專利名稱：核仁磷酸蛋白可變剪接體的質(zhì)譜鑒定方法和胃癌診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物樣品的檢測領(lǐng)域，特別涉及突變蛋白的質(zhì)譜學鑒定方法。
背景技術(shù)：
核仁磷酸蛋白(nucleophosmin，NPM、B23、N038或NPM1)是位于核仁顆粒區(qū)的主要蛋白分子之一，人類B23基因位于染色體5q35，基因全長約23kb(Chan，P. K.，1986，Zhang, Χ. X, 1989 ；Cochrane，Α. W，1990)，包含有12個外顯子，編碼由294個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。 在正常情況下核仁磷酸蛋白主要位于核仁顆粒區(qū)，但是可以穿梭于核仁、核質(zhì)和胞質(zhì)而發(fā)揮重要作用(Charles G，2008)。核仁磷酸蛋白的12個外顯子(Exonl-12)序列分別如下
外顯子序列Exon 1ATGGAAGATT CGATGGACAT GGACATGAGC CCCCTGAGGC CCCAGAACTA TCTTTTCGExon 2GTTGTGAACT AAAGGCCGAC AAAGATTATC ACTTTAAGGT GGATAATGAT GAAAATGAGC ACCAGTTATC TTTAAGAACGExon 3GTCAGTTTAG GGGCTGGTGC AAAGGATGAG TTGCACATTG TTGAAGCAGA GGCAATGAAT TACGAAGGCA GTCCAATTAA AGTAACACTG GCAACTTTGA AAATGTCTGT ACAGCCAACGExon 4GTTTCCCTTG GGGGCTTTGA AATAACACCA CCAGTGGTCT TAAGGTTGAA GTGTGGTTCA GGGCCAGTGC ATATTAGTGG ACAGCACTTA GTAGExon 5CTGTGGAGGA AGATGCAGAG TCAGAAGATG AAGAGGAGGA GGATGTGAAA CTCTTAAGTA TATCTGGAAA GCGGTCTGCC CCTGGAGGTG GTAGCAAGGT TCCACAGExon 6AAAAAAGTAA AACTTGCTGC TGATGAAGAT GATGACGATG ATGATGAAGA GGATGATGAT GAAGAExon 7TGATGATGAT GATGATTTTG ATGATGAGGA AGCTGAAGAA AAAGCGCCAG TGAAGAAAExon 8TCTATACGAG ATACTCCAGC CAAAAATGCA CAAAAGTCAA ATCAGAATGG AAAAGACTCA AAACCATCAT CAACACCAAG ATCAAAAExon 9GGACAAGAAT CCTTCAAGAA ACAGGAAAAA ACTCCTAAAA CACCAAAAGG ACCTAGTTCT GTAGAAGACA TTAAAGCAAA AATGCAAGCA AGTATAGAAA AAExon 10GCGCATTGAExon 11GGTGGTTCTC TTCCCAAAGT GGAAGCCAAA TTCATCAATT ATGTGAAGAA
TTGCTTCCGG ATGACTGACC AAGAGExon 12GCTATTCAAG ATCTCTGGCA GTGGAGGAAG TCTCTTTAA 目前公認的B23基因有兩個轉(zhuǎn)錄剪接體。B23蛋白最早于1989年由Chen W-Y等報道，該基因及蛋白序列也就是被認為野生型，實際上是跳過10號外顯子編碼294氨基酸殘基的版本；Dalenc F于2002年報道了另一個剪接體，即保留10號外顯子但在10號外顯子末終止，也就是把11、12號外顯子切除，這個剪接體共編碼259個氨基酸殘基；這兩個版本表明，B23基因mRNA成熟過程中在10號外顯子處存在一個選擇機制，即要么把10號外顯子剪切掉，要么在10號外顯子末終止。B 23基因在所有類型的組織細胞中廣泛表達，但在增殖活躍的細胞包括腫瘤細胞和干細胞中高表達。但在血液細胞惡性增殖的疾病中，B23表達并不高，而是發(fā)生了大量的基因突變和重排。在白血病中，B23基因展現(xiàn)了兩種突變，即參與基因重排和B23基因自身突變。前者最常見為B23與其它基因(RARa、MLFl、ALK)形成致癌性的融合蛋白，促進急性早幼粒細胞白血病(M3)、骨髓增生異常綜合征(MDS)和淋巴瘤的發(fā)生。后者即B23自身基因突變則
要復雜一些。在實體瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，B23基因通常表現(xiàn)為過表達，產(chǎn)生大量的B23蛋白。Yim J-P等檢測了 103例肝細胞癌(h印atocellular careinoma, HCC)，12例肝局灶性結(jié)節(jié)狀增生(hepatic focal nodular hyperplasia), 17 例月干血管瘤(hepatic haemangioma)旁肝臟組織和正常人器官等，發(fā)現(xiàn)HCC中B23的表達要比非惡性肝細胞多得多(Increased expression of nucleophosmin/B23inhepatocellular carcinoma and correlation with clinicopathological parameters. Br JCancer. 2007Feb 12 ；96 (3) :477_84) ·。但是，在實體瘤研究中，還沒有任何關(guān)于B23基因突變以及可變剪接體的研究和報道。本發(fā)明人首次發(fā)現(xiàn)了實體瘤(具體為胃癌)樣本中B23基因轉(zhuǎn)錄本出現(xiàn)突變，進一步研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌樣本中存在一種典型的跳過8號外顯子的剪接體B23-T和大量散在突變，同時通過細胞實驗證明上述可變剪接體B23-T與野生型B23蛋白的功能不同，可導致細胞多核，因此該可變剪接體B23-T可以作為臨床診斷的指標使用。在對突變的檢測中，通常會用到核酸水平的檢測。但是，一方面，混雜在大量正常樣本中的少量異常樣本的檢測并不容易，另一方面，核酸水平的檢測并不能代替蛋白水平的直接檢測。檢測與野生型蛋白不一樣的剪接體蛋白，通常的方法是開發(fā)一個能特異識別突變位點的抗體，通過特異的抗原-抗體反應(yīng)來達到區(qū)分野生型蛋白/突變蛋白的目的。但是， 得到這樣一種具備區(qū)分度的抗體，不僅費時費力，而且還不一定能夠篩選得到。具體來說， 特異性抗體的一般篩選方法是通過設(shè)計突變位點附近的多肽序列并通過該多肽免疫獲得多抗血清或者篩選相應(yīng)的單抗；或者直接用整個突變蛋白免疫小鼠，通過雜交瘤技術(shù)得到多株單克隆抗體。這些抗體都需要再通過與兩種蛋白(野生型和突變型)進行抗原-抗體反應(yīng)如ELISA，來鑒別這些抗體中哪些可以在與兩種蛋白反應(yīng)時有差別，其差別是否達到能明顯區(qū)分的程度，而且不會產(chǎn)生假陽性的信號。理想的抗體是對突變型蛋白有陽性反應(yīng)，但是對于野生型蛋白完全沒有反應(yīng)的抗體。從理論推理來說，做到這一點是困難的；而從實踐來說，對初步試驗合格的抗體，即對野生型蛋白和突變型蛋白具有一定區(qū)分度的抗體，由于初步篩選時一般使用純的野生型或突變型蛋白進行試驗，因此需要對初步合格抗體進行其他蛋白的干擾試驗，這也增加了最終獲得合格抗體的難度。鑒于在胃癌樣本中的典型的跳過8號外顯子的剪接體B23-T為缺失突變，本發(fā)明人設(shè)計了兩條針對剪接接頭位點的多肽，希望通過免疫多肽而獲得特異性不同的抗體，即其中一種抗體只和突變蛋白反應(yīng)而不與野生型蛋白反應(yīng)。實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，通過該法得到的抗體沒有區(qū)分度，兩種抗體都能與兩種蛋白反應(yīng)。因此，達到區(qū)分突變和野生型蛋白的目的只能通過篩選單克隆抗體的途徑才有可能實現(xiàn)。但單克隆抗體篩選的周期很長，花費很大， 而且也不能保證一定能得到符合要求的具有高度區(qū)分度的理想的抗體。此 外，突變蛋白的多肽新序列也是由野生型蛋白的原有序列組合成的，只是正常情況下該多肽的前后兩部分本不結(jié)合在一起罷了。而抗體的產(chǎn)生往往可能只針對兩到數(shù)個氨基酸殘基，因此該多肽的前后兩個部分單獨已經(jīng)足以能產(chǎn)生抗體，而這些抗體也能與野生型蛋白反應(yīng)。如果把前后部分切短，那么可能無法形成有效識別從而無法產(chǎn)生針對該多肽的抗體。因此，從方法學上來說，針對缺失位點篩選抗體以區(qū)分野生型蛋白和缺失突變蛋白是更加困難的。對于質(zhì)譜學鑒定方法而言，目前能采用的質(zhì)譜方法也有數(shù)種。較常用的為 Maldi-TOF和Q-T0F。雖然Maldi-TOF應(yīng)用廣泛，但在具體實施中，由于受到其原理的限制， 對所激發(fā)的片段有很大的選擇性，很多片段不會出現(xiàn)在質(zhì)譜結(jié)果中，同時這個特性還造成了試驗的隨機性高而重復性差，所以在某些情況下，即使采取了正確的酶切方法，也不能通過Maldi-TOF得到想要的結(jié)果。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于找到一個能穩(wěn)定地表征B23新剪接體B23-T的特征片段，并能通過實驗直接檢測；該檢測方法具有高度準確性和重復性；該片斷還能被開發(fā)運用到其他可能更為簡便的檢測方法中。為解決上述問題，本發(fā)明人提出一種新思路，即利用完全酶切法與質(zhì)譜法的結(jié)合高度可靠地鑒定突變蛋白，特別是缺失突變的蛋白。本發(fā)明人通過深入刻苦的研究完成了本發(fā)明。因此，一方面，本發(fā)明提供一種核仁磷酸蛋白可變剪接體B23-T的質(zhì)譜學鑒定方法，該方法是Glu-C酶切方法與Q-TOF質(zhì)譜方法的結(jié)合。所述Glu-C酶切方法包括用Glu-C 酶對核仁磷酸蛋白可變剪接體進行完全切割的步驟；所述Q-TOF質(zhì)譜方法包括用ESI電離源的Q-TOF方法檢測目的肽的步驟；所述Q-TOF質(zhì)譜方法還包括直接對所述目的肽測序驗證目的肽的步驟。通過上述鑒定方法確定的目的肽從N端到C端的氨基酸序列為 KAPVKKGQE。另一方面，本發(fā)明提供一種Glu-C酶在制備用于胃癌診斷的試劑盒中的新用途以及由此獲得的用于胃癌診斷的試劑盒，該試劑盒含有Glu-C酶，還含有與所述Glu-C酶分開包裝的肽和/或酶切處理用試劑，所述肽從N端到C端的氨基酸序列為KAPVKKGQE。本發(fā)明的試劑盒可用于質(zhì)譜學方法鑒定以及其他鑒定方法，例如電泳和色譜鑒定方法等。本發(fā)明還提供一種肽，該肽含有從N端到C端的氨基酸序列為KAPVKKGQE的肽段， 特別是本發(fā)明提供從N端到C端的氨基酸序列為KAPVKKGQE的肽；以及該肽在制備用于胃癌診斷的試劑盒中的用途。通過本發(fā)明，可以快速、可靠地確定突變蛋白B23-T在實體腫瘤特別是胃癌中的存在，從而可以應(yīng)用于臨床診斷中。質(zhì)譜法重復性很好，這是由質(zhì)譜儀器的精密性決定的；其次，采用的Q-T0F2質(zhì)譜法能直接對目的片段測定氨基酸殘基序列，因此能得到終極鑒定結(jié)果。這個結(jié)果不需要其他試驗結(jié)果來佐證，其自身就是最可靠的鑒定結(jié)果。


圖1表示野生型B23與本發(fā)明人在胃癌中發(fā)現(xiàn)的B23-T的核酸序列的比較。圖2表示蛋白進行SDS-PAGE電泳結(jié)果和切膠圖。Trizol試劑盒提取胃癌樣本總蛋白，并用B23抗體做免疫沉淀。圖中樣品從左到右依次為泳道1為低分子量蛋白Marker， 購自上海生化所；泳道2、3為免疫沉淀樣品電泳結(jié)果，泳道2中為正常胃全層樣本，泳道3 中為腫瘤胃全層樣本。分子量大小見圖中標示。圖3表示含B23野生型蛋白樣本在ESI源下Glu-C酶切的一級質(zhì)譜，是從圖2所示正常胃全層樣本來源膠條上切取25 40kDa區(qū)域，并作Glu-C酶切-質(zhì)譜分析獲得。圖4表示含B23-T突變蛋白樣本在ESI源下Glu-C酶切的一級質(zhì)譜，是從圖2所示腫瘤胃全層樣本來源膠條上切取25 40kDa區(qū)域，并作Glu-C酶切-質(zhì)譜分析獲得。圖5表示對目的肽測序的二級質(zhì)譜，是以圖4中特征峰492. 81為母離子，進行MS/ MS測序分析獲得。
具體實施例方式在本發(fā)明中，利用質(zhì)譜法的高度可靠性來鑒定突變蛋白時，關(guān)鍵的問題是1、使用何種蛋白酶對目的蛋白進行酶切分解？因為不同酶的酶切位點不同，切割的效率也不同，因此對酶的選擇將影響到實驗的可靠性以及最后的成功。2、采用何種具體的質(zhì)譜法檢測酶切得到的特征肽段？目前，最常用的方案為胰蛋白酶(Trypsin)酶切后用Maldi-Tof檢測。因此，在本發(fā)明人的研究中也實施了該方法，但得到的片段是具有6個漏切點的片段，因此其可靠性不高。具體細節(jié)如下針對突變蛋白B23-T，Trypsin酶切后可能產(chǎn)生的特征肽段如下表突變后的可能產(chǎn)生的差異片段([M+H]+)
可能的特征肽段理論分子量Trypsin漏切點數(shù)A PVKK542.3661A PVKKGQESFK1218.6842A PVKKGQESFKK1346. 7793A PVKKGQESFKKQEK1731. 9754A PVKKGQESFKKQEKTPK2058.1715A PVKKGQESFKKQEKTPKTPK2384.3846 注所謂漏切點，即酶可能會隨機或者因為位置原因等不能把所有理論位點全部
6切割，因此會漏過部分切割位點，從而產(chǎn)生比理論預(yù)測大的肽段。從表中可看出，其完全酶切后應(yīng)該產(chǎn)生分子量為542. 366的肽段。但實際結(jié)果只檢測到漏切點6的片斷，即理論分子量2384. 384的肽段。由于漏切點數(shù)太多，因此該方法隨機性強，作為檢測手段容易產(chǎn)生假陰性結(jié)果。此外，用Maldi-TOF法對肽段的激發(fā)方法造成質(zhì)譜結(jié)果中出現(xiàn)的肽段較少，而且重復性不高。Maldi-TOF的結(jié)果只能用分子量來進行匹配分析。也就是說，質(zhì)譜結(jié)果中有接近理論分析 子量的肽段，可認為有某個蛋白；但是通常需要3至5條以上匹配分子量的肽段，才能認為某個蛋白存在。對于B23-T而言，能與野生型蛋白B23區(qū)分開的部分只有突變剪接處的一個位點，因此，能表征的特征肽段就只有這一個。由于在檢測中所用樣本中含有大量雜蛋白，其產(chǎn)生的大量無關(guān)肽段將干擾試驗的結(jié)果，特別是可能產(chǎn)生與目的分子量類似的片段，所以通過Maldi-TOF法從原理上而言可能得不到完全確認的結(jié)果。本發(fā)明的可變剪接體突變中，比較典型的是缺失583_669bp部分的B23-T剪接體。 使用DNAMAN軟件與NCBI的報道的正常型B23序列進行比對，可以看出，該克隆序列比報道的正常型B23序列缺失了中間一段87bp的序列，見圖1。對比B23基因信息發(fā)現(xiàn)，上述缺失的583_669bp部分實際為B23基因的8號外顯子。因此該缺失突變體應(yīng)該是跳過8號外顯子直接將7、9號外顯子連接起來的產(chǎn)物。這與現(xiàn)有技術(shù)中已經(jīng)確認的B23剪接體不同野生型B23轉(zhuǎn)錄本是跳過10號外顯子，因此編碼區(qū)總長882bp，編碼294氨基酸殘基；其可變剪接體不跳過10號外顯子，但在10號外顯子末終止，因此剪切掉了 11、12號外顯子，編碼區(qū)全長777bp，編碼259氨基酸殘基。上述缺失 583-669bp的突變體實際為同時跳過8，10號外顯子，編碼區(qū)全長795bp，編碼265氨基酸殘基，比野生型少了 29個氨基酸殘基。因此，本發(fā)明所涉及的鑒定對象為一個可變剪接體，是一個與正常蛋白非常相似的蛋白，該蛋白比正常蛋白少了 29個氨基酸殘基。該缺失的一段序列并不在蛋白序列的兩端，而在靠近C-末端的中間，這給蛋白水平的檢測帶來困難，并且，該蛋白通常混雜于樣本的野生型蛋白中，因此檢測技術(shù)需要避開野生型蛋白對檢測的干擾。本發(fā)明的目的是通過酶切得到一個能表征B23可變剪接體的特征肽段作為鑒定其存在的標準，因此，本發(fā)明的關(guān)鍵在于選用Glu-C酶切，并通過Q-TOF方法直接對目的肽段進行檢測和測序驗證；Glu-C酶切方法漏切數(shù)為零，所以非常可靠。本發(fā)明方法的基本流程為臨床病理樣本_分離提取細胞核蛋白-實施免疫沉淀-切膠酶切-質(zhì)譜鑒定。下面將具體說明。取組織蛋白(提取RNA時的蛋白層)，加入適量緩沖液，加入Iyg抗體和10-50 μ 1 protein A/G-beads后進行免疫沉淀，取所得蛋白進行SDS-PAGE，電泳結(jié)果如圖2。將如圖2所示切膠后得到的樣本進行Glu-C酶切分解，并進行ESI電離源的Q-Tof 分析發(fā)現(xiàn)含B23-T蛋白的樣本的一級質(zhì)譜(MS)圖譜(圖4)展現(xiàn)出目的特征峰“492. 81”(m/ ζ = 492. 81)，這與理論預(yù)測492. 29非常接近。作為對比，圖3所示的野生型蛋白的一級質(zhì)譜圖譜中沒有相應(yīng)的肽段。在含B23-T蛋白的圖譜(圖4)中發(fā)現(xiàn)含有492. 81肽段，與理論預(yù)測(492. 29)非常接近，疑似為B23-T蛋白在Glu-C酶完全切割(即漏切點為0)情況下產(chǎn)生的特征片段。 正如上述，這仍然不能最后確證該片段就是目的片段，所以Glu-C酶切與Q-TOF質(zhì)譜方法的結(jié)合(Glu-C+Q-TOF方案)可行性還需要對該片斷進行二級質(zhì)譜(MS/MS)測序結(jié)果來驗證。將上述492. 81片段提交MS/MS分析，根據(jù)肽段測序發(fā)現(xiàn)，在Glu-C酶切下B23-T 樣本產(chǎn)生的492. 81片段就是特征肽段N-KAPVKKGQE-C，表征了樣本因缺失序列“SIRDTP AKNAQKSNQN GKDSKPSSTP RS”后產(chǎn)生的特征肽段，序列在測序過程中為反向分析，如圖5中箭頭所示。該測序結(jié)果可以確證Glu-C酶切與Q-Tof質(zhì)譜方法的結(jié)合的可行性，由于沒有漏切點，因此，在Glu-C+Q-Tof方案下可以穩(wěn)定可靠地檢測B23-T樣本的存在。上述結(jié)果說明，本案中提供的Glu-C酶切方法所產(chǎn)生的特征肽段492. 81即為 B23-T剪接體蛋白的特征肽段，可用于表征任何樣本中B23-T剪接體蛋白。該肽段可以用本領(lǐng)域的常規(guī)方法合成，并可作為檢測B23-T樣本的存在的標志物，用于胃癌的診斷等。肽段“KAPVKKGQE”在質(zhì)譜分析(毛細管液相色譜-電噴霧-四極桿飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀，LC-ESI-MS-MS ；m/z掃描分辨率為0. 05unit)中出現(xiàn)的形式為A. ESI 一級質(zhì)譜為雙電荷峰，形式為[M+H]2+，m/z492. 81 ；B. 二級質(zhì)譜分析時作為母離子(單電荷峰)，形式為[M+H]+，m/ ζ984· 65(492. 81X2-1)特征峰A在ESI源中特異展現(xiàn)(雙電荷峰)，而在Maldi源中被掩蓋。因此，可以用高分辨率的ESI源質(zhì)譜分析酶切后的樣本，而不用每次都對樣本進行測序確證。可以加快樣本的分析速度，降低成本。由于高分辨率質(zhì)譜的引入，可以對肽段m/z精確到0. OlDa, 可以最大限度避免假陽性結(jié)論的出現(xiàn)。下面通過具體的實施例來說明本發(fā)明的技術(shù)方案。實施例標本的采集和處理手術(shù)切除后10分鐘內(nèi)，將標本立刻放入液氮，-80°C儲存直至蛋白提取。取自同一患者的未被腫瘤侵犯的胃全層組織(距腫瘤邊緣6cm以上)做正常對照，在采集過程中使用不同的器械以防止交叉污染標本。1、蛋白提取采用Trizol試劑盒，按說明書抽提蛋白。具體步驟如下(1)在50mg冷凍組織中加入Iml Trizol試劑進行裂解，劇烈震蕩以裂解細胞；(2)將上述Trizol裂解液轉(zhuǎn)入離心管中，在室溫15°C 30°C下放置5分鐘；(3)在上述離心管中，每Iml Trizol裂解液加0. 2ml氯仿，蓋上管蓋，用力震蕩15 秒，在室溫下(15°C 30°C )放置2 3分鐘后，12000轉(zhuǎn) 8°C )離心15分鐘；(4)取上層水相置于離心管中，提取RNA用；(5)取兩層液相中間層的白色沉淀物質(zhì)，即為變性的組織蛋白，用Iml氯仿洗滌沉淀，用于去除殘留的Trizol，棄上清；(6)再用75%酒精洗滌沉淀。2、免疫沉淀實驗在收獲的蛋白中，加入適量EBC裂解液，將1 μ g羊抗B23抗體和20 μ Iprotein A/G-beads加入到蛋白裂解液中，于4°C緩慢搖晃孵育過夜，免疫沉淀反應(yīng)后，在4°C以3， 000轉(zhuǎn)速度離心5分鐘，將protein A/G-beads離心至管底；將上清小心吸去，protein A/ G-beads用Iml NETN緩沖液洗3-4次；最后加入15 μ 1的2 X SDS加樣緩沖液，沸水煮10分鐘，上清部分用于電泳。所述EBC緩沖液的組成50mM Tris-HCl (pH 8. 0)120mMNaCl0. 5% NP-4010 μ g/μ 1抑蛋白酶肽(用前加入)1 μ g/ μ 1亮抑酶肽(用前加入)50 μ g/ml PMSF (用前加入)1 OOmMNaF。所述NETN緩沖液20mM Tris-HCl (pH 8. 0)IOOmMNaClImM EDTA0. 5% NP-40所述2 X SDS加樣緩沖液60mM Tris-HCl (pH 6.8)；2% SDS ；0.1% 溴酚藍；25%甘油；14. 4mM β-巰基乙醇。3、SDS-PAGE 電泳按常規(guī)蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳，上樣15μ 1。電泳完畢，蛋白膠用考馬斯亮藍染色液染色，再使用脫色液脫色。電泳結(jié)果如圖2。所述電泳條件濃縮膠5%丙烯酰胺，125mM Tris-HCl (pH 6. 8)，1 % SDS，0. 1 % 過硫酸銨，5 μ 1 TEMED ；分離膠丙烯酰胺，38mMTris-HCl (pH 8·8)，0· 1%SDS,0. 過硫酸銨，5μ 1 TEMED ；恒流15mA電泳，至溴酚藍遷移至玻璃板底部。所述考馬斯亮藍染色液染色0. 1% Coomassie blue G-250 ；40% 乙醇；10% 冰醋酸。所述脫色液40% 乙醇；10% 冰醋酸。4、切膠脫色取充分清洗干凈的玻璃板，將膠片置于其上。以手術(shù)刀片將目的蛋白區(qū)域的膠塊切成Imm3大小的膠粒。也可用剪刀將200 μ 1 Eppendorf吸頭尖端剪斷約1cm，孔的直徑 大約為1mm。然后用其在目的蛋白區(qū)域(25 40kDa區(qū)域)均勻戳取膠粒。將蛋白膠粒轉(zhuǎn)移至離心管中，用純水反復沖洗2 3遍。棄去洗滌液，用含50%乙腈的25mM碳酸氫銨溶液200 μ 1浸泡膠粒，于37°C水浴保溫20分鐘，振蕩5分鐘，棄去溶液。重復上述步驟2 3次，直至膠粒中的藍色褪盡，呈無色通明狀。干膠將脫色后的膠粒真空干燥30分鐘，使其充分脫水。此時體積將縮小，膠粒呈乳白色。5、膠內(nèi)酶切 蛋白酶的使用量及緩沖液可參考制造廠商提供的說明適當調(diào)整。本實驗中，蛋白酶切溶液的加入量標準為，每5粒膠粒，加入新鮮配制的15μ 1蛋白酶切溶液，并以碳酸氫銨為酶切緩沖體系，然后，置于4°c冰箱充分溶脹后，酶溶液應(yīng)有少量剩余。如膠粒未溶脹充分(呈無色通明狀)，則補加酶溶液；如膠粒完全泡脹后酶液仍有剩余，則將多余的酶液吸
出ο補充20 30 μ 1 25mM碳酸氫銨緩沖液，密封離心管，置于培養(yǎng)箱中保溫12 16 小時。酶切時間延長可能產(chǎn)生較多蛋白酶的自切峰，但不會對試驗結(jié)果產(chǎn)生影響；酶切時間不足則有可能產(chǎn)生漏切現(xiàn)象，影響試驗結(jié)果。所述蛋白酶切溶液25mM碳酸氫銨緩沖液；0. 1 μ g/μ 1 蛋白酶(Trypsin/Glu-C)。所述培養(yǎng)箱保溫條件Trypsin 酶切時，恒溫 37°C ；Glu-C 酶切時，恒溫 30°C。6、肽段抽提將上述經(jīng)膠內(nèi)酶切且離心的樣品取出，吸取上清液(為酶解原液)置于無菌PCR
管中；然后將樣品做如下處理(1)在樣品管中加入抽提液1至剛好沒過膠粒，密封后置于超聲清洗儀中超聲 (300W，超聲5s，間隔5s)，共1 2分鐘，37°C培養(yǎng)箱中保溫30 60分鐘，離心后吸取上清液，置于上述PCR管中；(2)在樣品管中加入抽提液2至剛好沒過膠粒，密封后置于上述(1)相同條件下超聲清洗儀中超聲1 2分鐘，37°C培養(yǎng)箱中保溫30 60分鐘，離心后吸取上清液，置于上述PCR管中；(3)在樣品管中加入10 20μ 1抽提液3于室溫下放置至膠粒脫水變白，離心后， 吸取上清液，置于上述PCR管中；合并酶解原液和抽提液1-3于PCR管中，用Millipore公司的Ziptip C18Tip對樣品進行脫鹽濃縮，獲得質(zhì)譜分析樣品，用于Maldi-tof-MS分析和Q-tof2分析。所述抽提液1:5%三氟乙酸(TFA)。所述抽提液2:2. 5%三氟乙酸(TFA)；
50% 乙腈(ACN)。所述抽提液3:100% 乙腈。7、肽譜分析 Maldi-tof-MS 分析將基質(zhì)α -氰基-4-羥基肉桂酸(α -CCA)溶于含0. 1 % TFA的50%乙腈溶液中， 制成飽和溶液。離心，取1 μ 1上清與1 μ 1上述獲得的質(zhì)譜分析樣品等體積混合，取1 μ 1 點在SCOUT 384靶上，送入離子源中進行檢測。結(jié)果未檢測到與理論預(yù)測492. 29非常接近的特征峰。Q-T0F2肽序列測定多肽測序在英國Micromass公司(現(xiàn)Waters公司)的電噴霧四級桿正交加速-飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀Q-T0F2上進行，儀器配備納升噴霧源及毛細管液相色譜。樣品處理前述獲得的質(zhì)譜分析樣品用0. 1 % TFA稀釋20倍，12000轉(zhuǎn)離心20分鐘，取上清進樣。選用毛細管液相色譜(CapLC)對樣本作分離，(流速1μ 1/min，A 0. 1% TFA B :0. 1% TFA/CH3CN)，再進入ESI離子源。(這種機理無需像Maldi-tof-MS中的基質(zhì)。 樣品液中含有TFA等揮發(fā)性氣體)。由于選用ESI源，所有測定均在正離子方式下進行。質(zhì)譜儀用Glu-fib(ESI Positive CID)的串聯(lián)質(zhì)譜碎片校正，質(zhì)量準確度小于0. 1，作為內(nèi)標物，該肽N端到C端的氨基酸序列為“EGVNDNEEGFFSAR”。霧化氣為氮氣，碰撞氣體為氬氣。 源溫80°C，錐孔電壓50V。毛細管電壓為3kV，碰撞氣體為氬氣。碰撞能量根據(jù)離子電荷與質(zhì)量大小由軟件自動選擇。TOF加速電壓為9. lkV。MCP檢測器電壓為2280V。對MS/MS譜的分析軟件為 MaxEnt3，Biolynx 及 MasSeq。8、檢測結(jié)果標本為隨機從北京腫瘤醫(yī)院1995年的30例年齡33_74歲之間的胃癌患者中選取 3例A、B和C，并且以取自同一患者的未被腫瘤侵犯的胃全層組織作為正常對照組A’、B’和 C’。采用上述Q-T0F2方法測定的結(jié)果如下
權(quán)利要求
1.一種核仁磷酸蛋白可變剪接體的質(zhì)譜學鑒定方法，該方法是Glu-C酶切方法與 Q-TOF質(zhì)譜方法的結(jié)合。
2.如權(quán)利要求1所述的核仁磷酸蛋白可變剪接體的質(zhì)譜學鑒定方法，其中所述Glu-C 酶切方法包括用Glu-C酶對核仁磷酸蛋白可變剪接體進行完全切割的步驟；所述Q-TOF質(zhì)譜方法包括用ESI電離源的Q-TOF方法檢測目的肽的步驟。
3.如權(quán)利要求2所述的核仁磷酸蛋白可變剪接體的質(zhì)譜學鑒定方法，其中所述Q-TOF 質(zhì)譜方法還包括直接對所述目的肽測序驗證目的肽的步驟。
4.如權(quán)利要求3所述的核仁磷酸蛋白可變剪接體的質(zhì)譜學鑒定方法，其中所述目的肽從N端到C端的氨基酸序列為KAPVKKGQE。
5.Glu-C酶在制備用于胃癌診斷的試劑盒中的用途。
6.一種用于胃癌診斷的試劑盒，該試劑盒含有Glu-C酶。
7.如權(quán)利要求6所述的用于胃癌診斷的試劑盒，該試劑盒還含有與所述Glu-C酶分開包裝的肽，該肽從N端到C端的氨基酸序列為KAPVKKGQE ；和/或酶切處理用試劑。
8.如權(quán)利要求6或7所述的用于胃癌診斷的試劑盒，該試劑盒用于Q-TOF質(zhì)譜學方法鑒定。
9.如權(quán)利要求8所述的用于胃癌診斷的試劑盒，其中，所述質(zhì)譜學方法為ESI電離源的 Q-TOF方法。
10.一種肽，該肽從N端到C端的氨基酸序列為KAPVKKGQE。
全文摘要
本發(fā)明提供一種核仁磷酸蛋白可變剪接體的質(zhì)譜學鑒定方法以及胃癌診斷試劑盒。所述方法是Glu-C酶切方法與Q-TOF質(zhì)譜方法的結(jié)合，可應(yīng)用于臨床胃癌的診斷和治療評價中，與已有的方法相比，本發(fā)明的上述方法能夠獲得快速而可靠的鑒定結(jié)果。
文檔編號G01N30/02GK102156164SQ20111000672
公開日2011年8月17日 申請日期2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月13日
發(fā)明者吳曉江, 季加孚, 宗祥龍, 張連海, 彭勇, 李子禹, 胡穎 申請人:北京腫瘤醫(yī)院