專利名稱：去氫甲睪酮多克隆抗體免疫親和柱的制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于免疫親和層析及獸藥殘留檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及去氫甲睪酮多克隆抗體免疫親和柱的制備方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
去氫甲睪酮(l-dehydro-17-methyltestosterone,DMT)，是一種蛋白質(zhì)同化雄性類固醇激素。由于其具有強烈的促進蛋白合成、增強食欲、提高飼料轉(zhuǎn)化率等作用，常被非法用于畜牧生產(chǎn)領(lǐng)域。DMT被人體吸收后，會干擾人體自身的激素平衡，產(chǎn)生嚴(yán)重的毒副作用。目前，DMT常用的檢測方法多為儀器檢測方法，如高效液相色譜(HPLC)、液質(zhì)聯(lián)用(LC-MS)和氣質(zhì)聯(lián)用(GC-MS)等。這些儀器檢測方法對樣品純度要求較高，需經(jīng)過一定的前處理，而傳統(tǒng)的樣品前處理技術(shù)，如液-液萃取(LLE)、固相萃取(SPE)、固相微量萃取 (SPME)等，步驟繁瑣、缺乏選擇性、容易受其他成分的干擾、準(zhǔn)確度低。因此，建立快捷有效的樣品前處理技術(shù)已成為DMT檢測分析中需解決的首要問題。免疫親和色譜(IAC)是一種新型高效的樣品前處理技術(shù)。它的原理是利用抗原抗體間特異性的可逆結(jié)合來實現(xiàn)對復(fù)雜樣品中的目標(biāo)物質(zhì)的提取和凈化處理。近年來，免疫親和色譜技術(shù)結(jié)合常規(guī)儀器分析已成為獸藥殘留檢測的一個主要發(fā)展方向。但目前尚未見 DMT多克隆抗體免疫親和柱的制備及其使用的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種DMT免疫親和柱的制備與使用方法，所研制的親和柱是將 DMT多克隆抗體與溴化氰活化的瓊脂糖4B (CNBr-Sepharose 4B)偶聯(lián)填充于固相萃取管中，用于純化含有DMT的待測樣品。本發(fā)明所述的DMT多克隆抗體免疫親和柱的制備方法，按照下述步驟進行制備
(1)偶聯(lián)取免疫動物并經(jīng)純化的DMT多克隆抗體與溶脹后的CNBr-kpharose4B濕凝膠置于偶聯(lián)緩沖液中在室溫下振蕩偶聯(lián)；
(2)封閉將偶聯(lián)凝膠產(chǎn)物轉(zhuǎn)入其5-10倍體積的封閉緩沖液中，室溫下振蕩反應(yīng)2h ；
(3)洗滌先分別用5-10倍封閉后凝膠體積的醋酸鹽緩沖液和Tris-HCl緩沖液交替洗滌3次，然后用5-10倍封閉后凝膠體積的PBS緩沖液洗滌2次，制備得到免疫親和吸附劑；
(4)裝柱將得到的免疫親和吸附劑填充入固相萃取管中，加入PBS緩沖液后自然沉降，制成DMT多克隆抗體免疫親和柱，于4 °C保存待用；
其中步驟(1)中所述的DMT多克隆抗體與CNBr-kpharose 4B干膠的質(zhì)量比為1:100 ； 所述的偶聯(lián)緩沖液為PH 8. 3、含0.5 mol/L NaCl的0. 1 mol/L NaHCO3偶聯(lián)緩沖液；所述的溶脹CNBr-S印harose 4B的溶液為1 mmol/L HCl溶液；
其中步驟(2)中所述的封閉緩沖液為pH 8.0、含0.5 mol/L NaCl的0. 1 mol/L Tris-HCl封閉緩沖液；其中步驟(3)中所述的醋酸鹽緩沖液為pH 4.0、含0.5 mol/L NaCl的0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液；所述的 Tris-HCl 緩沖液為 pH 8. 0、含 0. 5 mol/L NaCl 的 0. 1 mol/L Tris-HCl 緩沖液；所述的PBS緩沖液為pH 7. 4,0. 01 mol/L的PBS緩沖液；
本發(fā)明去氫甲睪酮多抗免疫親和柱的應(yīng)用，可以應(yīng)用于去氫甲睪酮的快速檢測。本發(fā)明的有益效果(1)本發(fā)明制備的免疫親和柱能夠與DMT特異性結(jié)合，一次凈化能除去絕大部分干擾物，能得到純度較高的DMT。(2)制備的免疫親和柱最大結(jié)合容量約為160 ng DMT; (3)采用的洗脫液為80 %的甲醇-水溶液時，平均加標(biāo)回收率為97. 87 %； (4)制備的免疫親和柱重復(fù)使用3次，回收率不低于90 %。


其中圖1.本發(fā)明IAC柱外觀圖2.本發(fā)明IAC柱洗脫條件選擇優(yōu)化圖； 圖3.本發(fā)明IAC柱最大結(jié)合容量圖； 圖4.本發(fā)明IAC柱icELISA評價方法標(biāo)準(zhǔn)曲線圖； 圖5.本發(fā)明IAC柱HPLC評價方法標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。
具體實施例方式本發(fā)明下面的實施例僅作為本發(fā)明內(nèi)容的進一步說明，不能作為本發(fā)明的限定內(nèi)容或范圍。下面通過實施例對本發(fā)明作進一步說明。實施例1 DMT多抗免疫親和柱的制備
(1)偶聯(lián)
將免疫動物、純化后所得的DMT多克隆抗體置于PH 8. 3、含0. 5 mol/L NaCl的0. 1 mol/L NaHCO3偶聯(lián)緩沖液中透析過夜，并稀釋到0.5 mg/mL后備用；
稱取CNBr-S^harose 4B干膠，于5_10 mL的1 mmol/L HCl溶液中充分溶脹得到一定體積的濕膠。用10倍以上濕膠體積的偶聯(lián)緩沖液快速洗滌2次，4000 r/min離心1 min ； 將洗滌后的濕膠定容至2 mL，迅速加入0.5 mg/mL的抗體溶液，使CNBr-kpharose 4B 干膠與抗體的質(zhì)量比為100:1，于室溫下振蕩反應(yīng)2. 5 h以上；
偶聯(lián)反應(yīng)結(jié)束后，用10倍以上偶聯(lián)凝膠體積的偶聯(lián)緩沖液洗滌除去未偶聯(lián)的抗體，收集洗滌液，運用公式Cpratein(mg/mL)=l. 45 A280 -0. 74 A260 計算未偶聯(lián)的抗體量，得到的偶聯(lián)率在90 %以上；
(2)封閉
將CNBr-kpharose 4B與抗體的偶聯(lián)凝膠產(chǎn)物轉(zhuǎn)入其5_10倍體積的pH 8. 0、含0. 5 mol/L NaCl的0. 1 mol/L Tris-HCl封閉緩沖液中，室溫下振蕩反應(yīng)2 h封閉活性基團；
(3)洗滌
先后用5-10倍偶聯(lián)凝膠體積的pH 4.0、含0.5 mol/L NaCl的0. 1 mol/L醋酸鹽緩沖液、pH 8. 0、含0. 5 mol/L NaCl的0. 1 mol/L Tris-HCl交替洗滌3次，然后用5-10倍偶聯(lián)凝膠體積的PH 7. 4,0. 01 mol/L的PBS洗滌2次；
(4)裝柱
將得到的親和吸附劑填充入與其體積比為4:1的固相萃取管中，制成DMT多克隆抗體免疫親和柱，于4 ！冰箱保存待用。所制備的免疫親和柱外觀圖見說明書附圖1。圖中顯示的是裝填了以上親和吸附劑的IAC柱，柱子由兩部分組成柱身和套管。其中的液體是 PBS。 試驗一、本發(fā)明所述DMT多抗免疫親和柱的條件優(yōu)化方法
1、實施例1所制備得到的DMT多抗免疫親和柱最佳洗脫條件的確定按上述方法制備 5支IAC柱，每柱上樣100 ng的DMT溶液，PBS充分洗滌后，分別用60 %、70 %、80 %、90 %、 100 %甲醇-水溶液洗脫，收集洗脫液于50 °C的旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上旋干，用1 mL的甲醇復(fù)溶后用HPLC法測定洗脫液中標(biāo)準(zhǔn)品含量，計算回收率，當(dāng)甲醇濃度大于80 %時，回收率均在95 %以上，因此選擇有機溶劑濃度較小的80 %的甲醇-水溶液為最佳的洗脫條件。洗脫條件選擇優(yōu)化圖見說明書附圖2 ；
2、實施例1所制備得到的DMT多抗免疫親和柱最大結(jié)合容量的測定制備兩個IAC 柱，分別用6 mL 50 ng/mL(300 ng)的DMT過柱，上樣液每mL收集一管，用間接競爭ELISA (icELISA)測定每組份中DMT含量。根據(jù)下式計算最大結(jié)合容量(即被吸附的DMT總量) =DMT上樣總量一洗下的DMT總量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)1-3 mL上樣液中只有少量DMT，上樣第4 mL 時則有大于30 ng被洗下，5 mL開始無吸附。因此，偶聯(lián)1.0 mg多抗的IAC柱的最大結(jié)合容量約為160 ng。結(jié)合容量確定如說明書附圖3所示；
3、實施例3所制備得到的DMT多抗免疫親和柱加標(biāo)回收率的測定分別上樣2.5 mL的 20 ng/mL、40 ng/mL、60 ng/mL三種不同濃度的DMT，每種濃度作兩組平行。收集洗滌液后用HPLC測定回收率。結(jié)果見表1。用合適的洗脫液洗脫后，經(jīng)測定回收率均達到90 %以上，平均回收率為97.87 % ；
表1. IAC柱的加標(biāo)回收率
權(quán)利要求
1.本發(fā)明所述的DMT多克隆抗體免疫親和柱的制備方法，按照下述步驟進行制備(1)偶聯(lián)取免疫動物并經(jīng)純化的DMT多克隆抗體與溶脹后的CNBr-kpharose4B濕凝膠置于偶聯(lián)緩沖液中在室溫下振蕩偶聯(lián)；(2)封閉將偶聯(lián)凝膠產(chǎn)物轉(zhuǎn)入其5-10倍體積的封閉緩沖液中，室溫下振蕩反應(yīng)2h ；(3)洗滌先分別用5-10倍封閉后凝膠體積的醋酸鹽緩沖液和Tris-HCl緩沖液交替洗滌3次，然后用5-10倍封閉后凝膠體積的PBS緩沖液洗滌2次，制備得到免疫親和吸附劑；(4)裝柱將得到的免疫親和吸附劑填充入固相萃取管中，加入PBS緩沖液后自然沉降，制成DMT多克隆抗體免疫親和柱，于4 °C保存待用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種去氫甲睪酮多克隆抗體免疫親和柱，其特征在于其中步驟(1)中所述的DMT多克隆抗體與CNBr-kpharose 4B干膠的質(zhì)量比為1:100 ；所述的偶聯(lián)緩沖液為PH 8. 3、含0.5 mol/L NaCl的0. 1 mol/L NaHCO3偶聯(lián)緩沖液；所述的溶脹 CNBr-Sepharose 4B 的溶液為 1 mmol/L HCl 溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種去氫甲睪酮多克隆抗體免疫親和柱，其特征在于其中步驟(2)中所述的封閉緩沖液為pH 8.0、含0.5 mol/L NaCl的0. 1 mol/L 1Tris-HCl封閉緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種去氫甲睪酮多克隆抗體免疫親和柱，其特征在于其中步驟(3)中所述的醋酸鹽緩沖液為pH 4. 0、含0. 5 mol/L NaCl的0. 1 mol/L醋酸鹽緩沖液； 所述的 Tris-HCl 緩沖液為 pH 8. 0、含 0. 5 mol/L NaCl 的 0. 1 mol/L Tris-HCl 緩沖液；所述的PBS緩沖液為pH 7. 4,0. 01 mol/L的PBS緩沖液。
5.去氫甲睪酮多克隆抗體免疫親和柱的應(yīng)用，可以應(yīng)用于去氫甲睪酮的快速檢測。
全文摘要
本發(fā)明一種去氫甲睪酮多克隆抗體免疫親和柱的制備方法及其應(yīng)用，屬于免疫親和層析及獸藥殘留檢測技術(shù)領(lǐng)域。公開了去氫甲睪酮多抗免疫親和柱的制備方法及應(yīng)用。通過將免疫動物得到的多克隆抗體純化以后與CNBr-Sepharose4B偶聯(lián)得到的免疫親和吸附劑填充于固相萃取管中制得了對去氫甲睪酮具有特異性吸附的免疫親和柱。本發(fā)明制備的免疫親和柱能夠與去氫甲睪酮特異性結(jié)合，其最大結(jié)合容量約為160ngDMT；采用的洗脫液為80%的甲醇-水溶液時，平均加標(biāo)回收率為97.87%；；重復(fù)使用3次，回收率不低于90%。本發(fā)明可以應(yīng)用于去氫甲睪酮的快速檢測。
文檔編號G01N30/06GK102183601SQ20111000093
公開日2011年9月14日 申請日期2011年1月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年1月5日
發(fā)明者張勛, 徐燕, 王云, 董英 申請人:江蘇大學(xué)