聚氰胺的抗體中孵育后，在2福的K3 [Fe (CN)6]的PBS溶液中的CV曲線圖，掃速為50mv/s。圖5修飾電極在孵育液中的孵育時(shí)間對(duì)DPV峰電流的影響。圖6孵育液中抗體含量對(duì)DPV峰電流的影響。圖7 (a)石墨烯/三聚氰胺/殼聚糖修飾電極，及其在含有相同濃度的三聚氰胺抗體和不同濃度的游離的三聚氰胺(b) 1500ng/mL, (c) 1000ng/mL, (d) 500ng/mL, (e) IOOng/ mL，(f) 20ng/mL, (g) 5ng/mL, (h) Ong/mL 的孵育液中孵育后，在 2mM 的 KjFe(CN)6]的 PBS 溶液中的DPV曲線圖。圖8為響應(yīng)電流的變化Δ I與三聚氰胺濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，所述的實(shí)施例有助于對(duì)本發(fā)明的理解和實(shí)施，并非構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。本發(fā)明的保護(hù)范圍并不以具體實(shí)施方式
為限，而由權(quán)利要求加以限定。以下實(shí)施例中使用上海辰華公司的電化學(xué)工作站(CHI660D)，以修飾的玻碳電極為工作電極，飽和甘汞電極為參比電極，鉬絲電極為輔助電極進(jìn)行電化學(xué)測(cè)量。所使用的三聚氰胺抗體為北京博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的三聚氰胺單克隆抗體。實(shí)施例1免疫傳感器制備
一種檢測(cè)三聚氰胺的電化學(xué)免疫傳感器，是在玻碳電極表面修飾石墨烯-三聚氰胺-殼聚糖復(fù)合物而得。其制備方法如下
1)石墨烯的制備主要以氧化石墨(GO)作為前驅(qū)體，通過氧化石墨的還原和石墨烯的功能化得到性能優(yōu)異的石墨烯。氧化石墨的制備50 mL&H2S04+10 g K2S208+10 gP205混合，將12 g石墨粉加入到上述混合液中，反應(yīng)6 h。加入2 L水，過夜。460冰箱冰凍處理)，將氧化的石墨粉加入到濃中攪拌。溫度控制在10 V以下，緩慢加入60 g KMnO4,混合物在35 °C反應(yīng)2 h，緩慢加入920 mL去離子水，保持50 ！以下，攪拌反應(yīng)2 h。加入2. 8 L水以及50 mL 30 % H2O2，攪拌反應(yīng)一天。使用5 L 10%的HCl沖洗，離心。然后再用5 L水洗， 至溶液呈中性。石墨烯的制備稱取上述氧化石墨0. 05 g，加入到100 mL pH=ll的NaOH溶液中； 在150 W下超聲90 min制備氧化石墨烯分散液；在4000 rpm下離心3 min除去極少量未剝離的氧化石墨；向離心后的氧化石墨烯分散液中加入0.1 mL水合胼，在90 ！攪拌反應(yīng)2 h，得到石墨烯分散液。如圖3所示為石墨烯的掃描電鏡照片，由圖中可以看出石墨烯呈很薄的片狀。2)石墨烯-殼聚糖懸浮液的配制將0. 05 M的HCl加熱至80 90°C，加入稱量好的殼聚糖，攪拌溶解，冷卻后加入濃度為0. IM的NaOH，調(diào)節(jié)pH至5，配得1 mg/mL的殼聚糖溶液，置于4 °C冰箱備用。準(zhǔn)確稱取5 mg石墨烯樣品于2 mL殼聚糖溶液中，超聲分散1 h，制得石墨烯-殼聚糖懸浮液。3)電極修飾直徑為3mm的玻碳電極用分別用1. 0和0. 3Mm的Al2O3粉乳液打磨拋光后，分別在乙醇和水中各超聲3min。將4 μ L上述懸浮液與2 μ L濃度為0. 2 mg/mL 的三聚氰胺水溶液混合后，滴涂于處理過的玻碳電極表面，40 °C下烘干30 min。表面修飾后的電極于37 ！下浸泡在5 %的BSA溶液中30 min,以封閉剩余的活性位點(diǎn)。
實(shí)施例2修飾電極循環(huán)伏安掃描對(duì)不同修飾電極的進(jìn)行循環(huán)伏安研究，其結(jié)果如圖4。裸電極(曲線a)在2 mM的KjFe(CN)6]溶液中的循環(huán)伏安曲線表現(xiàn)出一對(duì)明顯 Wi^e(CN)63+氧化還原峰，氧化峰電流值為11. 1 μ A ；當(dāng)電極上只修飾殼聚糖溶液時(shí)(曲線 b)，氧化還原峰電勢(shì)差變寬，同時(shí)峰電流有所下降，氧化峰電流值為9. 931 μ A，可能是由于電極表面的不具有電化學(xué)活性的殼聚糖阻礙了電子傳遞；當(dāng)電極上修飾了石墨烯/三聚氰胺/殼聚糖后(曲線c)，峰電流明顯增大，氧化峰電流值為21. 71 μ Α，石墨烯優(yōu)異的電化學(xué)活性極大的增強(qiáng)了電子的傳遞；將石墨烯/三聚氰胺/殼聚糖修飾電極(免疫傳感器)放入含有三聚氰胺抗體的孵育液中孵育后(曲線d)，峰電流下降，氧化峰電流值為10. 31 μΑ，這是由于三聚氰胺抗體與電極上的抗原反應(yīng)，吸附在電極上，阻礙了電子的傳遞造成的，這也說(shuō)明三聚氰胺抗原已經(jīng)修飾在了電極上。
實(shí)施例3檢測(cè)條件優(yōu)化
不同檢測(cè)條件的影響，如免疫反應(yīng)的時(shí)間和抗體濃度，由DPV法進(jìn)行確定。1、免疫反應(yīng)時(shí)間
實(shí)施例1制得的免疫傳感器使用含有相同的抗體濃度的孵育液分別孵育0，10,20,40 和60分鐘后用PBS清洗，在2 mM K3[Fe (CN)6]溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安(DPV)掃描，結(jié)果如圖5。石墨烯/三聚氰胺/殼聚糖修飾電極(免疫傳感器)的DPV峰電流隨孵育時(shí)間增加在40分鐘內(nèi)快速下降，到60分鐘時(shí)略微下降(圖5)。孵育時(shí)間再增加對(duì)電流響應(yīng)沒有明顯的影響。因此，選擇40分鐘作為免疫反應(yīng)的最佳孵育時(shí)間。2、孵育溶液中抗體濃度的影響
石墨烯/三聚氰胺/殼聚糖修飾電極，浸在50 μ L加入不同抗體濃度的PBS溶液中，在37°C孵育40 min, PBS清洗后，在2 mM K3[Fe (CN)6]溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安(DPV)掃描，結(jié)果如圖6。由圖6可知，當(dāng)在溶液中抗體濃度由0 yg/mL增加至4 yg/mL時(shí)，DPV峰值電流顯著下降。隨著進(jìn)一步增加抗體濃度，在4-10 μ g/mL范圍內(nèi)，幾乎沒有觀察到減少電流的反應(yīng)。結(jié)果表明，孵化溶液中抗體濃度大于4 μ g/mL后抗體的吸附量不再增加，表明結(jié)合位點(diǎn)基本上達(dá)到飽和。對(duì)于競(jìng)爭(zhēng)的免疫反應(yīng)，選擇一個(gè)有足夠高的信號(hào)并小于飽和濃度的濃度。因此，選擇4 yg/mL為最佳的抗體濃度。
實(shí)施例4 DPV掃描結(jié)果及工作曲線的繪制
以Kfe (CN) 6為探針，通過DPV檢測(cè)方法，利用單克隆抗體特異結(jié)合三聚氰胺的能力，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)三聚氰胺的檢測(cè)。配制標(biāo)準(zhǔn)溶液(孵育液)，標(biāo)準(zhǔn)溶液為一組總量為50 μ L、含有濃度不一的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液、4 μ g/mL相同濃度的三聚氰胺抗體的PBS的溶液(pH=7. 4)。將石墨烯/三聚氰胺/殼聚糖修飾電極浸入孵育溶液，溶液中游離的三聚氰胺與固定在電極表面的三聚氰胺競(jìng)爭(zhēng)與溶液中三聚氰胺抗體的反應(yīng)。經(jīng)過37°C下40 min孵育后，用PBS沖洗。沖洗后的電極為工作電極，在2mM K3[Fe (CN)6]溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安 (DPV)掃描，記錄響應(yīng)電流，如圖7所示。結(jié)果表明，隨著三聚氰胺在孵育液中的增加，DPV峰電流增大。定義石墨烯/三聚氰胺/殼聚糖修飾電極在只含4 μ g/mL抗體的PBS緩沖溶液(空白)中孵育后的響應(yīng)電流為 Itl，在含有游離三聚氰胺的孵育液孵育后的響應(yīng)電流為Ix，響應(yīng)電流的增加Δ I( AI=Ix-Ici) 與三聚氰胺濃度在5到1500ng/mL范圍內(nèi)是成正比。繪制Δ I-C標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖8所示。以大于噪音信號(hào)3倍的電流信號(hào)對(duì)應(yīng)的濃度為最低檢出限，重復(fù)5次以上實(shí)驗(yàn)得出最低檢出限為0. 2 ng/mL。
實(shí)施例5牛奶中三聚氰胺含量的測(cè)定
根據(jù)實(shí)施例4所建立的三聚氰胺檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用本發(fā)明的方法測(cè)定牛奶樣品中三聚氰胺含量，定量方法為標(biāo)準(zhǔn)加入法。1)牛奶樣品前處理
稱取2士0.0050 g牛奶(約2 mL)于到10 mL的樣品管中，加入三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液，和7 mL新配的乙腈-0.05 M HCl提取液(V :V，1:1)，混合物超聲振蕩30 min，于5000 r/m下離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至容積為25 mL的容量瓶中，殘?jiān)? mL、6 mL和6 mL的相同提取液重復(fù)提取3次，上清液合并在容量瓶中。取1 mL的上清液轉(zhuǎn)移到5 mL的樣品管中在氮吹條件下于55 °C溫度下濃縮蒸發(fā)， 濃縮物加入1 mL的pH為7. 4磷酸緩沖溶液溶解后用于電化學(xué)分析。2)對(duì)四種加入不同量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液的牛奶樣品按照步驟1)所述的方法進(jìn)行前處理，制得不加入三聚氰胺的空白樣品，和3個(gè)含有不同三聚氰胺濃度的加標(biāo)樣品(標(biāo)準(zhǔn)加入法)，進(jìn)而按照與實(shí)施例4相同的方法對(duì)修飾電極進(jìn)行孵育及測(cè)定，對(duì)每個(gè)加標(biāo)樣品測(cè)定三次，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品中三聚氰胺的實(shí)際濃度，三聚氰胺的回收率在90. 8%到 117%之間，平均為104. 8%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表1。
表 權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)三聚氰胺的電化學(xué)免疫傳感器，包括基底電極，其特征在于所述的基底電極表面修飾石墨烯-三聚氰胺-殼聚糖復(fù)合物，并以牛血清蛋白封閉非特異性活性位點(diǎn)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于，所述的基底電極為玻碳電極。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于，所述免疫傳感器通過下述方法制得將石墨烯的殼聚糖懸浮液超聲分散后與三聚氰胺混合，將混合液滴涂在電極表面，利用殼聚糖將石墨烯和三聚氰胺包被并固定于電極表面，并將電極浸泡在牛血清蛋白溶液中，封閉電極表面的非特異性的活性位點(diǎn)。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的電化學(xué)免疫傳感器，其特征在于，所述免疫傳感器通過下述步驟制得1)石墨烯-殼聚糖懸浮液的配制將0.05M的HCl加熱至80 90°C，加入稱量好的殼聚糖，攪拌溶解，冷卻后加入濃度為0. IM的NaOH，調(diào)節(jié)pH至5，配得lmg/mL的殼聚糖溶液； 準(zhǔn)確稱取5g石墨烯樣品于2mL殼聚糖溶液中，超聲分散lh，制得石墨烯-殼聚糖懸浮液；2)玻碳電極處理直徑為3mm的玻碳電極用分別用1.0和0. 3Mm的Al2O3粉乳液打磨拋光后，分別在乙醇和水中各超聲清洗:3min ；3)電極表面修飾將4μ L石墨烯-殼聚糖懸浮液與2 μ L濃度為0. 2mg/mL的三聚氰胺水溶液混合，滴涂于步驟2)制得的玻碳電極表面，40°C下烘干30min ；4)非特異性的活性位點(diǎn)封閉表面修飾后的電極于37°C下浸泡在5%的BSA溶液中 30min，以封閉剩余的活性位點(diǎn)，制得所述的電化學(xué)免疫傳感器。
5.一種檢測(cè)三聚氰胺的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征在于將石墨烯的殼聚糖懸浮液超聲分散后與三聚氰胺混合，將混合液滴涂在電極表面，利用殼聚糖將石墨烯和三聚氰胺包被并固定于電極表面，并將電極浸泡在牛血清蛋白溶液中，封閉電極表面的非特異性的活性位點(diǎn)。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的電化學(xué)免疫傳感器的制備方法，其特征在于，所述的方法包括以下步驟1)石墨烯-殼聚糖懸浮液的配制將0.05M的HCl加熱至80 90°C，加入稱量好的殼聚糖，攪拌溶解，冷卻后加入濃度為0. IM的NaOH，調(diào)節(jié)pH至5，配得lmg/mL的殼聚糖溶液； 準(zhǔn)確稱取5g石墨烯樣品于2mL殼聚糖溶液中，超聲分散lh，制得石墨烯-殼聚糖懸浮液；2)玻碳電極處理直徑為3mm的玻碳電極用分別用1.0和0. 3Mm的Al2O3粉乳液打磨拋光后，分別在乙醇和水中各超聲清洗:3min ；3)電極表面修飾將4μ L石墨烯-殼聚糖懸浮液與2 μ L濃度為0. 2mg/mL的三聚氰胺水溶液混合，滴涂于步驟2)制得的玻碳電極表面，40°C下烘干30min ；4)非特異性的活性位點(diǎn)封閉表面修飾后的電極于37°C下浸泡在5%的BSA溶液中 30min，以封閉剩余的活性位點(diǎn)，制得所述的電化學(xué)免疫傳感器。
7.一種基于權(quán)利要求1所述的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)三聚氰胺的方法，包括以下步驟1)標(biāo)準(zhǔn)溶液配制配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的含有不同濃度游離三聚氰胺的PH為 7. 4的磷酸緩沖溶液為標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中含有相同濃度的三聚氰胺抗體；2)建立工作曲線將免疫傳感器分別浸入標(biāo)準(zhǔn)溶液中孵育，孵育后用磷酸緩沖溶液沖洗免疫傳感器，在K3[Fe (CN)6]溶液中進(jìn)行差分脈沖伏安(DPV)掃描，記錄響應(yīng)電流；空白標(biāo)樣的響應(yīng)電流為Ici,含有游離三聚氰胺的標(biāo)樣的響應(yīng)電流為Ix，響應(yīng)電流的增加Δ I (Δ I=Ix-I0)與標(biāo)準(zhǔn)溶液中三聚氰胺濃度C成正比，繪制Δ I-C標(biāo)準(zhǔn)曲線，或采用線性回歸法得到Δ I-C線性回歸方程；3)三聚氰胺測(cè)定將待測(cè)樣品配制為含有與步驟1)相同濃度三聚氰胺抗體的磷酸緩沖溶液，按照與步驟2)相同的方法對(duì)免疫傳感器進(jìn)行孵育和差分脈沖伏安掃描，記錄響應(yīng)電流；根據(jù)響應(yīng)電流的增加Δ I和標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到三聚氰胺含量。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)三聚氰胺的方法，其特征在于，所述&K3[Fe(CN)6]溶液的濃度為2 mM。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)三聚氰胺的方法，其特征在于，免疫反應(yīng)條件為在37°C 下孵育60 min。
10.根據(jù)權(quán)利要求7所述的檢測(cè)三聚氰胺的方法，其特征在于，所述的三聚氰胺抗體的濃度為4μ g/mL。
全文摘要
一種測(cè)定三聚氰胺含量的非標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器及其制備方法和應(yīng)用。所述的免疫傳感器，包括基底電極，基底電極表面修飾石墨烯-三聚氰胺-殼聚糖復(fù)合物，并以牛血清蛋白封閉非特異性活性位點(diǎn)。其制備方法是以石墨烯/殼聚糖復(fù)合材料固定三聚氰胺抗原于玻碳電極表面。所述的免疫傳感器基于免疫反應(yīng)的競(jìng)爭(zhēng)模式，利用K3Fe(CN)6為探針，以循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法監(jiān)測(cè)免疫反應(yīng)，可用于三聚氰胺含量的檢測(cè)。本發(fā)明的傳感器具有較高的靈敏度和專一性，檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，適用范圍廣泛，檢測(cè)限可達(dá)到0.2ng/ml，線性范圍5~1500ng/ml，具有快速高效、靈敏度高和特異性好、操作簡(jiǎn)單、成本低等特點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102262115SQ20111021301
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年7月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月28日
發(fā)明者趙波, 邵科峰, 陳昌云, 顏妍 申請(qǐng)人:南京師范大學(xué)