專利名稱：沙門氏菌/志賀氏菌雙重?zé)晒鈖cr檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種腸道細(xì)菌的體外診斷試劑盒，尤其涉及一種能夠同時(shí)檢測(cè)沙門氏菌和志賀氏菌的雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，屬于沙門氏菌和/或志賀氏菌的體外診斷領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
沙門氏菌是一類廣泛分布于自然界，可使人和動(dòng)物發(fā)病的具有極大危害的革蘭氏陰性腸道致病菌，能引起人胃腸炎、傷寒、敗血癥等癥狀。沙門氏菌是腸桿菌科的一個(gè)屬，本屬細(xì)菌為革蘭氏陰性短桿菌，無芽孢，除雞白痢沙門氏菌和雞傷寒沙門氏菌外，其余畜禽病原菌均有周鞭毛，其中多數(shù)長有菌毛，能吸附于紅細(xì)胞表面，能凝集紅細(xì)胞。由于沙門氏菌屬是一群形態(tài)、培養(yǎng)、生化反應(yīng)和抗原結(jié)構(gòu)相類似的革蘭氏陰性菌，其種類繁多，有5個(gè)亞屬組成。血清型更為復(fù)雜，至今已發(fā)現(xiàn)2200多個(gè)，在中國已發(fā)現(xiàn)200多個(gè)。常見的有鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌、腸炎沙門氏菌等。目前，全世界已經(jīng)分離出2000多個(gè)血清型，中國已發(fā)現(xiàn)216個(gè)。沙門氏菌常污染各種肉、魚、蛋、乳類食品而引起食物中毒，其中以肉類占多數(shù)。沙門氏菌污染食品的主要原因有(1)病畜或病禽的肉制品；( 病畜或病禽的糞便污染食品；C3)帶菌人在制作食品過程中污染食品；(4)生熟食品未分開造成的交叉污染。沙門氏菌中鼠傷寒沙門氏菌、豬霍亂沙門氏菌和腸炎沙門氏菌等污染了動(dòng)物性食品，如肉、禽及未經(jīng)巴氏消毒的蛋品，可以引起人沙門氏菌食物中毒，表現(xiàn)為發(fā)熱、頭痛、全身酸痛或胃腸炎，個(gè)別病人會(huì)死亡。因此，食品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定各種食品中不得檢出沙門氏菌。食品沙門氏菌檢測(cè)技術(shù)十分關(guān)鍵，出于對(duì)食品安全的關(guān)切。人類迫切需要發(fā)展快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感、適用、低耗的沙門氏菌檢測(cè)技術(shù)。志賀氏菌是人類細(xì)菌性痢疾最常見的病原菌，是一類具有高度傳染性的腸道致病菌，通常稱為痢疾桿菌。它是一類兼性厭氧、不產(chǎn)生芽孢的革蘭氏陰性桿菌。長約2 3 μ m、 寬0. 5 0. 7 μ m、桿狀或短桿狀，不形成莢膜，無鞭毛，多數(shù)有菌毛；營養(yǎng)要求不高，能在普通培養(yǎng)基上生長；最適生長溫度為37°C，最適pH值為6. 4 7. 8。志賀氏菌屬細(xì)菌的抗原由菌體抗原(0)及表面抗原(K)組成。0抗原可分為群特異性抗原和型特異性抗原，型特異性抗原可用于區(qū)別菌型。K抗原可以阻止0抗原與相應(yīng)抗血清的凝集反應(yīng)。根據(jù)生化反應(yīng)和0抗原結(jié)構(gòu)的不同，志賀氏菌可以分為痢疾志賀氏菌 (S. dysenteriae)、福氏志賀氏菌(S. flexneri)、鮑氏志賀氏菌(S. boydii)和宋內(nèi)氏志賀氏菌(S.sormei)。在發(fā)展中國家，由福氏志賀氏菌引起的感染性腹瀉疾病高居首位。志賀氏菌常為食物爆發(fā)型或經(jīng)水傳播，志賀氏菌在擁擠和不衛(wèi)生條件下能迅速傳播，經(jīng)常發(fā)現(xiàn)于人員大量集中的地方如餐廳和食堂等。食源性致賀菌流行的主要原因是從事食品加工行業(yè)人員患菌痢或帶菌者污染食品、接觸食品人員個(gè)人衛(wèi)生差、已污染的食品存放于不適當(dāng)?shù)臏囟认碌仍?。志賀氏菌主要通過消化道途徑傳播，侵襲腸上皮細(xì)胞，引起以發(fā)熱、腹痛、腹瀉為特征的典型的痢疾癥狀，嚴(yán)重危害人類健康。根據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)，每年有1.647億人感染痢疾，1. 1萬人死亡，其中多數(shù)為5歲以下的兒童。在成年患者中，10 100CFU志賀氏菌就可通過感染腸道致病，引發(fā)嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)。發(fā)展中國家由于缺乏清潔的水源、缺少必要的衛(wèi)生醫(yī)療設(shè)備、營養(yǎng)不良等諸多原因，成為痢疾的高發(fā)地。因此，建立快速、有效地檢測(cè)和鑒定志賀氏菌的方法顯得尤為重要。目前，以熒光標(biāo)記探針為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)在中國國內(nèi)的臨床診斷中應(yīng)用最為廣泛。在探針法的實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中，根據(jù)所檢測(cè)病原體的多少，還可以分為單重或多重實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，反應(yīng)體系中往往包括一對(duì)或多對(duì)特異性PCR引物及探針，通過研發(fā)過程中的條件摸索，探針及引物只與相對(duì)應(yīng)的模板特異性地結(jié)合，其結(jié)合位點(diǎn)在兩條引物之間。探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)(R印orter，R)，如FAM、VIC、R0X等，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)(Quencher，Q)，如BHQl、BHQ2、TAMRA等。當(dāng)探針完整的時(shí)候，報(bào)告基團(tuán)所發(fā)射的熒光能量被淬滅基團(tuán)吸收，儀器檢測(cè)不到信號(hào)。隨著PCR的進(jìn)行，Taq酶在鏈延伸過程中遇到與模板結(jié)合的探針，其3' -5'外切核酸酶活性就會(huì)將探針切斷，報(bào)告基團(tuán)遠(yuǎn)離淬滅基團(tuán)，其能量不能被吸收，即產(chǎn)生熒光信號(hào)(

圖1)。所以，每經(jīng)過一個(gè)PCR循環(huán)，熒光信號(hào)也和目的片段一樣，有一個(gè)同步指數(shù)增長的過程?，F(xiàn)有的沙門氏菌和/或志賀氏菌的體外診斷試劑盒大多存在特異性差、靈敏性較低等缺陷，有待改進(jìn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明主要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有的沙門氏菌和/或志賀氏菌的體外診斷試劑盒存在的靈敏度低、特異性差等缺陷，提供一種新的沙門氏菌和/或志賀氏菌的雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，該雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的一種沙門氏菌和志賀氏菌的雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，包括以下各組分PCR反應(yīng)液、沙門氏菌/志賀氏菌雙重反應(yīng)液和滅菌水。其中，所述的沙門氏菌/志賀氏菌雙重反應(yīng)液包括以下2組組分組分(1)由一對(duì)檢測(cè)沙門氏菌的引物和一條檢測(cè)沙門氏菌的探針組成，其中，所述引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示；所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 3所示，該探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；組分⑵由一對(duì)檢測(cè)志賀氏菌的引物和一條檢測(cè)志賀氏菌的探針組成；其中，所述引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 6所示，該探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；其中，所述的熒光報(bào)告基團(tuán)包括FAM、HEX、ROX、CT3或CY5等熒光報(bào)告基團(tuán)；所述的熒光淬滅基團(tuán)包括BHQ1、BHQ2或BHQ3等熒光淬滅基團(tuán)；本發(fā)明對(duì)上述引物和探針的配比比例進(jìn)行了摸索和優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，它們之間不同的配比比例對(duì)于檢測(cè)結(jié)果的特異性和靈敏性具有顯著的差異，本發(fā)明通過高通量的篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，上述引物和探針在下述配比下，具有最優(yōu)的檢測(cè)效果檢測(cè)沙門氏菌的引物及探針的配比分別為=SEQ ID No. 1 SEQ IDNo. 2 SEQ ID No. 3 = 500nM 500nM 200nM。檢測(cè)志賀氏菌引物及探針的配比分別為SEQ ID No. 4 SEQ ID No. 5 SEQ IDNo. 6 = 500nM 500nM 800nM。表1檢測(cè)沙門氏菌、志賀氏菌的引物和探針序列
權(quán)利要求
1.沙門氏菌/志賀氏菌雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，包括以下各組分PCR反應(yīng)液，沙門氏菌/志賀氏菌雙重反應(yīng)液和滅菌水。
2.按照權(quán)利要求1所述的雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的沙門氏菌/志賀氏菌雙重反應(yīng)液包括以下2組組分組分(1)由一對(duì)檢測(cè)沙門氏菌的引物和一條檢測(cè)沙門氏菌的探針組成；其中，所述引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 2所示；所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 3所示，該探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)；組分O)由一對(duì)檢測(cè)志賀氏菌的引物和一條檢測(cè)志賀氏菌的探針組成；其中，所述引物的堿基序列分別為SEQ ID No. 4和SEQ ID No. 5所示；所述探針的堿基序列為SEQ ID No. 6所示，該探針的5'端標(biāo)記有熒光報(bào)告基團(tuán)，3'端標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)。
3.按照權(quán)利要求2所述的雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于組分⑴中兩條引物和探針之間的配比為SEQ ID No. 1 SEQ ID No. 2 SEQID No. 3 = 500nM 500nM 200nM。
4.按照權(quán)利要求2所述的雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于組分⑵中兩條引物和探針之間的配比為SEQ ID No. 4 SEQID No. 5 SEQID No. 6 = 500nM 500nM 800nM。
5.按照權(quán)利要求2所述的雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述的熒光報(bào)告基團(tuán)包括FAM、HEX、ROX、CY3或CY5熒光報(bào)告基團(tuán)；所述的熒光淬滅基團(tuán)包括BHQl、BHQ2或 BHQ3熒光淬滅基團(tuán)。
6.按照權(quán)利要求1所述的雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于，所述的PCR反應(yīng)液包括滅菌雙蒸水、10XPCR緩沖液、25mM Mg2+UOmMdNTPs和DNA聚合酶。
7.按照權(quán)利要求6所述的雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于所述DNA聚合酶是熱啟動(dòng)酶。
8.按照權(quán)利要求1所述的雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，其特征在于還含有沙門氏菌/志賀氏菌陽性參考品
9.權(quán)利要求1-8任何一項(xiàng)所述雙重?zé)晒釶CR試劑盒在檢測(cè)沙門氏菌和志賀氏菌中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種沙門氏菌/志賀氏菌雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒，該檢測(cè)試劑盒包括以下各組分PCR反應(yīng)液、沙門氏菌/志賀氏菌雙重反應(yīng)液和滅菌水。本發(fā)明沙門氏菌/志賀氏菌雙重?zé)晒釶CR檢測(cè)試劑盒解決了傳統(tǒng)的生化與免疫學(xué)方法檢測(cè)這兩種細(xì)菌所存在的操作繁瑣、周期較長以及無法在一個(gè)反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)等問題，能夠在同一反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)出沙門氏菌和志賀氏菌，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、可重復(fù)性強(qiáng)、檢測(cè)結(jié)果快速客觀等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102260740SQ201110186210
公開日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年7月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年7月5日
發(fā)明者劉中華, 張旭, 李秀林, 王國強(qiáng), 趙宏浩 申請(qǐng)人:江蘇碩世生物科技有限公司