專利名稱：牛奶中三聚氰胺含量的納米磁珠檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及ー種三聚氰胺含量的檢測(cè)方法，具體為牛奶中三聚氰胺含量的納米磁珠檢測(cè)方法，屬于食品安全領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
2008年的“三鹿嬰幼兒奶粉事件”，引發(fā)了人們對(duì)奶制品安全的極大關(guān)注。雖然國(guó)家采取了很多有力的控制措施，但是，牛奶中三聚氰胺事件仍然屢禁不止。對(duì)此消費(fèi)者非常擔(dān)憂，經(jīng)常聽到家長(zhǎng)說(shuō)“我家孩子喝的牛奶不知有沒(méi)有三聚氰胺？喝什么牛奶好？ ”由于奶粉安全影響到孩子的健康，這對(duì)家長(zhǎng)是頭等大事。因此，面對(duì)我國(guó)面廣量大的牛奶市場(chǎng)，我想能否研究一種能讓普通市民掌握的快速識(shí)別三聚氰胺的方法，讓消費(fèi)者自己能辨別三聚 氰胺，真正喝到放心奶。從資料上發(fā)現(xiàn)，目前檢測(cè)牛奶中三聚氰胺的方法大多是儀器檢測(cè)，經(jīng)常是代價(jià)高又耗時(shí)長(zhǎng)，許多廠家不能檢測(cè)、一般家庭更是無(wú)法掌握。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為了提供了一種牛奶中三聚氰胺含量的納米磁珠檢測(cè)方法；改變了傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)中利用生物酶存在的不足，基于納米技術(shù)研究一種簡(jiǎn)便易行的牛奶中三聚氰胺快速檢測(cè)新方法。本發(fā)明的目的可以通過(guò)以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)。一種牛奶中三聚氰胺含量的納米磁珠檢測(cè)方法，其具體步驟為I)分別取 5. 2g FeCl3 *6H20 和 2. 7969g FeSO4 7H20 以及 12. IM 的濃鹽酸 0. 85mL溶解于200mL H2O中，超聲脫氧，然后將以上溶液滴加到250mL，0. 75M NaOH溶液中；所述反應(yīng)溫度為80°C，磁力攪拌進(jìn)行；2)取25mL上述磁性納米顆粒溶液，加入ImL水，再用こ醇稀釋到150mL，超聲振蕩30分鐘，滴加0. 4mL APTES(或PEG、Dextran)，室溫下攪拌7小時(shí)。反應(yīng)完畢，用磁分離器將納米顆粒從反應(yīng)介質(zhì)中分離，并用こ醇溶液清洗3次，配成不同類型的Fe3O4納米磁珠溶液。3)在ImL底物緩沖液，IOuL H2O2, IOuL磁性納米顆粒，溫度為20°C，pH值為6的條件下，分別添加10、20、50、100、150、200、250和300 u L TMB于反應(yīng)體系中，測(cè)定不同TMB
用量對(duì)磁性納米顆粒類酶活性的影響；在ImL底物緩沖液，200 u LTMB, IOuL磁性納米顆粒，溫度為20°C，pH值為6的條件下，分別添加5、10、15、20、25、和30 ii LH2O2于反應(yīng)體系中，測(cè)定不同H2O2用量對(duì)磁性納米顆粒類酶活性的影響；4)根據(jù)上述結(jié)果，按ImL緩沖液，200 u L TMB, 20 u L雙氧水和10 u L磁性納米顆粒設(shè)置反應(yīng)體系，用HCl或者NaOH來(lái)調(diào)節(jié)反應(yīng)pH值在3 9，溫度4 60°C，反應(yīng)時(shí)間I 8min,研究反應(yīng)條件對(duì)磁性納米顆粒類酶活性的影響5)將不同濃度的三聚氰胺儲(chǔ)備液(甲醛溶解)分別加入本身不含三聚氰胺的2mL牛奶或Ig奶粉中，使其中三聚氰胺的濃度分別為l、5、50、100、500、1000mg/kg，然后在ImL緩沖液中，依次加入200 u L三聚氰胺、20 u L雙氧水混勻lmin，再加入200 u L TMB和10 y LFe3O4納米磁珠，6min后中止反應(yīng)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度。所述的結(jié)果表明，在最優(yōu)化反應(yīng)條件下，牛奶樣品中三聚氰胺的濃度對(duì)數(shù)與吸光度值呈顯著的線性相關(guān)關(guān)系，直線回歸方程為Y = -0. 3087X+1. 401，其中，反應(yīng)物TMB和H2O2的最佳用量分別為200和20ii L，最佳反應(yīng)pH值為4，溫度和反應(yīng)時(shí)間分別為20°C和6分鐘。制作納米磁珠檢測(cè)牛奶三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)色卡。上述條件下建立的牛奶中三聚氰胺Fe3O4納米磁珠檢測(cè)方法，具有檢測(cè)時(shí)間短、成本低、穩(wěn)定性好、檢測(cè)試劑易回收和反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)時(shí)、靈敏地檢測(cè)三聚氰胺中具有重要的應(yīng)用前景。


圖I為四種納米磁珠催化顯色與活性的比較；圖2為TMB與H2O2對(duì)Fe3O4納米磁珠催化反應(yīng)的影響；圖3為反應(yīng)條件對(duì)Fe3O4磁性納米材料催化酶學(xué)反應(yīng)的影響；圖4為基于納米磁珠的三聚氰胺檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖與具體實(shí)施例進(jìn)ー步闡述本發(fā)明的技術(shù)特點(diǎn)。(一 )材料I.試劑=FeCl3 6H20、FeSO4 7H20、HC1、Na0H、3_ 氨丙基三こ氧基硅烷(APTES)、聚こニ醇(PEG)、葡聚糖(Dextran)。2.儀器紫外分光光度計(jì)( ニ )方法I.不同納米磁珠的制備分別取5. 2g FeCl3 6H20 和 2. 7969g FeSO4 7H20 以及 12. IM 的濃鹽酸 0. 85mL 溶解于200mL H2O中，超聲脫氧，然后將以上溶液滴加到250mL，0. 75M NaOH溶液中。所有反應(yīng)溫度為80°C，磁力攪拌進(jìn)行。取25mL上述磁性納米顆粒溶液，加入ImL水，再用こ醇稀釋到150mL，超聲振蕩30分鐘，滴加0. 4mL APTES (或PEG、Dextran)，室溫下攪拌7小時(shí)。反應(yīng)完畢，用磁分離器將納米顆粒從反應(yīng)介質(zhì)中分離，并用こ醇溶液清洗3次，配成不同類型的Fe3O4納米磁珠溶液。2.反應(yīng)物對(duì)納米磁珠類酶活性的影響在ImL底物緩沖液，IOuL H2O2, IOuL磁性納米顆粒，溫度為20°C，pH值為6的條件下，分別添加10、20、50、100、150、200、250和300 ii L TMB于反應(yīng)體系中，測(cè)定不同TMB用
量對(duì)磁性納米顆粒類酶活性的影響。在ImL底物緩沖液，200 u LTMB, IOuL磁性納米顆粒，溫度為20°C，pH值為6的條 件下，分別添加5、10、15、20、25、和30 ii LH2O2于反應(yīng)體系中，測(cè)定不同H202用量對(duì)磁性納米顆粒類酶活性的影響
3.反應(yīng)條件對(duì)磁性納米顆粒類酶活性的影響根據(jù)上述結(jié)果，按ImL緩沖液，200 u L TMB, 20 u L雙氧水和10 y L磁性納米顆粒設(shè)置反應(yīng)體系，用HCl或者NaOH來(lái)調(diào)節(jié)反應(yīng)pH值在3 9，溫度4 60°C，反應(yīng)時(shí)間I 8min,研究反應(yīng)條件對(duì)磁性納米顆粒類酶活性的影響其中,pH值從I開始,姆I個(gè)pH數(shù)值做一次實(shí)驗(yàn) ，溫度每10°C左右測(cè)ー個(gè)值；反應(yīng)時(shí)間控制，用計(jì)時(shí)器來(lái)計(jì)算時(shí)間，每2分鐘測(cè)
算ー個(gè)值。4.三聚氰胺納米磁珠檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線制作將不同濃度的三聚氰胺儲(chǔ)備液(甲醛溶解)分別加入本身不含三聚氰胺的2mL牛奶或Ig奶粉中，使其中三聚氰胺的濃度分別為l、5、50、100、500、1000mg/kg，然后在ImL緩沖液中，依次加入200 u L三聚氰胺、20 u L雙氧水混勻lmin，再加入200 u L TMB和10 y LFe3O4納米磁珠，6min后中止反應(yīng)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度。 由圖I所示,在IOmin反應(yīng)時(shí)間內(nèi)，不同納米磁珠催化活性大小依次為=Fe3O4 >Dextran > PEG > APTES,可見Fe3O4納米磁珠的催化活性顯著優(yōu)于其修飾磁珠Fe3O4納米磁珠催化顯色反應(yīng)研究表明，采用共沉淀法制備的Fe3O4納米磁珠溶液呈黑色狀。利用磁分離器可將納米磁珠從反應(yīng)介質(zhì)中沉淀分離出來(lái)。催化顯色反應(yīng)表明，加入納米磁珠可使溶液呈藍(lán)色，未加納米磁珠的溶液呈淡藍(lán)色，說(shuō)明所制備的Fe3O4納米磁珠具有明顯的催化作用。由圖2所示，在其他條件固定的情況下，TMB和H2O2對(duì)Fe3O4磁性納米顆粒的相對(duì)催化活性均呈現(xiàn)先上升，后下降的現(xiàn)象。表現(xiàn)為Iml底物緩沖液中，TMB和H2O2的用量分別為200 ii L和20 ii L吋，F(xiàn)e3O4納米磁珠類酶催化活性最大。由圖3所示，溫度、pH和反應(yīng)時(shí)間是酶催化反應(yīng)中的主要影響因素。由圖3a可見，溫度超過(guò)20°C之后，納米磁珠的酶催化活性大大下降，而常規(guī)生物酶的最佳溫度在35°C左右。從實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)溫度超過(guò)60°C之后再降溫回到20°C，反應(yīng)還是可以進(jìn)行，說(shuō)明溫度不會(huì)破壞納米磁珠的類酶催化活性，而高溫卻可以破壞生物酶的活性的，所以納米磁珠的類酶催化活性具有很大的優(yōu)勢(shì)，實(shí)驗(yàn)得到最適反應(yīng)溫度為20°C。圖3b表明Fe3O4納米磁珠在酸性條件下具有較高的類酶催化活性，隨著pH值的增カロ，反應(yīng)活性大大下降，PH值大于7時(shí)，納米磁珠失去催化活性。實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)pH值達(dá)到9后，再加酸將pH值降下來(lái)，反應(yīng)恢復(fù)進(jìn)行，說(shuō)明堿性會(huì)抑制納米磁珠類酶催化活性，但不會(huì)破壞磁性納米顆粒的結(jié)構(gòu)，而過(guò)酸過(guò)堿卻是可以破壞生物酶的活性的，得到最適反應(yīng)pH為4。圖3c為時(shí)間對(duì)Fe3O4納米磁珠催化活性的影響，圖中可見，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，反應(yīng)產(chǎn)物不斷増加，反應(yīng)6min吋，產(chǎn)物達(dá)到最大值，6min以后，反應(yīng)產(chǎn)物將不再增加，選擇6min反應(yīng)時(shí)間為本實(shí)驗(yàn)條件下Fe3O4納米磁珠的最佳催化反應(yīng)時(shí)間。由圖4可見，采用納米磁珠檢測(cè)技木，牛奶樣品中的三聚氰胺濃度對(duì)數(shù)與吸光度值呈顯著的線性相關(guān)關(guān)系，直線回歸方程為Y = -0. 3087X+1. 401，決定系數(shù)R2為0. 9476。由此制得的牛奶中三聚氰胺的速測(cè)卡。
權(quán)利要求
1.一種牛奶中三聚氰胺含量的納米磁珠檢測(cè)方法，其特征在于其具體步驟為1)分別取5. 2g FeCl3 6H20 和 2. 7969g FeSO4 7H20 以及 12. IM 的濃鹽酸 0. 85mL 溶解于200mL H2O中，超聲脫氧，然后將以上溶液滴加到250mL，0. 75M NaOH溶液中；所述反應(yīng)溫度為80°C，磁力攪拌進(jìn)行； 2)取25mL上述磁性納米顆粒溶液，加入ImL水，再用こ醇稀釋到150mL，超聲振蕩30分鐘，滴加0. 4mL APTES(或PEG、Dextran)，室溫下攪拌7小時(shí)。反應(yīng)完畢，用磁分離器將納米顆粒從反應(yīng)介質(zhì)中分離，并用こ醇溶液清洗3次，配成不同類型的Fe3O4納米磁珠溶液； 3)在ImL底物緩沖液，IOuLH2O2, IOuL磁性納米顆粒，溫度為20°C，pH值為6的條件下，分別添加10、20、50、100、150、200、250和300 ii L TMB于反應(yīng)體系中，測(cè)定不同TMB用量對(duì)磁性納米顆粒類酶活性的影響；在ImL底物緩沖液，200 u LTMB, IOuL磁性納米顆粒，溫度為20。。，pH值為6的條件下，分別添加5、10、15、20、25、和30 u L H2O2于反應(yīng)體系中，測(cè)定不同H2O2用量對(duì)磁性納米顆粒類酶活性的影響； 4)根據(jù)上述結(jié)果，按ImL緩沖液，200u L TMB, 20 u L雙氧水和10 y L磁性納米顆粒設(shè)置反應(yīng)體系，用HCl或者NaOH來(lái)調(diào)節(jié)反應(yīng)pH值在3_9，溫度4_60°C，反應(yīng)時(shí)間l_8min，研究反應(yīng)條件對(duì)磁性納米顆粒類酶活性的影響； 5)將不同濃度的三聚氰胺儲(chǔ)備液(甲醛溶解)分別加入本身不含三聚氰胺的2mL牛奶或Ig奶粉中，使其中三聚氰胺的濃度分別為l、5、50、100、500、1000mg/kg，然后在ImL緩沖液中，依次加入200 u L三聚氰胺、20 u L雙氧水混勻lmin，再加入200 u L TMB和10 y LFe3O4納米磁珠，6min后中止反應(yīng)，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定其吸光度。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的ー種牛奶中三聚氰胺含量的納米磁珠檢測(cè)方法，其特征在于所述的反應(yīng)物TMB和H2O2的用量分別為200和20 u L，反應(yīng)pH值為4，溫度和反應(yīng)時(shí)間分別為20°C和6分鐘。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的ー種牛奶中三聚氰胺含量的納米磁珠檢測(cè)方法，其特征在干在所述反應(yīng)條件下，牛奶樣品中三聚氰胺的濃度對(duì)數(shù)與吸光度值呈顯著的線性相關(guān)關(guān)系，直線回歸方程為Y = -0. 3087X+1. 401，決定系數(shù)R2為0. 9476。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的ー種牛奶中三聚氰胺含量的納米磁珠檢測(cè)方法，其特征在干根據(jù)所述的直線回歸方程制作納米磁珠檢測(cè)牛奶三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)色卡。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種牛奶中三聚氰胺含量的納米磁珠檢測(cè)方法，利用納米磁珠對(duì)過(guò)氧化氫和酶底物反應(yīng)的催化作用，在研究比較四種自制納米磁珠模擬酶催化特性的基礎(chǔ)上，建立了基于Fe3O4-H2O2-TMB反應(yīng)體系的牛奶中微量三聚氰胺定性與半定量快速檢測(cè)新方法，牛奶樣品中三聚氰胺的濃度對(duì)數(shù)與吸光度值呈顯著的線性相關(guān)關(guān)系，直線回歸方程為Y＝-0.3087X+1.401，下建立的牛奶中三聚氰胺Fe3O4納米磁珠檢測(cè)方法，具有檢測(cè)時(shí)間短、成本低、穩(wěn)定性好、檢測(cè)試劑易回收和反復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)時(shí)、靈敏地檢測(cè)三聚氰胺中具有重要的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N21/33GK102654453SQ201110051660
公開日2012年9月5日 申請(qǐng)日期2011年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月4日
發(fā)明者沈安彪 申請(qǐng)人:上海市南洋模范中學(xué)