專利名稱：刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由于刺參市場需求量的逐年增加，傳統(tǒng)的捕撈業(yè)已不能滿足人們的需求，刺參養(yǎng)殖業(yè)應(yīng)運而生，養(yǎng)殖面積和產(chǎn)量的迅速增加，為沿海地區(qū)創(chuàng)造了十分可觀的社會效益和經(jīng)濟效益。但近年來刺參病害不斷發(fā)生，自2003年冬季起，山東和遼寧沿海的養(yǎng)殖刺參先后出現(xiàn)了爛皮、腫嘴的大面積流行病、引發(fā)了 30%以上的大量死亡。免疫學研究，是了解機體免疫反應(yīng)特征、從而為疾病防治奠定基礎(chǔ)和提供方法的科學。然而，由于刺參大量養(yǎng)殖是近幾年的事，而病害的發(fā)生也非常急驟，所以免疫防御研究嚴重滯后。棘皮動物的體腔細胞具有多種生理功能，包括自我和非自我識別、吞噬、細胞毒素反應(yīng)、細胞聚合、包囊、凝血以及產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)等。細胞吞噬作用是棘皮動物免疫防御的主要效應(yīng)方式，對體內(nèi)沒有產(chǎn)生抗體機構(gòu)的棘皮動物的免疫防御具有更為重要的意義， 這一指標被廣泛的用于衡量機體的健康狀況及在環(huán)境脅迫或病原脅迫下的免疫防御能力。 目前有多種測定細胞吞噬的方法，如傳統(tǒng)的顯微鏡檢計數(shù)法、光密度法及流式細胞儀熒光檢測法等。其中，鏡檢法通過顯微鏡的觀察分析，適用于細胞的形態(tài)學觀察及單個細胞吞噬功能的定性研究，但由于該技術(shù)存在主觀性強和重復(fù)性差等缺點，其應(yīng)用在一定程度上受到了限制。流式細胞儀技術(shù)(Flow-cytometry，F(xiàn)CM)可利用不同的熒光標記對細胞的吞噬功能進行研究，具有準確性高、重復(fù)性好，而且操作簡便快速的特點，目前已成為研究脊椎動物血細胞功能的常規(guī)手段，但其在棘皮動物類中尚未得到廣泛應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明解決的技術(shù)問題是，解決上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種快速測定刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，該方法具有準確性高、重復(fù)性好，而且操作簡便快速的特點。本發(fā)明的技術(shù)方案是，首先制備刺參體腔液中的吞噬細胞，然后用熒光素異硫氰酸酯(FITC)標記熱滅活后的酵母細胞，再將標記后的酵母細胞與刺參吞噬細胞共孵育，最后利用流式細胞儀測定吞噬活性。具體包括以下步驟(1)制備刺參體腔液中的吞噬細胞無菌注射器抽取與抗凝劑等體積的刺參體腔液，放入無菌離心管中，再沿管壁緩慢加入與混合液體積相同的蔗糖緩沖液，在水平離心機 800-1200rpm離心5_10分鐘，收集位于體腔液、抗凝液混合物與蔗糖緩沖液之間的吞噬細胞，收集后用等滲緩沖液洗1-2次，加入含10%胎牛血清和雙抗的L-15培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度數(shù)量級為106cfu/mL。(2)FITC標記酵母細胞將劃線分離的酵母細胞單克隆接種于YDP液體培養(yǎng)基，260C 48°C，振蕩培養(yǎng)12-16小時后，室溫5000-8000rpm離心10-20分鐘，收集酵母細胞， 并用PBS洗1-2次，再用PBS重懸定量至1 X 109cfu/mL,放入沸水浴中30-50分鐘殺死酵母細胞，然后用PBS沖洗2-3次，離心棄上清，PBS重懸，在37°C避光與FITC共同培養(yǎng)30-40 分鐘，濃度為O.OlmgFITC/lO9酵母細胞，其間不時搖勻，室溫離心收集標記酵母細胞，PBS洗 2-3次至上清無色，然后懸浮于等滲緩沖液中，定量1 X 108cfu/mL,熒光顯微鏡觀察標記情況，4°C避光貯存。(3)標記后的酵母細胞與刺參吞噬細胞的共孵育加FITC標記的酵母細胞于吞噬細胞培養(yǎng)液中，且標記的酵母細胞與吞噬細胞的比例約為30-50 1，室溫，置于水平搖床上慢速搖動30-120分鐘，取搖勻液800-1000rpm離心5_10分鐘，棄上清，PBS洗一次，70% 乙醇固定10-15分鐘，800-1000rpm離心5_10分鐘后棄上清，沉淀加入ImL濃度為0. 5 μ g/ mL 的 EB0(4)利用流式細胞儀檢測吞噬細胞體外吞噬活性所用流式細胞儀為BD公司生產(chǎn)的，型號為FACSCal ibur，設(shè)定儀器基本參數(shù)，前向角為460，側(cè)向角為399，起始電壓0，數(shù)據(jù)采用Log對數(shù)形式，上樣后先用Fk-H/Ssc-H圈定巨噬細胞，再采集紅色和綠色熒光強度， 并計算實際吞噬率，所得數(shù)據(jù)用CellQuestPro Software軟件分析。本發(fā)明所述的抗凝劑用以下方法制得先配置pH7. 6的濃度為0. 068mol/L的 Tris-HCl 緩沖液，然后加入 0. 02mol/L 的 EGTA，0. 34mol/L 的 NaCl, 0. 018mol/L 的 KCl，最后用0. 22 μ m的濾器過濾即可。本發(fā)明所述的蔗糖緩沖液用以下方法制得先配置pH7. 6的濃度為0. OOlmol/L的 Tris-HCl 緩沖液，然后加入 0. 8mol/L 的蔗糖，0. 34mol/L 的 NaCl，0. 001mol/L 的 EGTA，最后用0. 22 μ m的濾器過濾即可。本發(fā)明中，所述的等滲緩沖液用以下方法制得先配置pH7. 6的濃度為0. Olmol/ L 的 Tris-HCl 緩沖液，然后加入 0. 01mol/L 的 EGTA, 0. 34mol/L 的 NaCl，最后用 0. 22 μ m 的濾器過濾即可。本發(fā)明中，所述的雙抗內(nèi)含100IU/ml的青霉素及100 μ g/ml的鏈素。本發(fā)明中，所述的YDP液體培養(yǎng)基由1 %的酵母浸出汁，2 %蛋白胨，2 %的D-葡萄糖混合，然后滅菌制得。本發(fā)明的有益效果是，準確性高、重復(fù)性好，而且操作簡便快速，為探討刺參體腔細胞吞噬功能提供了方法依據(jù)。


圖1為標記的酵母細胞圖；圖2為正常的刺參體腔吞噬細胞的吞噬結(jié)果圖；圖3為患病時的刺參體腔吞噬細胞結(jié)果圖。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明，但本發(fā)明并不局限于以下所述的實施例。配置ρΗ7· 6的濃度為0. 068mol/L的Tris-HCl緩沖液，然后加入0. 02mol/L的EGTA，0. 34mol/L的NaCl, 0. 018mol/L的KC1，最后用0. 22 μ m的濾器過濾制得抗凝劑。配置pH7. 6的濃度為0. 001mol/L的Tris-HCl緩沖液，然后加入0. 8mol/L的蔗糖， 0. 34mol/L的NaCl，0. 001mol/L的EGTA，最后用0. 22 μ m的濾器過濾制得蔗糖緩沖液。配置pH7. 6的濃度為0. 01mol/L的Tris-HCl緩沖液，然后加入0. 01mol/L的EGTA， 0. 34mol/L的NaCl，最后用0. 22 μ m的濾器過濾制得等滲緩沖液。無菌注射器分別抽取與抗凝劑等體積的正常和患病刺參體腔液各2. 5ml，放入無菌離心管中，再沿管壁緩慢加入5. Oml的蔗糖緩沖液，水平離心機IOOOrpm離心5分鐘， 收集位于體腔液抗凝液混合物與蔗糖緩沖液之間的吞噬細胞，收集后用等滲緩沖液洗1-2 次，加入含10%胎牛血清和雙抗的L-15培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度為106cfu/mL，所述的雙抗內(nèi)含100IU/ml的青霉素及100μ g/ml的鏈素。劃線分離的酵母細胞單個克隆接種于100ml的YDP液體培養(yǎng)基，溫度26°C，振蕩速度120轉(zhuǎn)/min，培養(yǎng)12小時后，IOOOOg室溫離心10分鐘，收集酵母細胞，并用PBS 洗1-2次，再用PBS重懸定量至lX109Cfu/mL，放入沸水浴中30分鐘致死酵母細胞，然后用PBS沖洗2-3次，離心棄上清，PBS重懸，在37°C避光與FITC共同培養(yǎng)30分鐘，濃度為 0. OlmgFITC/lO9酵母細胞，其間不時搖勻。室溫離心收集標記酵母細胞，PBS洗2_3次至上清無色，然后懸浮于等滲緩沖液中，定量1 X 108cfU/mL，熒光顯微鏡觀察標記情況，4°C避光貯存。標記后的酵母細胞與刺參吞噬細胞的共孵育加FITC標記的酵母細胞于吞噬細胞培養(yǎng)液中，標記的酵母細胞與吞噬細胞的比例約為50 1，室溫，置于水平搖床上慢速搖動60分鐘，取搖勻液IOOOrpm離心5分鐘，棄上清，PBS洗一次，70%乙醇固定10分鐘， IOOOrpm離心5分鐘后棄上清，沉淀加入ImL濃度為0. 5 μ g/mL的EB。流式細胞儀檢測吞噬細胞體外吞噬活性所用流式細胞儀為BD公司生產(chǎn)的，型號為FACSCalibur，設(shè)定儀器基本參數(shù)，前向角(FSC，反映細胞的體積大小)為460，側(cè)向角(SSC，反映細胞的顆粒含量)為399，起始電壓0，數(shù)據(jù)采用Log對數(shù)形式。上樣后先用 FSc-H/Ssc-H圈定巨噬細胞，再采集紅色和綠色熒光強度，并計算實際吞噬率，所得數(shù)據(jù)用 CellQuest Pro Software 軟件分析。計算結(jié)果如下所示
權(quán)利要求
1.刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，其特征在于，首先制備刺參體腔液中的吞噬細胞，然后用熒光素異硫氰酸酯FITC標記熱滅活后的酵母細胞，再將標記后的酵母細胞與刺參吞噬細胞共孵育，最后利用流式細胞儀測定吞噬活性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，其特征在于， 具體包括以下步驟(1)制備刺參體腔液中的吞噬細胞無菌注射器抽取與抗凝劑等體積的刺參體腔液， 放入無菌離心管中，再沿管壁緩慢加入與混合液體積相同的蔗糖緩沖液，在水平離心機 800-1200rpm離心5_10分鐘，收集位于體腔液、抗凝液混合物與蔗糖緩沖液之間的吞噬細胞，收集后用等滲緩沖液洗1-2次，加入含10%胎牛血清和1 %雙抗的L-15培養(yǎng)基，調(diào)整細胞濃度數(shù)量級為IO6CfuAiL ；(2)FITC標記酵母細胞將劃線分離的酵母細胞單克隆接種于YDP液體培養(yǎng)基，26°C或 280C，振蕩培養(yǎng)12-16小時后，室溫5000-8000rpm離心10-20分鐘，收集酵母細胞，并用PBS 洗1-2次，再用PBS重懸定量至1 X 109cfu/mL,放入沸水浴中30-50分鐘殺死酵母細胞，然后用PBS沖洗2-3次，離心棄上清，PBS重懸，在37°C避光與FITC共同培養(yǎng)30-40分鐘，濃度為0. OlmgFITC/lO9酵母細胞，其間不時搖勻，室溫離心收集標記酵母細胞，PBS洗2_3次至上清無色，然后懸浮于等滲緩沖液中，定量1 X 108cfu/mL,熒光顯微鏡觀察標記情況，40C 避光貯存；(3)標記后的酵母細胞與刺參吞噬細胞的共孵育加FITC標記的酵母細胞于吞噬細胞培養(yǎng)液中，且標記的酵母細胞與吞噬細胞的比例為30-50 1，室溫，置于水平搖床上慢速搖動30-120分鐘，取搖勻液800-1000rpm離心5_10分鐘，棄上清，PBS洗一次，70%乙醇固定10-15分鐘，800-1000rpm離心5-10分鐘后棄上清，沉淀加入ImL濃度為0. 5 μ g/mL的 EB ；(4)利用流式細胞儀檢測吞噬細胞體外吞噬活性所用流式細胞儀為BD公司生產(chǎn)的， 型號為FACSCalibur，設(shè)定儀器基本參數(shù)，前向角為460，側(cè)向角為399，起始電壓0，數(shù)據(jù)采用Log對數(shù)形式，上樣后先用FSc-H/Ssc-H圈定巨噬細胞，再采集紅色和綠色熒光強度，并計算實際吞噬率，所得數(shù)據(jù)用CellQuest Pro Software軟件分析。
3 根據(jù)權(quán)利要求2所述的刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，其特征在于， 所述的抗凝劑用以下方法制得先配置PH7. 6的濃度為0. 068mol/L的Tris-HCl緩沖液，然后加入 0. 02mol/L 的 EGTA，0. 34mol/L 的 NaCl，0. 018mol/L 的 KCl，最后用 0. 22 μ m 的濾器過濾即可。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，其特征在于， 所述的蔗糖緩沖液用以下方法制得先配置PH7. 6的濃度為0. OOlmol/L的Tris-HCl緩沖液，然后加入 0. 8mol/L 的蔗糖，0. 34mol/L 的 NaCl, 0. 001mol/L 的 EGTA,最后用 0. 22 μ m 的濾器過濾即可。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，其特征在于， 所述的等滲緩沖液用以下方法制得先配置PH7. 6的濃度為0. 01mol/L的Tris-HCl緩沖液，然后加入0. 01mol/L的EGTA，0. 34mol/L的NaCl，最后用0. 22 μ m的濾器過濾即可。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，其特征在于， 所述的雙抗內(nèi)含100IU/ml的青霉素及100μ g/ml的鏈素。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，其特征在于， 所述的YDP液體培養(yǎng)基由1 %的酵母浸出汁，2%蛋白胨，2%的D-葡萄糖混合，然后滅菌制得。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種刺參體腔細胞吞噬活性的流式細胞檢測方法，屬于海洋生物技術(shù)領(lǐng)域，首先分離、制備刺參體腔液中的吞噬細胞，然后用熒光素異硫氰酸酯FITC標記熱滅活后的酵母細胞，再將標記后的酵母細胞與刺參吞噬細胞共孵育，最后利用流式細胞儀測定吞噬活性。本發(fā)明準確性高、重復(fù)性好，而且操作簡便快速，為探討刺參體腔細胞吞噬功能提供了方法依據(jù)。
文檔編號G01N15/14GK102279147SQ20111006228
公開日2011年12月14日 申請日期2011年3月8日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月8日
發(fā)明者劉洪展, 孫修勤, 屈佩, 鄭風榮 申請人:山東大學威海分校