專利名稱：一種從雞蛋中同時(shí)提取并衍生化阿莫西林和氨芐西林的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種雞蛋中阿莫西林和氨芐西林同時(shí)提取、凈化和衍生化的方法。
背景技術(shù)：
在對(duì)食品殘留物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，如果能同時(shí)對(duì)多種物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)，那么將大大提高工作效率，但只有同時(shí)能將多種殘留物同時(shí)從樣本中提取出來(lái)，才可能建立起高效的檢測(cè)方法。阿莫西林和氨芐西林均為白色或類(lèi)白色結(jié)晶性粉末，味微苦，在水中微溶，在乙醇中幾乎不溶。但是二者的鈉鹽或三水合物，在水中易溶，乙醇中略溶。國(guó)內(nèi)外關(guān)于阿莫西林和氨芐西林的提取方法有許多報(bào)道。提取劑一般為磷酸二氫鉀緩沖溶液、乙腈、甲醇水溶液等。到目前為止，國(guó)內(nèi)外對(duì)雞蛋中該兩種藥物同時(shí)提取、衍生的方法尚未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
為了解決現(xiàn)有技術(shù)不能同時(shí)從雞蛋中提取阿莫西林和氨芐西林的問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種同時(shí)提取、凈化和衍生化的方法，該方法簡(jiǎn)單、方便、快速，回收率高。本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是一種同時(shí)從雞蛋中提取并衍生化阿莫西林和氨芐西林的方法，是將雞蛋制成勻漿后，加入乙腈振蕩、混勻直接提取，離心，將上清液移出，重復(fù)提取1-2次，合并上清液，即得提取液；
向提取液中加入經(jīng)超純水飽和的二氯甲烷，充分振蕩、混勻、離心，經(jīng)過(guò)此液-液萃取步驟，藥物被轉(zhuǎn)移至上層水相中，將上層水相移出，重復(fù)提取1-2次，合并水相。最后將水楊醛加入至萃取水相中，進(jìn)行衍生化反應(yīng)。其中水楊醛的添加量取決于樣品中藥物的含量，因?yàn)樗畻钊┲缓蜆悠分兴幬锇l(fā)生衍生化反應(yīng)；通過(guò)大量實(shí)驗(yàn)，篩選出的水楊醛添加量25 μ L 必須是過(guò)飽和的，適合所有雞蛋樣品，但水相的量以1.0-1.5 mL為宜。上述方法中，乙腈為色譜純級(jí)，添加量?jī)?yōu)選為樣品量的4倍體積。二氯甲烷添加量與乙腈的添加量相等。采用本發(fā)明方法能將雞蛋中的阿莫西林和氨芐西林同時(shí)提取出來(lái)，并經(jīng)水楊醛衍生化步驟得到的溶液可以供HPLC檢測(cè)用。本發(fā)明采用乙腈作為提取劑，兩種藥物的提取效率都很高，均達(dá)到77. 4%以上。此外，乙腈可有效去除蛋白質(zhì)，再用二氯甲烷萃取可減少內(nèi)源性雜質(zhì)，有利于樣品凈化。本試驗(yàn)中通過(guò)對(duì)衍生化條件的優(yōu)化，篩選出的最佳衍生化條件為25%三氯乙酸 200 μ L (為衍生化反應(yīng)提供酸環(huán)境，在添加水相體積1. 0-1. 5mL的前提下篩選出三氯乙酸的濃度)、水楊醛25μ L、100°C水浴中加熱60min
篩選出雞蛋中阿莫西林和氨芐西林殘留的最佳前處理、衍生方法。該方法簡(jiǎn)單、方便、快速，回收率高，平均回收率均在77. 6%以上，日內(nèi)和日間RSD均分別低于9. 6%和 14.8%,符合AOAC殘留測(cè)定要求。


圖1是衍生試劑色譜圖2是雞蛋空白對(duì)照樣品色譜圖 3 是 AMO (20ng · ml/1)和 AMP (20ng · ml/1)標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(100 μ L 進(jìn)樣)； 圖4是AMO (25ng · g"1)和AMP (25ng · g"1)空白雞蛋添加色譜圖(200 μ L進(jìn)樣)； 圖5是口服給藥樣品色譜圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明中所涉及的試劑的百分濃度，除特別說(shuō)明外均指質(zhì)量百分濃度。1.實(shí)驗(yàn)雞的飼養(yǎng)、給藥和樣品采集 1.1實(shí)驗(yàn)雞選擇及分組
選取28周齡京海黃雞產(chǎn)蛋雞120只，體重1. 75士0. 20kg,隨機(jī)分成4組，分別為阿莫西林試驗(yàn)組、氨芐西林試驗(yàn)組、阿莫西林和氨芐西林混合試驗(yàn)組、空白對(duì)照組，每組30只產(chǎn)蛋雞。產(chǎn)蛋雞均單籠飼養(yǎng)，給藥前分別稱重、編號(hào)。試驗(yàn)前預(yù)飼1周，飼喂不含任何抗菌藥物的全價(jià)飼料，自由飲水。給藥劑量、途徑及樣品采集
將阿莫西林原粉和氨芐西林原粉用無(wú)菌超純水配成50 mg .mL-\90mg -πιΓ1的水溶液， 然后將藥液分別用帶有細(xì)乳膠管的注射器直接注入到雞嗉囊中。各試驗(yàn)組產(chǎn)蛋雞給藥劑量見(jiàn)表1:
表1.各試驗(yàn)組產(chǎn)蛋雞給藥劑量
組別阿莫西林(AMO)組氨芐西林(AMP)組混合組對(duì)照組齊糧(mg/kg. b. w)2560AM025+AMP600. 0
試驗(yàn)組每天給藥1次，給藥時(shí)間均在上午8:00 9:00，連續(xù)5d，自給藥日起至停藥后
20d內(nèi)，于每天17 30 18 00收集各試驗(yàn)組雞蛋，分別做好標(biāo)記，記錄各試驗(yàn)組每天的產(chǎn)蛋數(shù)，每組每天可采集13 16個(gè)雞蛋，雞蛋樣品保存在低溫蛋庫(kù)中。
2、本發(fā)明提取、萃取、凈化及衍生化步驟
①用勻漿機(jī)將雞蛋制成勻漿；
②準(zhǔn)確稱取5.0-6.0 g雞蛋勻漿樣品，放于30-50 mL具塞離心管中；③加入20-25mL乙腈溶液置漩渦混合器上混勻；
④漩渦振蕩混勻2-;3min，8000-10000X g離心10_15min，溫度設(shè)置為10_15°C ；
⑤上清液轉(zhuǎn)移至另一50 mL具塞離心管中；
⑥加入20-25mL用超純水飽和的二氯甲烷溶液置漩渦混合器上混勻(使藥物溶于上層水相、乙腈溶于二氯甲烷溶液中)；
⑦漩渦振蕩混勻2-;3min，6500-8000X g離心10_15min，溫度設(shè)置為20_25°C ；
⑧取1.0-1. 5mL上層水相至10-15mL有刻度具塞的玻璃離心管中；
⑨向上述的玻璃離心管中分別加入200μ L25%的三氯乙酸溶液、25 μ L水楊醛(見(jiàn)圖 1)，漩渦振蕩混勻l-2min，將其放入沸水浴中，衍生反應(yīng)持續(xù)60min ；
⑩反應(yīng)后取出樣品，冷卻至室溫，將樣品轉(zhuǎn)移到2mL離心管中，分別用200-400μ L 50%
4乙腈溶液洗滌IOmL玻璃離心管1-2次，并合并到2mL離心管中，最后用50%乙腈溶液定容至2mL刻度；
上機(jī)前以18000-20000 Xg離心15min，過(guò)0. 22 μ m濾膜，濾液供HPLC檢測(cè)(見(jiàn)圖2、 圖3、圖5)。.回收率的測(cè)定準(zhǔn)確稱取5.Og勻漿后的空白雞蛋勻漿液，置于50mL聚丙烯離心管中，同時(shí)添加低、中、高三種濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液，使得空白蛋液中同時(shí)分別含有阿莫西林5. 0、25、125叫1_1和氨芐西林5.0、25、125 ng · ；每個(gè)添加量設(shè)6個(gè)平行，經(jīng)上述樣品的提取、凈化和衍生化后，進(jìn)樣200 μ L作HPLC檢測(cè)(見(jiàn)圖4)。HPLC檢測(cè)條件色譜柱為 C18，5ym，250_X4. 6mm;流動(dòng)相為A為0. 01 mol · L—1的磷酸二氫鉀溶液，用2M鹽酸調(diào) pH至5.5 ;B是色譜純級(jí)乙腈溶液；熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)354匪，發(fā)射波長(zhǎng)445 nm ；柱溫 35、0°C ；梯度洗脫程序見(jiàn)表2。根據(jù)峰面積計(jì)算添加回收率。本發(fā)明方法提取雞蛋中AMO 和AMP的添加回收率及變異系數(shù)的結(jié)果見(jiàn)表3。表2.梯度洗脫程序
序號(hào)時(shí)間(min)流速(mL · mi if1)A 液(1 )B 液(%)梯度曲線形狀101. 06535線性梯度曲線2101. 06535線性梯度曲線3111. 04060線性梯度曲線4181. 04060線性梯度曲線5191. 06535線性梯度曲線6221. 06535線性梯度曲線
表3雞蛋中AMO和AMP的添加回收率及變異系數(shù)(n=6)
Itt*mmm β * Af-f"1 /Im^m I 日 1%_纖 Λ MΛAM) AM1C *3f| C* a tw. a 25 m,4 m 霧-4 S 77. β as m§ us1 SL S s.t as W.. I. I fi_6 ft,3 t.3 1.4 i i 後7 I "14.8 ILi IL 8.1 IiS IL 44.精密度的測(cè)定
日內(nèi)精密度測(cè)定將檢測(cè)回收率剩余的樣品按藥物濃度高低分別混合成3份，得到量較多的含低、中、高3種藥物濃度的樣品。在同日內(nèi)不同時(shí)間用同一條標(biāo)準(zhǔn)曲線及同一臺(tái) HPLC 6次重復(fù)測(cè)定低、中、高3種藥物濃度的樣品，求得日內(nèi)(批內(nèi))精密度。日間精密度測(cè)定將檢測(cè)回收率剩余的樣品按藥物濃度高低分別混合成3份，得到量較多的含低、中、高3種藥物濃度的樣品。在一周內(nèi)不同日用不同的標(biāo)準(zhǔn)曲線及同一臺(tái) HPLC 6次重復(fù)測(cè)定低、中、高3種藥物濃度的樣品，求得日間(批間)精密度。
權(quán)利要求
1.一種同時(shí)從雞蛋中提取并衍生化阿莫西林和氨芐西林的方法，是將雞蛋制成勻漿后，加入乙腈振蕩、混勻直接提取，離心，將上清液移出，重復(fù)提取1-2次，合并上清液，即得提取液；向提取液中加入經(jīng)超純水飽和的二氯甲烷，充分振蕩、混勻、離心，將上層水相移出，重復(fù)提取1-2次，合并水相；最后將水楊醛加入至萃取水相中，進(jìn)行衍生化反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)從雞蛋中提取并衍生化阿莫西林和氨芐西林的方法，其特征在于所述乙腈用量為樣品量的4倍體積，二氯甲烷用量與乙腈的用量相等。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的同時(shí)從雞蛋中提取并衍生化阿莫西林和氨芐西林的方法，其特征在于所述的衍生化反應(yīng)的條件為25%三氯乙酸200 μ L、水楊醛25 μ L、100°C水浴中加熱60min。
全文摘要
本發(fā)明涉及獸藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種雞蛋中阿莫西林和氨芐西林同時(shí)提取、凈化和衍生化的方法。該方法是將雞蛋制成勻漿后，加入乙腈振蕩、混勻直接提取，離心，將上清液移出，重復(fù)提取1-2次，合并上清液，即得提取液；向提取液中加入經(jīng)超純水飽和的二氯甲烷，充分振蕩、混勻、離心，將上層水相移出，重復(fù)提取1-2次，合并水相；最后將水楊醛加入至萃取水相中，進(jìn)行衍生化反應(yīng)。該方法簡(jiǎn)單、方便、快速，回收率高，平均回收率均在77.6％以上，日內(nèi)和日間RSD均分別低于9.6％和14.8％，符合AOAC殘留測(cè)定要求。
文檔編號(hào)G01N1/28GK102323121SQ201110175198
公開(kāi)日2012年1月18日 申請(qǐng)日期2011年6月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月27日
發(fā)明者孫瑛瑛, 張小杰, 徐東, 戴國(guó)俊, 王金玉, 謝愷舟, 謝星, 賈龍飛, 郭輝生, 陳國(guó)宏, 陳學(xué)森, 黃玉萍 申請(qǐng)人:揚(yáng)州大學(xué)