專(zhuān)利名稱(chēng)：檢棒分析中改良的檢測(cè)信號(hào)及捕獲的制作方法
檢棒分析中改良的檢測(cè)信號(hào)及捕獲本發(fā)明涉及改良檢棒(dipstick)核酸檢測(cè)的靈敏度，本發(fā)明的檢棒用以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，例如鑒定病患是否感染致病微生物，如砂眼衣原體(Chlamydia trachomatis，CT)0用于檢測(cè)樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的一些常規(guī)測(cè)試依賴(lài)?yán)镁酆厦告準(zhǔn)竭B鎖反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增目標(biāo)核酸。此反應(yīng)可檢測(cè)小量的目標(biāo)核酸，然而得到結(jié)果前需耗時(shí)數(shù)小時(shí)，但因通常希望可盡快得到結(jié)果，例如使病人等待的時(shí)間減至最少，故此為其顯著缺點(diǎn)。這種方法的進(jìn)一步缺點(diǎn)是需要昂貴的專(zhuān)家設(shè)備進(jìn)行反應(yīng)以及相當(dāng)高成本的試劑。相反，檢棒可檢測(cè)未擴(kuò)增的目標(biāo)核酸，不需任何專(zhuān)家設(shè)備且能比基于PCR的方法更快速地得到結(jié)果。病人就可于同時(shí)接受治療，故特別有益于不喜歡或不能日后復(fù)診的病人。檢棒分析的成本也顯著低于PCR基礎(chǔ)的測(cè)試。US 5，310，650所述的典型常規(guī)檢棒中，單鏈DNA捕獲探針固定于硝化纖維素濾器上遠(yuǎn)離過(guò)濾器末端(接觸端)的捕獲區(qū)。捕獲探針序列互補(bǔ)于欲測(cè)目標(biāo)核酸第一區(qū)域的序列。標(biāo)記的單鏈DNA檢測(cè)探針固定于硝化纖維素濾器上捕獲區(qū)及濾器接觸端間的探針區(qū)。 檢測(cè)探針含有互補(bǔ)于目標(biāo)核酸第二區(qū)域序列(不同于第一區(qū)域)的序列。在認(rèn)為含有目標(biāo)DNA的樣品溶液中檢測(cè)目標(biāo)DNA時(shí)，將硝化纖維素濾器的接觸端接觸樣品溶液。樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用進(jìn)入濾紙并經(jīng)過(guò)探針區(qū)及捕獲區(qū)。當(dāng)樣品溶液經(jīng)過(guò)探針區(qū)時(shí)，可使檢測(cè)探針移動(dòng)并使其與樣品溶液一起朝向捕獲區(qū)上升。然后移動(dòng)的檢測(cè)探針能雜交到樣品溶液中存在的任何目標(biāo)DNA的第二區(qū)域。當(dāng)雜交的檢測(cè)探針及目標(biāo)DNA到達(dá)捕獲區(qū)時(shí)，目標(biāo)DNA的第一區(qū)域能雜交到固定的捕獲探針。由此在目標(biāo)核酸、捕獲探針及標(biāo)記的檢測(cè)探針之間形成三重復(fù)合物。捕獲區(qū)出現(xiàn)標(biāo)記時(shí)說(shuō)明樣品溶液中存在目標(biāo)DNA。至于第二類(lèi)常規(guī)檢棒，標(biāo)記的DNA檢測(cè)探針未固定于硝化纖維素濾器上，而是在允許檢測(cè)探針雜交到樣品溶液中任何目標(biāo)核酸的條件下將檢測(cè)探針加入到樣品溶液中。然后將硝化纖維素濾器的接觸端接觸樣品溶液且雜交檢測(cè)探針的任何目標(biāo)核酸在捕獲區(qū)被捕獲探針捕獲。然而，已發(fā)現(xiàn)常規(guī)檢棒的核酸檢測(cè)的靈敏度甚低，尤其當(dāng)目標(biāo)核酸為雙鏈時(shí)。因此，在樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在有時(shí)并不能被檢測(cè)。認(rèn)為環(huán)狀雙鏈目標(biāo)核酸事實(shí)上并不能使用常規(guī)檢棒測(cè)試檢測(cè)，因此需要改進(jìn)目標(biāo)核酸的檢棒檢測(cè)靈敏度。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，其提供多種不同檢測(cè)探針在檢棒分析中的用途，以測(cè)試在樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，各檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，由此允許利用檢測(cè)探針檢測(cè)目標(biāo)核酸。在此使用的術(shù)語(yǔ)“檢棒分析”是指使用檢棒的任何分析，其中樣品溶液與檢棒接觸以使樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至檢棒的捕獲帶，由此允許樣品溶液中的目標(biāo)核酸于捕獲帶中被捕獲并檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，其亦提供試劑盒以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，其包含
i)檢棒，其包括層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑；及捕獲部分，固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶，該捕獲部分能夠直接或間接結(jié)合目標(biāo)核酸，及ii)多種檢測(cè)探針，各檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，并由此允許利用檢測(cè)探針檢測(cè)目標(biāo)核酸。根據(jù)本發(fā)明的第一方面，其亦提供檢棒用以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，其包括層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分，該捕獲部分能夠直接或間接地結(jié)合目標(biāo)核酸；及多種檢測(cè)探針，可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶上，每一檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸不同區(qū)域，由此允許利用檢測(cè)探針檢測(cè)目標(biāo)核酸。使用檢測(cè)探針檢測(cè)目標(biāo)核酸，每一檢測(cè)探針可包含標(biāo)記，允許利用檢測(cè)探針直接檢測(cè)目標(biāo)核酸，或每一檢測(cè)探針可包含檢測(cè)配體，允許利用檢測(cè)探針間接檢測(cè)目標(biāo)核酸。每一檢測(cè)探針可包含多種標(biāo)記或多種檢測(cè)配體。如果檢測(cè)探針包含檢測(cè)配體，使用檢測(cè)探針間接檢測(cè)目標(biāo)核酸可通過(guò)使用標(biāo)記的檢測(cè)配體結(jié)合部分而實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)配體結(jié)合部分能被多重標(biāo)記，例如多重標(biāo)記的抗體能夠結(jié)合檢測(cè)配體。在此使用的術(shù)語(yǔ)"層析片"是指通過(guò)毛細(xì)現(xiàn)象運(yùn)送溶液的任何多孔帶狀物質(zhì)。本發(fā)明第一方面的檢棒及試劑盒可用于檢測(cè)目標(biāo)核酸的方法中，其相似于上述那些常規(guī)檢棒分析，在那些方法中，能夠雜交目標(biāo)核酸的捕獲探針被固定于檢棒的捕獲帶上。 然而，通過(guò)一些其它的安排，目標(biāo)核酸能被捕獲至捕獲帶，而其亦在本發(fā)明的范圍內(nèi)。固定于捕獲帶的捕獲部分能夠通過(guò)堿基配對(duì)或非堿基配對(duì)相互作用，直接或間接地結(jié)合目標(biāo)核酸。例如捕獲部分可包含捕獲探針，其能夠直接雜交目標(biāo)核酸或結(jié)合了目標(biāo)核酸的吊鉤捕獲探針。該吊鉤捕獲探針包含可雜交目標(biāo)核酸的第一區(qū)域，及可雜交捕獲探針的第二區(qū)域?？商砑拥蹉^捕獲探針至樣品溶液，而使其能夠結(jié)合樣品溶液中的目標(biāo)核酸，且當(dāng)樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用上移至檢棒時(shí)，其可被捕獲探針捕獲。捕獲部分或者可為捕獲配體結(jié)合部分，其能夠結(jié)合偶聯(lián)了捕獲探針(結(jié)合于目標(biāo)核酸)的捕獲配體，由此允許捕獲部分間接結(jié)合目標(biāo)核酸。例如捕獲部分可為抗體或抗體片段。在此種安排下，可在樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用遷移上檢棒之前，添加捕獲探針至樣品溶液中，并使其雜交其中的目標(biāo)核酸。捕獲探針、吊鉤捕獲探針及檢測(cè)探針能各自含有至少一種核酸或核酸類(lèi)似物。當(dāng)探針含有多于一種核酸或核酸類(lèi)似物，優(yōu)選其雜交在一起。根據(jù)本發(fā)明第二方面，其提供檢測(cè)探針在檢棒分析中的用途，以測(cè)試在樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，該檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸。其中檢測(cè)探針包含多種標(biāo)記，當(dāng)檢測(cè)探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)可直接檢測(cè)目標(biāo)核酸，或其中檢測(cè)探針包含多種檢測(cè)配體，當(dāng)檢測(cè)探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，其可被檢測(cè)配體結(jié)合部分結(jié)合并由此允許間接檢測(cè)目標(biāo)核酸。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，其亦提供試劑盒以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，其包含i)檢棒，其包括層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑；固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分，該捕獲部分能夠直接或間接結(jié)合目標(biāo)核酸，及ii)檢測(cè)探針，其能夠雜交目標(biāo)核酸，其中檢測(cè)探針包含多種標(biāo)記，允許使用檢測(cè)探針直接檢測(cè)目標(biāo)核酸，或檢測(cè)探針包含多種檢測(cè)配體，允許使用檢測(cè)探針間接檢測(cè)目標(biāo)核酸。根據(jù)本發(fā)明的第二方面，其亦提供檢棒用以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，其包含層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑；固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分，該捕獲部分能夠直接或間接結(jié)合目標(biāo)核酸，及檢測(cè)探針，其可釋放地固定于層析片的接觸端與捕獲帶之間，該檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸，其中檢測(cè)探針包含多種標(biāo)記，允許使用檢測(cè)探針直接檢測(cè)目標(biāo)核酸，或檢測(cè)探針包含多種檢測(cè)配體，允許使用檢測(cè)探針間接檢測(cè)目標(biāo)核酸。本發(fā)明第二方面的捕獲部分能包含捕獲探針，其能夠直接地雜交目標(biāo)核酸或已結(jié)合目標(biāo)核酸的吊鉤捕獲探針，或者，該捕獲部份可包含捕獲配體結(jié)合部分，其能夠結(jié)合已結(jié)合目標(biāo)核酸的捕獲探針的捕獲配體。如果捕獲部分包含能夠結(jié)合捕獲配體的捕獲配體結(jié)合部分，則本發(fā)明的試劑盒或檢棒能進(jìn)一步包含含有捕獲配體的捕獲探針。根據(jù)本發(fā)明第三方面，其提供多種不同檢測(cè)探針在檢棒分析中的用途，以測(cè)試在樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，每一測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，由此目標(biāo)核酸被固定于檢棒上且能夠結(jié)合捕獲探針的捕獲部分捕獲至檢棒上。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，其亦提供試劑盒以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，其包含i)檢棒，包括層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑；及固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；ii)多種捕獲探針，各捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，且當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，各捕獲探針能夠被捕獲部分結(jié)合；及可選地iii)檢測(cè)探針，能夠雜交目標(biāo)核酸，并由此允許使用檢測(cè)探針直接檢測(cè)目標(biāo)核酸， 該檢測(cè)探針可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶，或檢測(cè)探針與檢棒相分離。根據(jù)本發(fā)明的第三方面，其亦提供檢棒以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，其包含層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑；固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；
多種捕獲探針，可釋放地固定于層析片上接觸端與捕獲帶之間的探針帶，各捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，且當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，各捕獲探針能夠被捕獲部分結(jié)合。本發(fā)明第三方面的各捕獲探針能包含捕獲配體，其能被捕獲部分結(jié)合。本發(fā)明第三方面的各捕獲探針能包含多種捕獲配體，其中每個(gè)能被捕獲部分結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明第四方面，其提供捕獲探針在檢棒分析中的用途，以測(cè)試在樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸，其中捕獲探針包含多種捕獲配體，其能被檢棒的捕獲配體結(jié)合部分結(jié)合，由此允許將目標(biāo)核酸捕獲至檢棒上。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，其亦提供試劑盒以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，其包含i)檢棒，其包括層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑；及固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；ii)捕獲探針，其能夠雜交目標(biāo)核酸，其中捕獲探針偶聯(lián)多種捕獲配體，后者當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，各自能被捕獲部分結(jié)合；及可選地iii)檢測(cè)探針，能夠雜交目標(biāo)核酸，并由此允許使用檢測(cè)探針檢測(cè)目標(biāo)核酸，該檢測(cè)探針可釋放地固定于層析片上接觸端與捕獲帶之間的探針帶，或該檢測(cè)探針與檢棒相分離。根據(jù)本發(fā)明的第四方面，其亦提供檢棒以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，其包含層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑；固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；捕獲探針，其可釋放地固定于層析片上接觸端與捕獲帶之間的探針帶，捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸，其中捕獲探針包含多種捕獲配體，后者當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，各自能被捕獲部分結(jié)合。本發(fā)明第四方面的試劑盒的檢測(cè)探針包含標(biāo)記，允許使用檢測(cè)探針直接檢測(cè)目標(biāo)核酸，或包含檢測(cè)配體，允許使用檢測(cè)探針間接檢測(cè)目標(biāo)核酸。包括含一或多個(gè)檢測(cè)配體的本發(fā)明試劑盒及檢棒能進(jìn)一步包含已標(biāo)記的檢測(cè)配體結(jié)合部分，用以在檢棒的捕獲帶上檢測(cè)結(jié)合目標(biāo)核酸的檢測(cè)探針。優(yōu)選標(biāo)記為非放射性，合適的標(biāo)記例子包括紡織染料、如膠體金的金屬溶膠，及如有色乳膠粒子的有色粒子。適合的配體的例子包括生物素(例如通過(guò)抗生物素抗體，或通過(guò)含標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白的部分而可被檢測(cè))、螢光素(例如通過(guò)標(biāo)記的抗螢光素抗體而可被檢測(cè))及2，4_ 二硝苯酚(DNP)(例如通過(guò)抗DNP抗體而可被檢測(cè))。須知，發(fā)明的試劑盒能進(jìn)一步包含在樣品溶液中檢測(cè)目標(biāo)核酸所需的任何試劑。適當(dāng)?shù)?，本發(fā)明的試劑盒及檢棒能用于下列類(lèi)型的檢棒分析中，以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在1)提供檢棒，其包含層析片，后者具有接觸端及固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲探針，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸。在檢測(cè)探針雜交目標(biāo)核酸的條件下，將檢測(cè)探針 (或多種不同檢測(cè)探針)與樣品溶液接觸。樣品溶液與檢棒的接觸端接觸，以使樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至檢棒的捕獲帶，由此允許目標(biāo)核酸及檢測(cè)探針(或探針)隨著樣品溶液一起移至捕獲帶，而目標(biāo)核酸于捕獲帶被捕獲。然后在捕獲帶檢測(cè)檢測(cè)探針(或探針)。檢測(cè)探針(或探針)存在于捕獲帶指示目標(biāo)核酸存在于樣品溶液中。在本分析的變化中，檢測(cè)探針(或探針)可以可釋放地固定在檢棒的接觸端與捕獲帶之間，而不與檢棒相分離。當(dāng)樣品溶液與檢棒的接觸端接觸，以使樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至捕獲帶時(shí)，檢測(cè)探針(或探針)被釋放入樣品溶液，而使釋放的檢測(cè)探針(或探針) 在樣品溶液移向捕獲帶時(shí)能雜交其中的目標(biāo)核酸。在本分析的進(jìn)一步變化中，檢測(cè)探針(或探針)可與樣品溶液分離，并與檢棒的接觸端接觸。這通常在檢棒的接觸端已與樣品溶液接觸后進(jìn)行。檢測(cè)探針(或探針)能直接地與捕獲帶接觸，或檢測(cè)探針(或探針)能于分離的探針溶液中與檢棒的接觸端接觸而使探針溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至捕獲帶。2)提供檢棒，其包含層析片，后者具有接觸端及固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲探針，該捕獲部分能夠結(jié)合雜交了目標(biāo)核酸的捕獲探針。在捕獲探針(或探針)雜交目標(biāo)核酸的條件下，將捕獲探針(或多種不同捕獲探針)與樣品溶液接觸。樣品溶液與檢棒的接觸端接觸，以使樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至檢棒的捕獲帶，由此允許目標(biāo)核酸及捕獲探針(或探針)與樣品溶液一起移至捕獲帶，且目標(biāo)核酸通過(guò)捕獲部分結(jié)合捕獲探針而在捕獲帶被捕獲。隨后在捕獲帶檢測(cè)目標(biāo)核酸?？墒褂萌绶治?1)描述的檢測(cè)探針(或探針) 檢測(cè)目標(biāo)核酸。檢測(cè)探針(或探針)可同捕獲探針一起加于樣品溶液，或與捕獲探針?lè)謩e加入(以任何順序)?；蛘?，檢測(cè)探針(或探針)可釋放地固定至檢棒上接觸端與捕獲帶之間，或如分析(1)所述可分別地與捕獲帶接觸。在分析( 的變化中，捕獲探針(或探針)不與樣品溶液混合，而是可釋放地固定至檢棒的接觸端與捕獲帶之間。當(dāng)檢棒的接觸端與品溶液接觸，以使樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至捕獲帶時(shí)，將捕獲探針(或探針)釋放入樣品溶液，而使釋放的捕獲探針(或探針) 在樣品溶液移向捕獲帶時(shí)能雜交其中的目標(biāo)核酸。目標(biāo)核酸可使用檢測(cè)探針(或探針)檢測(cè)，后者可與樣品溶液接觸，可以可釋放地固定至檢棒的接觸端與捕獲帶之間，或分別地與捕獲帶接觸。在分析O)的進(jìn)一步變化中，捕獲探針(或探針)可在樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用達(dá)到捕獲帶之前(或特別地于同時(shí))與捕獲帶接觸。此將允許捕獲探針(或探針)在捕獲帶被捕獲部分結(jié)合，而使目標(biāo)核酸能被捕獲。捕獲探針(或探針)可以是分離的捕獲探針溶液，其可以通過(guò)直接應(yīng)用于捕獲帶或通過(guò)捕獲探針溶液與檢棒的接觸端接觸并使捕獲探針 (或探針)通過(guò)毛細(xì)作用移至捕獲帶而分別地與捕獲帶接觸。隨后檢棒的接觸端與樣品溶液接觸而使目標(biāo)核酸通過(guò)毛細(xì)作用移至捕獲帶。再次，能使用檢測(cè)探針(或探針)檢測(cè)目標(biāo)核酸，后者可以與樣品溶液接觸，可以可釋放地固定至檢棒的接觸端與捕獲帶之間，或者分別地與捕獲帶接觸。作為檢測(cè)探針(或探針)在分析O)中的用途的另一種形式，目標(biāo)核酸能于樣品中直接被標(biāo)記，例如通過(guò)共價(jià)附著標(biāo)記于目標(biāo)核酸。這可以通過(guò)將前體標(biāo)記與樣品溶液接觸，并在前體標(biāo)記共價(jià)附著目標(biāo)核酸的條件下，孵育樣品溶液與前體標(biāo)記。分析O)的捕獲部份可為能夠雜交捕獲探針的通用捕獲探針，或捕獲部分能夠通過(guò)非堿基配對(duì)相互作用結(jié)合捕獲探針。例如當(dāng)捕獲探針包含一或多種捕獲配體時(shí)，則捕獲部分為捕獲配體結(jié)合部分。當(dāng)檢棒分析使用一種以上的能夠雜交目標(biāo)核酸的探針時(shí)，則優(yōu)選將所有探針添加至樣品溶液，且雜交完成于單一步驟中。這樣簡(jiǎn)化分析，且使得施行更容易且更快速?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)使用單一步驟雜交分析的目標(biāo)核酸的檢測(cè)靈敏度大致上相當(dāng)于在多步驟中完成雜交的檢測(cè)靈敏度。多步驟雜交可通過(guò)用不同探針相繼對(duì)樣品溶液中的目標(biāo)核酸雜交而完成， 或通過(guò)將檢棒與各含不同探針的不同溶液接觸而完成。一般來(lái)說(shuō)，后一種多步驟雜交方法在檢棒接觸不同探針溶液之間將需要加以清洗。雖然有優(yōu)選多步驟雜交的情況，但須知較簡(jiǎn)單而快速的單一步驟雜交通常優(yōu)選。更優(yōu)選樣品溶液含有合適的組成允許在單一雜交步驟發(fā)生雜交反應(yīng)，并允許非堿基配對(duì)相互作用發(fā)生(例如于檢測(cè)配體及檢測(cè)配體結(jié)合部分之間，以及于捕獲配體及捕獲配體結(jié)合部分之間)，且允許通過(guò)毛細(xì)作用運(yùn)送包含目標(biāo)核酸及一或多種雜交的探針及 (可選地)配體結(jié)合部分的復(fù)合物至檢棒上。使用這種樣品溶液，須知在樣品溶液直接接觸檢棒的接觸端之前(不需事前稀釋或改變樣品溶液)，雜交反應(yīng)能發(fā)生于單一步驟，且任何配體-配體結(jié)合部分交互作用可以發(fā)生。當(dāng)樣品溶液向捕獲帶遷移時(shí)，如需要?jiǎng)t任何配體-配體結(jié)合部分交互作用可附帶地或另外地發(fā)生于檢棒上。由此利于簡(jiǎn)單而快速的目標(biāo)核酸的檢棒檢測(cè)。本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)這些結(jié)果以含具有鹽、去污劑及如BSA或奶粉的封阻蛋白的標(biāo)準(zhǔn)雜交緩沖液(如SSPE緩沖液或Tris緩沖液)的樣品溶液而完成。已發(fā)現(xiàn)使用這種分析的目標(biāo)核酸的檢測(cè)靈敏度同其它檢棒分析大約相等或更好。優(yōu)選目標(biāo)核酸上捕獲探針和檢測(cè)探針的結(jié)合區(qū)域相隔至少10個(gè)核苷酸。根據(jù)本發(fā)明，其亦提供本發(fā)明的檢棒或試劑盒的用途，用以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，優(yōu)選目標(biāo)核酸為砂眼衣原體核酸。根據(jù)本發(fā)明，其亦提供探針以檢測(cè)或捕獲目標(biāo)核酸，其包含能夠雜交目標(biāo)核酸的核酸或核酸類(lèi)似物，其中核酸或核酸類(lèi)似物偶聯(lián)多種標(biāo)記，而允許當(dāng)探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)直接檢測(cè)目標(biāo)核酸，或其中核酸偶聯(lián)多種配體，當(dāng)探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，其能被配體結(jié)合部分結(jié)合以檢測(cè)或捕獲目標(biāo)核酸。為了連接配體或標(biāo)記至核酸或核酸類(lèi)似物，有時(shí)候必須使用修飾物(modifier)， 其包含能夠與核酸或核酸類(lèi)似物反應(yīng)的第一反應(yīng)基團(tuán)，及能夠與配體或標(biāo)記反應(yīng)的第二反
應(yīng)基團(tuán)。例如第一反應(yīng)基團(tuán)可包含能夠與核酸或核酸類(lèi)似物的羥基反應(yīng)的亞磷酰胺。如果配體或標(biāo)記包含羧基，則第二反應(yīng)基團(tuán)可包含伯胺基。連結(jié)配體或標(biāo)記至核酸或類(lèi)似物的 5，-OH或3，-OH的適合修飾物例子為6-(三氟乙酰氨基)己基-(2-氰乙基)-(N，，N- 二異丙基)-亞磷酰胺(C6-TFA)。圖5顯示一些其它適合連接配體或標(biāo)記至核酸或類(lèi)似物的內(nèi)部OH-基的修飾物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，這些修飾物進(jìn)一步包含與磷酸基反應(yīng)的第三反應(yīng)基團(tuán)(被保護(hù)的OH基)，由此通過(guò)亞磷酰胺與被保護(hù)的OH基反應(yīng)而使核苷酸連接在一起，圖5顯示與生物素反應(yīng)后的化學(xué)結(jié)構(gòu)。一旦修飾物已經(jīng)與核酸或核酸類(lèi)似物及配體或標(biāo)記反應(yīng)而連結(jié)核酸或核酸類(lèi)似物至配體或標(biāo)記，則反應(yīng)修飾物在此被稱(chēng)為”連接子”。
對(duì)于多種標(biāo)記或配體中的每一種標(biāo)記或配體，連接子可共價(jià)地偶聯(lián)標(biāo)記或配體至核酸或核酸類(lèi)似物，因而形成梳狀結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖4)。多種標(biāo)記或配體能被分支的連接子共價(jià)地偶聯(lián)于核酸或核酸類(lèi)似物，因而形成叉狀構(gòu)造(見(jiàn)圖4)。連接子優(yōu)選包含非核苷酸，優(yōu)選聚乙二醇。優(yōu)選配體或標(biāo)記由間隔臂(spacer)偶聯(lián)于核酸或核酸類(lèi)似物。為了連結(jié)配體或標(biāo)記至間隔臂，有時(shí)必須使用修飾物(modifier)，其包含能與間隔臂反應(yīng)的第一反應(yīng)基團(tuán)及能與配體或標(biāo)記反應(yīng)的第二反應(yīng)基團(tuán)，合適的調(diào)節(jié)劑例子為C6-TFA。一旦修飾物已經(jīng)與間隔臂及配體或標(biāo)記反應(yīng)而連結(jié)間隔臂至配體或標(biāo)記，則反應(yīng)修飾物在此被稱(chēng)為”連接子”。優(yōu)選的間隔臂包含核苷酸或六乙二醇磷酸。優(yōu)選標(biāo)記為非放射標(biāo)記。本發(fā)明的實(shí)施方案現(xiàn)參考附圖以實(shí)施例敘述，其中

圖1說(shuō)明測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法；圖2概要地說(shuō)明實(shí)施例1的實(shí)驗(yàn)構(gòu)成；圖3概要地說(shuō)明實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)構(gòu)成；圖4概要顯示偶聯(lián)多檢測(cè)配體的檢測(cè)探針的兩種不同安排；及圖5顯示用以與檢測(cè)探針?lè)磻?yīng)的連接生物素檢測(cè)配體的連接子實(shí)例的化學(xué)結(jié)構(gòu)；圖6顯示探針標(biāo)記對(duì)分析靈敏度的影響；及圖7顯示單一步驟雜交分析的結(jié)果；及
圖8顯示砂眼衣原體的單一步驟核酸檢棒分析檢測(cè)。下列實(shí)施例涉及砂眼衣原體(CT)隱性質(zhì)粒的DNA片段的檢測(cè)，CT為最常見(jiàn)的性傳染性疾病的病因，CT傳染病可引起不孕或當(dāng)懷孕時(shí)形成自然流產(chǎn)、死產(chǎn)或產(chǎn)后子宮內(nèi)膜炎。在新生兒方面，CT傳染病可引起視盲及慢性呼吸道疾病。大約10%感染的男性及高于 70%感染的女性并不表現(xiàn)CT感染的癥狀。由此，CT感染的正確診斷非常重要，以便可開(kāi)始疾病的早期治療。在下列實(shí)施例1及3至5中，使用檢棒10在樣品溶液14中檢測(cè)雙鏈CT目標(biāo)核酸 12。檢棒10包含具有接觸端18以接觸樣品溶液14的硝化纖維片16，及固定于硝化纖維片 16的捕獲帶22 (位于遠(yuǎn)離接觸端18的另一端)的捕獲探針20?？股锼乜贵w-染料綴合物M可釋放地固定于硝化纖維片的綴合帶26 (介于接觸端18及捕獲帶22之間)，捕獲探針20能夠雜交目標(biāo)核酸12單鏈(第一鏈)的第一序列。各能雜交雙鏈目標(biāo)核酸12的第一鏈不同區(qū)域的檢測(cè)探針觀及幫手探針30隨后添加至樣品溶液14中。檢測(cè)探針觀包含偶聯(lián)生物素的核酸(使用的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知)。包含檢測(cè)探針觀及幫手探針30的樣品溶液14加熱至足夠?qū)㈦p鏈目標(biāo)核酸 12的互補(bǔ)鏈相互分離，至少分離第一鏈上檢測(cè)探針觀及幫手探針30結(jié)合的區(qū)域，之后冷卻而允許檢測(cè)探針觀及幫手探針30能夠雜交雙鏈目標(biāo)核酸第一鏈，檢測(cè)探針及幫手探針雜交第一鏈避免第二鏈再退火(re-armealing)至第一鏈，至少在第一鏈上檢測(cè)探針觀及幫手探針30結(jié)合的區(qū)域中。檢棒10的接觸端18隨后與樣品溶液14接觸，樣品溶液14及任何被檢測(cè)探針28及幫手探針30雜交的目標(biāo)核酸12通過(guò)毛細(xì)作用上升至檢棒10，當(dāng)樣品溶液14通過(guò)綴合帶 26時(shí)，其帶動(dòng)抗生物素抗體-染料綴合物M，釋放的抗生物素抗體-染料綴合物M隨后能結(jié)合檢測(cè)探針觀的生物素，該檢測(cè)探針觀與目標(biāo)核酸12雜交。在抗生物素抗體-染料綴合劑M、檢測(cè)探針觀、幫手探針30及目標(biāo)核酸12之間形成復(fù)合物隨后移至檢棒10的捕獲帶22，在那里復(fù)合物的目標(biāo)核酸可雜交固定的捕獲探針20。認(rèn)為幫手探針30使目標(biāo)核酸容易雜交檢棒上的捕獲探針20。捕獲探針20固定于捕獲帶22上，其方式使其并不能在樣品溶液14通過(guò)捕獲帶22 時(shí)被帶動(dòng)。由此，結(jié)合捕獲探針的復(fù)合物遺留在捕獲帶，且可被捕獲帶中抗生物素抗體-染料綴合物中所存在的染料檢測(cè)出。如果樣品溶液中沒(méi)有CT目標(biāo)核酸，則檢測(cè)探針觀不能在捕獲帶22上被捕獲，故無(wú)法在捕獲帶上見(jiàn)到染料。如果樣品溶液中有CT目標(biāo)核酸，但沒(méi)有充足的目標(biāo)核酸在捕獲帶被捕獲，則樣品溶液中存在的目標(biāo)核酸將不會(huì)被檢測(cè)到。上述對(duì)目標(biāo)核酸的捕獲稱(chēng)作直接探針捕獲。下列實(shí)施例2中，使用抗體捕獲技術(shù)。 在此技術(shù)中，抗體替代捕獲探針而固定于檢棒的捕獲帶上。捕獲探針偶聯(lián)能被抗體結(jié)合的捕獲配體(如生物素)，且與幫手及檢測(cè)探針一起添加至樣品溶液中。捕獲探針與幫手及檢測(cè)探針同時(shí)雜交目標(biāo)核酸。檢測(cè)探針偶聯(lián)染料粒子。在捕獲、幫手及檢測(cè)探針已經(jīng)雜交目標(biāo)核酸后，檢棒的接觸端與樣品溶液接觸。包含目標(biāo)核酸、捕獲探針、幫手探針及檢測(cè)探針的復(fù)合物隨后于捕獲帶被固定于捕獲帶的抗體捕獲。樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在通過(guò)捕獲帶中出現(xiàn)染料粒子被檢測(cè)出。由此，捕獲探針雜交目標(biāo)不在檢棒上，而在樣品溶液中。已發(fā)現(xiàn)如果目標(biāo)核酸上捕獲探針雜交區(qū)域與檢測(cè)探針雜交區(qū)域之間隔小于沈個(gè)核苷酸，則目標(biāo)核酸檢測(cè)的靈敏度會(huì)降低。由此，優(yōu)選這些區(qū)域之間隔至少為沈個(gè)核苷酸， 且最好為至少200個(gè)核苷酸。
5' GAT AAA ATC CCT TTA CCC ATG AAA 5' CTT GCT GCA AAG ATA AAA TCC CTT 5' TAA AAT GTC CTG ATT AGT GAA ATA AT 5' TCG GTA TTT TTT TAT ATA AAC ATG AAA A 5' TGC AAG ATA TCG AGT ATG CGT TGT TA 5' AAA GGG AAA ACT CTT GCA GA 5' TCT TTT CTA AAG ACA AAA AAG ATC CTC GAT 5' TGC AAC TCT TGG TGG TAG ACT TTG C 5' GCG CAC AGA CGA TCT ATT TTT TGC A :5' CGG GCG ATT TGC CTT AAC CCC ACC A :5' CCA AGC TTA AGA CTT CAG AGG AGC G :5' CAT GCG TTT CCA ATA GGA TTC TTG G :5' CAC AGT CAG AAA TTG GAG TGC TGG C :5' CTT GCT GCT CGA ACT TGT TTA GTA C :5' AGA AGT CTT GGC AGA GGA AAC TTT T實(shí)施例中所使,
SEQIDNo1
SEQIDNo2
SEQIDNo3
SEQIDNo4
SEQIDNo5
SEQIDNo6
SEQIDNo7
SEQIDNo8
SEQIDNo9
SEQIDNo10
SEQIDNo11
SEQIDNo12
SEQIDNo13
SEQIDNo14
SEQIDNo15
SEQIDNo165'CTAGAATTAGATTATGATTTAAAAGGG
SEQIDNo175'TTCATATCCAAGGACAATAGACCAA
SEQIDNo185'TGATCTACAAGTATGTTTGTTGAGT
SEQIDNo195'TGCATAATAACTTCGAATAAGGAGAAG
SEQIDNo205'TCCCTCGTGΑΤΑTAACCTATCCG
SEQIDNo215'CAGGTTGTTAACAGGATAGCACGC
SEQIDNo225'CTCGTTCCGAAATAGAAAATCGCA
SEQIDNo235'GGTAAAGCTCTGATATTTGAAGAC
SEQIDNo245'CTGAGGCAGCTTGCTAATTATGAGT生物素不能直接與檢測(cè)或捕獲探針?lè)磻?yīng)。在下列實(shí)施例中要使生物素共價(jià)地偶聯(lián)檢測(cè)或捕獲探針，連結(jié)含反應(yīng)基團(tuán)的連接子的生物素與檢測(cè)或捕獲探針的核苷酸，或與連結(jié)檢測(cè)或捕獲探針的間隔臂的核苷酸一起反應(yīng)。使用PerS^tive Biosystem Expedite 8909合成器將連接子的反應(yīng)基團(tuán)與核苷酸或間隔臂反應(yīng)。連接子可為直線型或分支結(jié)構(gòu)的核苷酸或優(yōu)選非核苷酸形式(圖5A及B)。更優(yōu)選連接子包含聚乙二醇(圖5C)。實(shí)施例1實(shí)驗(yàn)構(gòu)成實(shí)驗(yàn)構(gòu)成概要地顯示于圖2。捕獲形式使用由BSA固定于檢棒上的探針kq ID No 22的直接探針捕獲；檢測(cè)形式包含探針kq ID No 20、21、23或M的一或多種檢測(cè)探針，以IO12拷貝，每一探針偶聯(lián)生物素，且被抗生物素抗體-染料綴合物檢測(cè)；幫手探針SEQID No 4 及 SEQ ID No 5，以 IO12 拷貝；目標(biāo):872bp雙鏈DNA,以101°拷貝。結(jié)果
權(quán)利要求
1.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的試劑盒，其包含 i)檢棒，其包括層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑； 固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分； )多種捕獲探針，各捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，且當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，各捕獲探針能夠被捕獲部分結(jié)合；及可選地iii)檢測(cè)探針，能夠雜交目標(biāo)核酸，并由此允許使用檢測(cè)探針檢測(cè)目標(biāo)核酸，該檢測(cè)探針可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶，或者，該檢測(cè)探針與檢棒相分離。
2.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的檢棒，其包括 層析片，其具有接觸端以接觸樣品溶液；固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；及多種捕獲探針，可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶上，每種捕獲針能夠雜交目標(biāo)核酸不同區(qū)域，且當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，各捕獲探針能夠被捕獲部分結(jié)合。
3.根據(jù)權(quán)利要求第1項(xiàng)的試劑盒或根據(jù)權(quán)利要求第2項(xiàng)的檢棒，其中各捕獲探針包含能被捕獲部分結(jié)合的捕獲配體，以結(jié)合捕獲探針至捕獲部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求第3項(xiàng)的試劑盒或檢棒，其中各捕獲探針包含多種各自能被捕獲部分結(jié)合的捕獲配體。
5.根據(jù)權(quán)利要求第1至4項(xiàng)中任一項(xiàng)的試劑盒或檢棒，其中檢測(cè)探針包含標(biāo)記，允許利用檢測(cè)探針直接檢測(cè)目標(biāo)核酸，或其中檢測(cè)探針包含檢測(cè)配體，允許利用檢測(cè)探針間接檢測(cè)目標(biāo)核酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求第5項(xiàng)的試劑盒或檢棒，其中檢測(cè)探針包含多種標(biāo)記或多種檢測(cè)配體。
7.根據(jù)權(quán)利要求第1至4項(xiàng)中任一項(xiàng)的試劑盒或檢棒，其中檢測(cè)探針為多種檢測(cè)探針， 各檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，由此允許利用檢測(cè)探針檢測(cè)目標(biāo)核酸。
8.根據(jù)權(quán)利要求第7項(xiàng)的試劑盒或檢棒，其中各檢測(cè)探針包含多種標(biāo)記或多種檢測(cè)配體。
9.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的試劑盒，其包含 i)檢棒，其包括層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑；及固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分； )捕獲探針，其能夠雜交目標(biāo)核酸，其中捕獲探針包含多種捕獲配體，當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，各捕獲配體能夠被捕獲部分結(jié)合；及可選地iii)檢測(cè)探針，其能夠雜交目標(biāo)核酸，并由此允許利用檢測(cè)探針檢測(cè)目標(biāo)核酸，該檢測(cè)探針可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶，或者該檢測(cè)探針與檢棒相分1 O
10.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的檢棒，其包含 層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑；固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；及捕獲探針，其可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸，其中捕獲探針包含多種配體，當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，各捕獲配體能夠被捕獲部分結(jié)合。
11.根據(jù)權(quán)利要求第9項(xiàng)的試劑盒或根據(jù)權(quán)利要求第10項(xiàng)的檢棒，其中檢測(cè)探針包含標(biāo)記，允許利用檢測(cè)探針直接檢測(cè)目標(biāo)核酸，或其中檢測(cè)探針包含檢測(cè)配體，允許利用檢測(cè)探針間接檢測(cè)目標(biāo)核酸。
12.根據(jù)權(quán)利要求第11項(xiàng)的試劑盒或檢棒，其中檢測(cè)探針包含多種標(biāo)記或檢測(cè)配體。
13.根據(jù)權(quán)利要求第9項(xiàng)的試劑盒或根據(jù)權(quán)利要求第10項(xiàng)的檢棒，其中檢測(cè)探針為多種檢測(cè)探針，各檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，并由此允許利用檢測(cè)探針檢測(cè)目標(biāo)核酸。
14.根據(jù)權(quán)利要求第13項(xiàng)的試劑盒或檢棒，其中各檢測(cè)探針包含多種標(biāo)記或檢測(cè)配體。
15.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的試劑盒，其包含 i)檢棒，其包括層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑；及固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分，該捕獲部分能夠直接或間接結(jié)合目標(biāo)核酸，及ii)多種捕獲探針，各捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，由此允許利用檢測(cè)探針檢測(cè)目標(biāo)核酸。
16.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的檢棒，其包含 層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑；固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分，該捕獲部分能夠直接或間接結(jié)合目標(biāo)核酸;及可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶的多種檢測(cè)探針，各檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，由此允許利用檢測(cè)探針檢測(cè)目標(biāo)核酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求第15項(xiàng)的試劑盒或根據(jù)權(quán)利要求第16項(xiàng)的檢棒，其中各檢測(cè)探針包含標(biāo)記，允許利用檢測(cè)探針直接檢測(cè)目標(biāo)核酸，或其中各檢測(cè)探針包含檢測(cè)配體，允許利用檢測(cè)探針間接檢測(cè)目標(biāo)核酸。
18.根據(jù)權(quán)利要求第17項(xiàng)的試劑盒或檢棒，其中各檢測(cè)探針包含多種標(biāo)記或多種檢測(cè)配體。
19.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的試劑盒，其包含 i)檢棒，其包括層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑；及固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分，該捕獲部分能夠直接或間接結(jié)合目標(biāo)核酸，及ii)能夠雜交目標(biāo)核酸的檢測(cè)探針，其中檢測(cè)探針包含多種標(biāo)記，允許利用檢測(cè)探針直接檢測(cè)目標(biāo)核酸，或其中檢測(cè)探針包含多種檢測(cè)配體，允許利用檢測(cè)探針間接檢測(cè)目標(biāo)核酸。
20.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的檢棒，其包含層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑；固定于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分，該捕獲部分能夠直接或間接結(jié)合目標(biāo)核酸；及可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的探針帶的檢測(cè)探針，該檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸，其中檢測(cè)探針包含多種標(biāo)記，允許利用檢測(cè)探針直接檢測(cè)目標(biāo)核酸，或其中檢測(cè)探針包含多種檢測(cè)配體，允許利用檢測(cè)探針間接檢測(cè)目標(biāo)核酸。
21.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的試劑盒或檢棒，其中捕獲部分包含捕獲探針，其能夠雜交目標(biāo)核酸，或雜交結(jié)合目標(biāo)核酸的吊鉤捕獲探針。
22.根據(jù)權(quán)利要求第15至20項(xiàng)中任一項(xiàng)的試劑盒或檢棒，其中捕獲部分包含捕獲配體結(jié)合部分，其能夠結(jié)合捕獲探針的捕獲配體，該捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸，而使捕獲部分由此能間接結(jié)合目標(biāo)核酸。
23.根據(jù)權(quán)利要求第22項(xiàng)的試劑盒或檢棒，其進(jìn)一步包含捕獲探針。
24.根據(jù)權(quán)利要求第5、6、8、11、12、14或17至20項(xiàng)中任一項(xiàng)的試劑盒或檢棒，其中各標(biāo)記為非放射性。
25.根據(jù)權(quán)利要求第3、4、9、10或22項(xiàng)中任一項(xiàng)的試劑盒或檢棒，其中捕獲部分包含抗體或抗體片段，其能夠結(jié)合各捕獲配體。
26.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的檢棒的用途，為測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在。
27.根據(jù)權(quán)利要求第沈項(xiàng)的用途，其中目標(biāo)核酸為砂眼衣原體核酸。
28.檢測(cè)或捕獲目標(biāo)核酸的探針，其包含能夠雜交目標(biāo)核酸的核酸或核酸類(lèi)似物，其中核酸或核酸類(lèi)似物偶聯(lián)多種標(biāo)記，當(dāng)探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，允許直接檢測(cè)目標(biāo)核酸，或者其中核酸偶聯(lián)多種配體，當(dāng)探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，其能被配體結(jié)合部分結(jié)合而檢測(cè)或捕獲目標(biāo)核酸。
29.根據(jù)權(quán)利要求第觀項(xiàng)的探針，其中對(duì)于多種標(biāo)記或配體中的每一個(gè)標(biāo)記或配體， 連接子(如在此定義)共價(jià)地偶聯(lián)該標(biāo)記或配體至核酸或核酸類(lèi)似物。
30.根據(jù)權(quán)利要求第觀項(xiàng)的探針，其中多種標(biāo)記或配體被分支連接子(如在此定義) 共價(jià)地偶聯(lián)于核酸或核酸類(lèi)似物。
31.根據(jù)權(quán)利要求第四或30項(xiàng)的探針，其中該或各連接子包含非核苷酸，優(yōu)選聚乙二
32.根據(jù)權(quán)利要求第四至31項(xiàng)中任一項(xiàng)的探針，其中該或各連接子由間隔臂共價(jià)地偶聯(lián)于核酸或核酸類(lèi)似物。
33.根據(jù)權(quán)利要求第32項(xiàng)的探針，其中間隔臂包含核苷酸或六乙二醇磷酸。
34.根據(jù)權(quán)利要求第觀至33項(xiàng)中任一項(xiàng)的探針，其中標(biāo)記為非放射性。
35.根據(jù)權(quán)利要求第觀至34項(xiàng)中任一項(xiàng)的探針在檢棒分析中的用途，測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在。
36.多種不同捕獲探針在檢棒分析中的用途，以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，各捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，由此允許固定于檢棒上且能夠結(jié)合捕獲探針的捕獲部分將目標(biāo)核酸捕獲至檢棒上。
37.多種不同檢測(cè)探針在檢棒分析中的用途，以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在，各檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，由此允許使用檢測(cè)探針檢測(cè)目標(biāo)核酸。
38.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含 提供權(quán)利要求第15項(xiàng)所詳述的檢棒；將樣品溶液與多種檢測(cè)探針接觸，各檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，由此允許使用檢測(cè)探針直接或間接地檢測(cè)目標(biāo)核酸，在檢測(cè)探針雜交目標(biāo)核酸的條件下，將檢測(cè)探針與樣品溶液孵育；將檢棒的接觸端與樣品溶液接觸，使得樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此允許目標(biāo)核酸與檢測(cè)探針與樣品溶液一起移至捕獲帶，且目標(biāo)核酸于捕獲帶被捕獲；及檢測(cè)捕獲帶上的檢測(cè)探針。
39.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含 提供權(quán)利要求第16至20項(xiàng)所詳述的檢棒；將檢棒的接觸端與樣品溶液接觸，使得樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此允許樣品溶液中的目標(biāo)核酸于捕獲帶被捕獲，且釋放各檢測(cè)探針至樣品溶液，以使各檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸；及檢測(cè)捕獲帶上的各檢測(cè)探針。
40.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含 提供權(quán)利要求第19項(xiàng)所詳述的檢棒；將樣品溶液與能夠雜交目標(biāo)核酸的檢測(cè)探針接觸，其中檢測(cè)探針包含多種標(biāo)記，允許利用檢測(cè)探針直接檢測(cè)目標(biāo)核酸，或其中檢測(cè)探針包含多種檢測(cè)配體，允許利用檢測(cè)探針間接檢測(cè)目標(biāo)核酸，在檢測(cè)探針雜交目標(biāo)核酸的條件下，將檢測(cè)探針與樣品溶液孵育；將檢棒的接觸端與樣品溶液接觸，使得樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此允許目標(biāo)核酸與檢測(cè)探針與樣品溶液一起移至捕獲帶，且目標(biāo)核酸于捕獲帶被捕獲；及檢測(cè)捕獲帶上的檢測(cè)探針。
41.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含a)提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑，及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分，該捕獲部分能夠直接或間接結(jié)合目標(biāo)核酸；b)將層析片的接觸端與樣品溶液接觸，使得樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至捕獲帶，而使樣品溶液中的目標(biāo)核酸于捕獲帶被捕獲部分捕獲；c)兩者之一(i)將捕獲帶與多種檢測(cè)探針接觸，各檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，并由此允許使用檢測(cè)探針檢測(cè)目標(biāo)核酸；或(ii)將捕獲帶與能夠雜交目標(biāo)核酸的檢測(cè)探針接觸，并由此允許使用檢測(cè)探針檢測(cè)目標(biāo)核酸，其中檢測(cè)探針包含多種標(biāo)記，允許利用檢測(cè)探針直接檢測(cè)目標(biāo)核酸，或其中檢測(cè)探針包含多種檢測(cè)配體，允許利用檢測(cè)探針間接檢測(cè)目標(biāo)核酸；d)從層析片的捕獲帶上去除未結(jié)合的檢測(cè)探針；及e)檢測(cè)捕獲帶上各檢測(cè)探針的存在。
42.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含提供層析片，其具有接觸端的以接觸樣品試劑，及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；樣品溶液與多種檢測(cè)探針接觸，各檢測(cè)探針能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，且當(dāng)捕獲探針已雜交于目標(biāo)核酸，各檢測(cè)探針能夠被捕獲部分結(jié)合；將樣品溶液與層析片的接觸端接觸，使得樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此允許包含目標(biāo)核酸及捕獲探針的復(fù)合物通過(guò)捕獲部分結(jié)合捕獲探針而于捕獲帶被捕獲；及檢測(cè)捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
43.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑，及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；將樣品溶液與能夠雜交目標(biāo)核酸的捕獲探針接觸，其中捕獲探針包含多種捕獲配體， 當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，各捕獲配體能夠被捕獲部分結(jié)合；將樣品溶液與層析片的接觸端接觸，使得樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此允許包含目標(biāo)核酸及捕獲探針的復(fù)合物通過(guò)捕獲部分結(jié)合捕獲探針而于捕獲帶被捕獲；及檢測(cè)捕獲帶上檢測(cè)探針的存在。
44.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑；及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的的捕獲帶的捕獲部分；及可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間的多種捕獲探針，每種捕獲探針能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，且當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，各捕獲探針能夠被捕獲部分結(jié)合；將樣品溶液與層析片的接觸端接觸，使得樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此從層析片上釋放捕獲探針，而使當(dāng)樣品溶液向捕獲帶移動(dòng)時(shí)，其可雜交樣品溶液中的目標(biāo)核酸，并允許包含目標(biāo)核酸及捕獲探針的復(fù)合物通過(guò)捕獲部分與捕獲探針的結(jié)合而在捕獲帶被捕獲；及檢測(cè)捕獲帶上目標(biāo)核酸的存在。
45.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含提供層析片，其具有接觸端以接觸樣品試劑；及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；及捕獲探針，能夠雜交目標(biāo)核酸，該捕獲探針可釋放地固定于層析片接觸端與捕獲帶之間，其中捕獲探針包含多種捕獲配體，當(dāng)捕獲探針已雜交了目標(biāo)核酸時(shí)，各捕獲配體能夠被捕獲部分結(jié)合；將樣品溶液與層析片的接觸端接觸，使得樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此從層析片上釋放捕獲探針，而使當(dāng)樣品溶液向捕獲帶移動(dòng)時(shí)，其可雜交樣品溶液中的目標(biāo)核酸，并允許包含目標(biāo)核酸及捕獲探針的復(fù)合物通過(guò)捕獲部分與捕獲探針結(jié)合而在捕獲帶被捕獲；及檢測(cè)捕獲帶上目標(biāo)核酸的存在。
46.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含提供檢棒，其包含具有接觸端的層析片以接觸樣品試劑，及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的的捕獲帶的捕獲部分；提供多種捕獲探針，每種捕獲探針能夠結(jié)合捕獲部分，且能雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域；將多種捕獲探針結(jié)合在捕獲部分；將樣品溶液與層析片的接觸端接觸，使得樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此允許樣品溶液中的目標(biāo)核酸通過(guò)目標(biāo)核酸與多種捕獲探針的結(jié)合而在捕獲帶被捕獲；且檢測(cè)捕獲帶上目標(biāo)核酸的存在。
47.測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸存在的方法，其包含提供檢棒，其包含的層析片具有接觸端以接觸樣品試劑，及固定于層析片上遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分；提供多種捕獲探針，每種捕獲探針能夠結(jié)合捕獲部分，且能雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域；將多種捕獲探針結(jié)合至捕獲部分；將樣品溶液與層析片的接觸端接觸，使得樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至捕獲帶，由此允許樣品溶液中的目標(biāo)核通過(guò)目標(biāo)核酸與多種捕獲探針的結(jié)合而在捕獲帶被捕獲；及檢測(cè)捕獲帶上目標(biāo)核酸的存在。
全文摘要
本發(fā)明敘述改良的檢棒分析以測(cè)試樣品溶液中目標(biāo)核酸的存在。且提供檢棒，其包含接觸端以接觸樣品試劑，及位于遠(yuǎn)離接觸端的捕獲帶的捕獲部分以捕獲目標(biāo)核酸。將樣品溶液與接觸端接觸，使得樣品溶液通過(guò)毛細(xì)作用移至捕獲帶，且以多種不同的標(biāo)記的檢測(cè)探針檢測(cè)，這些探針各能夠雜交目標(biāo)核酸的不同區(qū)域，檢測(cè)信號(hào)由此增強(qiáng)。在其它方法中，將多種不同的捕獲探針添加入樣品溶液中，然后于捕獲帶被捕獲部分結(jié)合而間接捕獲目標(biāo)核酸。目標(biāo)核酸的捕獲由此而增強(qiáng)。亦述及實(shí)施這種方法的試劑盒及檢棒。
文檔編號(hào)G01N33/53GK102174651SQ20111003570
公開(kāi)日2011年9月7日 申請(qǐng)日期2001年7月6日 優(yōu)先權(quán)日2000年7月7日
發(fā)明者海倫·李, 瑪格塔·阿納斯達(dá)索瓦·狄尼瓦 申請(qǐng)人:真實(shí)世界診療有限公司