專利名稱：用于評價抗癌候選藥物的系統(tǒng)和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分光光度測定法評價抗癌候選藥物在癌細胞中誘導凋亡的能力的用途。
背景技術(shù)：
細胞死亡可以按照多種方式出現(xiàn)，但是成功的抗癌藥物傾向于通過十分特異的凋亡過程引起癌細胞的死亡。凋亡是細胞借以分解并且自我包裝以便身體有序處置的機制。凋亡通常由身體用來拋棄細胞，此時這些細胞不再需要，太老或已經(jīng)受損或病變。實際上，一些細胞帶有可能導致癌癥的危險突變并且甚至一些早期癌性細胞可以因天然過程而經(jīng)歷凋亡。 在凋亡期間，細胞切割并貯存DNA，使胞核濃集、拋棄過量水并且經(jīng)歷多種細胞膜變化，如空泡化、細胞膜中形成不規(guī)則凸起(見圖I)。凋亡總體上在幾種觸發(fā)物之一發(fā)送信號至應當發(fā)生凋亡的細胞之后出現(xiàn)。在許多癌細胞中，這種信使體系沒有正確地工作，因為細胞不能檢測到觸發(fā)物，未能在觸發(fā)物被接收后恰當?shù)匕l(fā)送信號或未能作用信號，或細胞可以甚至具有組合的這些問題?？傮w效應是一些癌細胞中抵抗經(jīng)歷凋亡。如本文所用，癌包括上皮惡性腫瘤、白血病、淋巴瘤和間充質(zhì)惡性腫瘤。許多有效的抗癌藥物可以誘導癌細胞經(jīng)歷凋亡，即便它抵抗這個過程。因此，需要檢測特定候選藥物是否可以在多種類型的癌細胞中引起凋亡并且還需要與其他藥物或候選藥物相比確定這種候選藥物的有效性。在美國專利6，077，684和美國專利6，258，553中描述的MiCK測定法目前用來檢測源自患者的癌細胞在應答于已知有效對抗一個或多個類型癌癥的特定藥物時是否經(jīng)歷凋亡。在MiCK測定法中，將源自患者的癌細胞置于給定濃度的單細胞或小細胞團聚物的懸液中并且允許調(diào)節(jié)微量滴定平板的多個孔中的條件。將對照溶液或具有不同濃度的已知的抗癌藥物(一般是針對患者的癌類型所推薦的那些藥物)的溶液導入所述孔中，每孔一種測試樣品。隨后定期測量每個孔的光密度，一般每隔幾分鐘，持續(xù)通常幾日的一段時間。隨著細胞經(jīng)歷凋亡相關(guān)性空泡化，其光密度以線性方式增加。如果細胞因其他原因而不經(jīng)歷凋亡或死亡，其光密度不以這種方式變化。因而，如果某個孔的光密度(OD)對時間的曲線產(chǎn)生了在時間間隔范圍內(nèi)具有正斜率的直線曲線(見圖2)，則這個孔中的抗癌藥物誘導患者的癌細胞凋亡并且可能是這位患者的合適療法。相對于時間數(shù)據(jù)的OD也可以用來計算動力學單位，所述動力學單位類似地與患者的療法適應性相關(guān)。雖然MiCK測定法已經(jīng)用來檢測已知抗癌藥物對特定患者癌細胞的作用，但是仍需要開發(fā)這種測定法的變型，所述變型能夠探索和評價其他類型的凋亡相關(guān)性細胞/化學品相互作用。發(fā)明簡述本公開提供了一種評價抗癌候選藥物在已知癌細胞系中誘導凋亡的能力的方法。這種方法可以包括在能夠由分光光度計讀取的平板的至少一個孔中放置源于已知癌細胞系的活癌細胞的單細胞懸液，其中癌細胞處于足以在孔底上形成細胞單層的濃度；將至少一種候選藥物以足以實現(xiàn)候選藥物目標濃度的量添加至所述孔，在大約600nm波長，使用分光光度計以選擇的時間間隔測量所述孔的光密度延續(xù)選擇的持續(xù)時間，從光密度和時間量值確定動力學單位值，并且使動力學單位值與以下情況相關(guān)如果動力學單位值是正的，則抗癌候選藥物能夠在所述癌細胞系中誘導凋亡；或如果動力學單位值不是正的，則抗癌候選藥物不能夠在所述癌細胞系中誘導凋亡。根據(jù)又一個實施方案，相似的方法可以用來評價抗癌候選藥物在某個癌類型中誘導凋亡的能力，其中，在測定法中所用的已知癌細胞系是所述癌細胞類型。根據(jù)更具體的實施方案，相關(guān)可以包括使動力學單位值分別與以下情況相關(guān)如果動力學單位值大于I. 5、2或3，則抗癌候選藥物能夠在所述癌細胞系中誘導凋亡；并且如果動力學單位值小于I. 5、2或3，則抗癌候選藥物不能夠在所述癌細胞系中誘導凋亡。相關(guān)也可以包括使動力學單位值與以下情況相關(guān)如果動力學單位值是負的，則自發(fā)性細胞死亡或壞死由抗癌候選藥物誘導。
根據(jù)其他的具體實施方案，癌細胞處于2 X IO5和IX IO6個細胞/mL的濃度之間。癌細胞可以處于指數(shù)或非指數(shù)生長期。在一個具體實施方案中，尤其當癌細胞來自癌細胞系時，它們可以處于指數(shù)生長期。根據(jù)其他的具體實施方案，可以將至少一種額外的候選藥物以足以實現(xiàn)額外候選藥物目標濃度的量添加至所述孔。根據(jù)其他的實施方案，可以將癌細胞置于平板的多個孔中并且每個孔可以具有不同的候選藥物目標濃度。例如，候選藥物目標濃度可以在在O. 01 μ M和10，000 μ M之間。根據(jù)額外的實施方案，選擇的時間間隔可以是5至10分鐘。持續(xù)時間可以在12小時和120小時之間。根據(jù)一個額外的實施方案，本公開涉及了已知癌細胞系的細胞評價抗癌候選藥物誘導凋亡的能力的用途，其中在能夠由分光光度計讀取的平板的至少一個孔中放置源于已知癌細胞系的活細胞的單細胞懸液，其中癌細胞處于足以在孔底上形成細胞單層的濃度。所述用途包括將至少一種候選藥物以足以實現(xiàn)候選藥物目標濃度的量添加至所述孔；在大約600nm波長，使用分光光度計以選擇的時間間隔測量所述孔的光密度延續(xù)選擇的持續(xù)時間；確定光密度和時間量值的動力學單位值，并且使動力學單位值與以下情況相關(guān)(a)如果動力學單位值是正的，則抗癌候選藥物能夠在所述癌細胞系中誘導凋亡；或(b)如果動力學單位值不是正的，則抗癌候選藥物不能夠在所述癌細胞系中誘導凋亡。根據(jù)一個更具體的實施方案，已知的癌細胞系與某種癌類型相關(guān)，并且候選藥物能夠或不能夠在所述癌細胞系中誘導凋亡與所述候選藥物能夠或不能夠在所述癌細胞類型中誘導凋亡相關(guān)。在本說明書自始至終共同使用以下縮寫和術(shù)語OD-光密度MiCK-微量培養(yǎng)動力學附圖
簡述可以通過結(jié)合附圖所取得的以下描述獲得本發(fā)明實施方案及其優(yōu)點的更完整理解。
圖I顯示細胞的現(xiàn)有技術(shù)顯微照片。圖IA顯示凋亡之前的細胞。圖IB顯示在凋亡期間空泡化出現(xiàn)時的細胞。圖IC顯示凋亡完成或接近完成時的細胞。圖2是一條現(xiàn)有技術(shù)曲線，其顯示在MiCK測定法期間時間對光密度(OD)的曲線的實例，在所述MiCK測定法中抗癌藥物在測試的癌細胞中誘導凋亡。圖3是顯示MiCK測定法中誘導凋亡、耐藥性和無藥物時對照細胞的代表性曲線的圖。標記為“B12”的曲線顯示代表其中藥物誘導凋亡的細胞的數(shù)據(jù)。標記為“F3”的曲線顯示代表了抵抗藥物的細胞的數(shù)據(jù)。標記為“G5”的曲線顯示代表了不接受任何藥物的對照細胞的數(shù)據(jù)。圖4是顯示MiCK測定法中誘導凋亡或壞死的代表性數(shù)據(jù)的圖。標記為“D2”的曲線顯示代表其中藥物誘導凋亡的細胞的數(shù)據(jù)。標記為“D7”的曲線顯示代表其中藥物誘導壞死或否則在測定過程期間經(jīng)歷壞死的細胞的數(shù)據(jù)。圖5是顯示MiCK測定法中總體的非藥物誘導細胞死亡的代表性數(shù)據(jù)的圖。標記 為“C4”的曲線顯示代表在測定過程期間自發(fā)細胞死亡的數(shù)據(jù)。圖6是顯示了評價與不同癌類型相對應的已知細胞系對伊達比星應答的代表性日期的圖。圖7是顯示了評價已知的CA0V-3卵巢癌細胞系對不同化療藥應答的代表性數(shù)據(jù)的圖。詳述本公開涉及使用分光光度測定法來測量某個時間段范圍內(nèi)的光密度(OD)評價抗癌候選藥物在癌細胞中引起凋亡的有效性。在一個實施方案中，本公開包括在一種測定法中通過施加候選藥物至癌細胞評價這種候選藥物的方法，所述測定法與如美國專利6，077，684和美國專利6，258，553中公開的微量培養(yǎng)動力學(MiCK)測定法相似，兩份文獻均通過引用方式并入本文。測定法根據(jù)一個具體實施方案，這種測定法可以通過選擇抗癌候選藥物并且選擇在其上測試所述藥物的至少一種已知癌細胞類型來進行。實施方案可以涉及使用這些已知的癌細胞類型來測試候選藥物的方法或這些已知癌細胞類型在如本文中進一步詳細描述的候選藥物測試中的用途?？梢允拱┘毎谂囵B(yǎng)基如RPMI中懸浮為單細胞懸液。如本文所用，“單細胞懸液”是一個或多個細胞在液體中的懸液，其中所述細胞分開作為個體或處于10個或更少細胞的團塊中。培養(yǎng)基可以含有其他組分，如胎牛血清或癌細胞特殊需要的組分。這些組分可以限于維持細胞延續(xù)所述測定法的持續(xù)期(一般至少24小時和不長于120小時)的那些組分。懸浮的細胞可以通過在分光光度測定平板的孔中安置樣品進行測試。細胞可以按任何濃度懸浮，從而在OD的分光光度測量期間，平板讀數(shù)儀的光束通常一次僅通過一個細胞層。對于大多數(shù)細胞，可以使用2X105和IXlO6個細胞/mL之間的濃度。對于小細胞，濃度可以增加，并且對于大細胞，濃度可以降低。為了更精確地確定適宜的細胞濃度，可以將候選藥物測試樣品中待使用的細胞懸液的體積添加到平板的至少一種濃度測試孔。如果在候選藥物的測試期間這個孔將用額外的培養(yǎng)基預先填充，則濃度測試孔可以類似地用額外的培養(yǎng)基預先填充。在填充濃度測試孔后，可以將平板離心(例如以500轉(zhuǎn)/分鐘持續(xù)2分鐘)以使細胞沉降于孔底上。如果細胞濃度是對測定法適宜的，則細胞應當形成單層，而不重疊。如果適宜，可以調(diào)節(jié)細胞濃度直至這種結(jié)果實現(xiàn)。使用不同的濃度測試孔，可以一次測試多個濃度的細胞。根據(jù)其中細胞可以過夜或在平板中安置細胞和啟動候選藥物測定法之間的另一個時間段期間明顯生長的實施方案，可以調(diào)節(jié)細胞濃度以初步實現(xiàn)不充分的單層以便允許生長，從而用于單層的足夠細胞將在候選藥物測定法啟動時存在。癌細胞可以處于指數(shù)或非指數(shù)生長期。在一個具體實施方案中，尤其當癌細胞來自癌細胞系時，它們可以處于指數(shù)生長期。在適宜的細胞濃度已經(jīng)確定后，候選藥物測定法可以通過用適宜體積的培養(yǎng)基和適宜數(shù)目的細胞填充平板中的測試孔和對照孔繼續(xù)進行。在其他實施方案中，孔可以只用培養(yǎng)基部分地預填充。
在填充后，可以允許細胞以調(diào)節(jié)平板條件持續(xù)設(shè)定的時間段，如至少12小時、至少16小時、至少24小時、或12-16小時、12-24小時、16-24小時。對于某些細胞類型，可以省略調(diào)節(jié)期，如白血病/淋巴瘤細胞系或通常作為單個細胞存在的其他細胞類型。調(diào)節(jié)期一般足夠地短，從而細胞在這段時間期間不經(jīng)歷明顯的生長。調(diào)節(jié)期可以根據(jù)候選藥物測定法中所用的癌細胞類型變動。調(diào)節(jié)可以在合適保持細胞存活和健康的條件下進行。例如，可以將平板置于37° C和5%C02氣氛下的增濕培養(yǎng)箱中。對于一些細胞類型，特別是不經(jīng)歷調(diào)節(jié)期的細胞類型，如白血病細胞系或淋巴瘤細胞系，可以將平板離心(例如以500轉(zhuǎn)/分鐘持續(xù)2分鐘)以使細胞沉降于孔底上。在調(diào)節(jié)期后，可以將候選藥物和任何對照藥物或其他對照樣品添加至所述孔。一般而言，與孔中液體的總體積相比，候選藥物將在小體積的培養(yǎng)基或其他液體中添加。例如，添加的藥物的體積可以小于孔中液體總體積的10%。候選藥物可以按多個稀釋度添加以允許確定任何濃度效應。雖然許多候選藥物可以是水溶性的，但是也可以測試不輕易可溶于水中的候選藥物。此類候選物可以與任何適宜的載體混合。此類候選物可以優(yōu)選地與預期實際臨床使用的載體混合。粘稠的候選藥物可能需要大量稀釋以便進行測試。具有濃重顏色的候選藥物可以從監(jiān)測僅含有候選藥物的測試孔中的OD并且從測試樣品孔的量值扣除這個OD中獲益。在添加候選藥物后，可以允許細胞有另一個短調(diào)節(jié)期(例如15分鐘或30分鐘)。細胞可以置于合適保持細胞存活和健康的條件下。例如，可以將平板置于37° (、5%0)2氣氛下的增濕培養(yǎng)箱中。在這個短調(diào)節(jié)期后，可以將一層礦物油置于每個孔的頂部上以維持培養(yǎng)基中CO2。平板隨后可以置于分光光度計中，所述分光光度計設(shè)置成以給定的時間間隔在600nm波長測量每個孔的OD持續(xù)給定的總時間段。例如，每個孔的OD可以在秒、分鐘或小時的時間期限范圍內(nèi)測量持續(xù)24小時和120小時之間的時間。對于某些細胞，持續(xù)期短至12小時的測量可以是足夠的。在具體實施方案中，測量可以每隔5至10分鐘進行。分光光度計可以具有避免細胞自發(fā)死亡的孵育室。分光光度測量數(shù)據(jù)可以換算成動力學單位。動力學單位通過曲線的斜率確定，所述曲線在由細胞空泡化引起的600nm處OD變化作為時間的函數(shù)作圖時產(chǎn)生。關(guān)于動力學單位計算的具體信息在 Kravtsov, Vladimir D.等人，Use of the Microculture KineticAssay ofApoptosis to Determine Chemo sensitivitiesof Leukemias (凋亡的微量培養(yǎng)動力學確定白血病化學敏感性的用途)，Blood P2:968-980 (1998)中提供，所述文獻通過引用方式并入本文。給定濃度的給定候選藥物的光密度可以對時間作圖。如果細胞曾正經(jīng)歷凋亡，這個圖給出不同的增長曲線。圖3和4中顯示細胞經(jīng)歷凋亡時獲得的曲線的實例。在比較時，如果候選藥物對細胞沒有作用(例如，它們是耐藥的)，則這條曲線類似于對沒有藥物或候選藥物的對照樣品所獲得的那條曲線(圖3)。歸因于除凋亡之外原因的細胞死亡也可以通過當前測定法確定并且用消除來自候選藥物篩查的假陽性。例如，細胞壞死產(chǎn)生與如圖4中所見的凋亡曲線容易區(qū)別的一條明顯下斜曲線。另外，廣泛細胞死亡也造成如圖5中所見的向下曲線。候選藥物的有效性可以通過候選藥物在改良MiCK測定法中使用已知細胞系時產(chǎn) 生的動力學單位的值確定。動力學單位可以如下確定KU= (Vmax所處a的藥物-Vmax對照)X 60 Xy/ (0D比色皿-OD空白)Vmax是最大動力學速率，它是在細胞正在經(jīng)歷凋亡時OD對時間曲線中驟增的斜率。這個等式中的Vmax以毫光密度單位/小時(m0D/h)給出。OD ttftM是含有細胞的對照的初始OD且ODse是僅含有培養(yǎng)基或培養(yǎng)基及藥物的空白孔的初始OD(就一些藥物而言，可以省略藥物，但是對于有色藥物，尤其可以在空白中包括它)，y是取決于待測定的細胞類型的系數(shù)并且可以通過細胞系的觀察結(jié)果以實驗方式確定。關(guān)于這個等式的其他信息可以在Kravtsov等人中找到。除允許確定候選藥物是否引起或不引起凋亡之外，使用本發(fā)明測定法時所產(chǎn)生的動力學單位值可以與確定特定候選藥物是否比當前藥物表現(xiàn)更好或與其相似進行比較。也可以進行不同濃度的候選藥物的比較并且這可以給出適宜劑量的一般說明。有時，一些藥物可以在一些癌癥中在較高濃度上比較低濃度表現(xiàn)得較不好。不同濃度候選藥物的動力學單位值的比較可以鑒定具有相似特性的候選藥物?？傮w上，抗癌候選藥物的評價可以包括對這種候選藥物影響癌細胞凋亡的任何確定。這些影響可以包括，但不限于誘導凋亡、與已知抗癌藥物相比誘導凋亡的程度、以不同候選藥物濃度誘導凋亡的程度和不能誘導凋亡?？拱┧幬镌u價測定法也可以能夠檢測癌細胞中的非藥物相關(guān)性或非凋亡性事件，如在分析或細胞壞死期間的癌細胞生長。任何統(tǒng)計顯著的正動力學單位值可以表示候選藥物誘導癌細胞凋亡的某些傾向性。然而出于許多臨床目的，僅能夠誘導十分低水平凋亡的候選藥物或藥物濃度不是有意義的。因此，在本公開的某些實施方案中，可以設(shè)定動力學單位閾值以區(qū)分能夠在癌細胞中誘導臨床相關(guān)水平的凋亡的候選藥物。例如，這個閾值量可以是I. 5、2或3個動力學單位。針對特定候選藥物或候選藥物濃度選擇的實際閾值可以取決于眾多因素。例如，對于能夠在下述癌類型中誘導凋亡的候選藥物，可以接受較低的閾值，如I. 5或2，其中所述癌類型不應答于其他藥物或僅應答于具有明顯不利副作用的藥物。對于在較高濃度顯示功效降低或本身可能具有明顯不利副作用的候選藥物，也可以接受較低的閾值。對于能夠在已經(jīng)存在合適療法的癌類型中誘導凋亡的候選藥物，可以接受較高的閾值，如3。候選藥物根據(jù)一個具體實施方案，抗癌候選藥物可以是待評估其在癌細胞中誘導凋亡的能力的任何化學品。這些候選物可以包括多種化學實體或生物學實體，如化療藥、其他小分子、基于蛋白質(zhì)或肽的候選藥物(包括與化療藥分子連接的抗體或抗體片段)、基于核酸的療法、其他生物制品(biologies)、基于納米粒子的候選物等。候選藥物可以處于與現(xiàn)存藥物相同的化學家族中，或它們可以是新的化學實體或生物學實體。候選藥物不限于單一化學實體、生物學實體或其他實體。它們可以包括不同化學實體或生物學實體的組合，例如所提出的聯(lián)合療法。另外，雖然本文中的許多實例涉及一種其中施加單一候選藥物的測定法，然而也可以針對組合的多種藥物實施測定法。多于一種候選藥物、候選藥物濃度或藥物或候選藥物的組合可以在單個測定法中使用單一平板進行評估。不同的測試樣品可以置于不同的孔中。在特定的實施方案中，所測試的候選藥物的濃度可以在O. 01 μ M和10，000 μ M之間。測試的濃度可以根據(jù)藥物類型變動。 平板和分光光度計系統(tǒng)在具體實施方案中，可以選擇平板和分光光度計，從而分光光度計可以讀取平板。例如，在使用較舊的分光光度計時，可以使用具有較大孔的平板，因為這種設(shè)備不能讀取孔較小的平板。更新的分光光度計可以能夠讀取具有較小孔的平板。然而，可能要避開具有極小孔的平板，原因在于填充各孔、精確測量小體積和被覆礦物油毒性方面的難度，所述難度可能在小體積孔中增加。在一個實施方案中，每個孔的底部的直徑不小于分光光度計光束的直徑。在一個更具體的實施方案中，每個孔的底部的直徑不多于分光光度計光束的直徑兩倍。這有助于確保精確讀取每個孔中細胞的代表性部分在600nm處的0D。分光光度計可以在除600nm之外的波長處測量。例如，波長可以是+/_5或+/-10。然而，可以選擇其他波長，從而能夠區(qū)分空泡(blebbling)。分光光度計可以包括一個或多個計算機或程序以操作設(shè)備或以記錄結(jié)果。在一個實施方案中，分光光度計可以功能地與能夠?qū)γ總€孔控制測量方法、記錄其結(jié)果和顯示或傳輸圖表的一臺或多臺計算機連接，所述圖表將光密度繪制為時間的函數(shù)?？梢允褂迷O(shè)計用于組織培養(yǎng)的平板，或可以將其他平板消毒和處理以使它們與組織培養(yǎng)相容。允許細胞在分光光度計不可及的區(qū)域(如在角落中)聚集的平板可能比避免此類聚集的平板工作欠佳?？蛇x地，可以添加更多癌細胞至這些平板以確保在測定法期間存在分光光度計可及的單層。具有狹窄底部的平板(如Corning Costar 半面積96孔平板)也可以有助于激勵單層在孔底形成，而不要求不便利低的樣品體積。也可以使用其他平板，如其他96孔板或更小孔的平板，如384孔平板。癌細胞本發(fā)明測定法中使用的癌細胞可以是任何建立的、充分表征的癌細胞系。使用建立的細胞系有助于避免復雜情況，如可能以難以檢測并且可能引起不精確測試結(jié)果的一部分細胞的突變。在一個具體實施方案中，癌細胞可以來自常用于抗癌藥物篩選的任何細胞系，以獲得FDA或同等政府對治療特定癌癥的藥物的批準。通常，對于精確結(jié)果，癌細胞系可以是已知的癌細胞系，例如，它可以是隨時間推移總體上相同的單一培養(yǎng)物或接近單一培養(yǎng)物，如從美國典型培養(yǎng)物保藏中心或相似保藏機構(gòu)獲得的細胞系。已知癌細胞系可以是可驗證為惡性的或可驗證為具有本領(lǐng)域用來鑒定這個細胞系的標記。例如，HeLa細胞系是已知的宮頸癌細胞系。雖然不要求，但是在一些情況下，已知的癌細胞系將是永生化的。多個癌細胞系可以在本發(fā)明測定法中的同一個平板測試。然而，歸因于調(diào)節(jié)和測試時間的差異，可以在不同的平板上測試生長速率十分不同或?qū)φ账幬锩舾行允植煌募毎?。在分析期間，癌細胞可以不總是保持為單細胞懸液。例如，實體瘤系可以附著至孔的表面并且形成彼此結(jié)合的細胞層。這種附著和結(jié)合總體上可以不干預測定法，尤其如果細胞不重疊或以妨礙分光光度計量值基本上代表經(jīng)歷空泡化的總細胞的百分比的方式形成團塊。
實施例可以通過參考以下實施例更好地理解本發(fā)明。將這些實施例包括以便僅描述示例性實施方案并且不應當解釋為包括本發(fā)明的整個范圍。實施例I-使用多個細胞系的候選藥物篩選·根據(jù)本公開的實施方案使用藥物篩選分析法，測試候選藥物伊達比星(4-去甲氧基柔紅霉素)(通常用來治療急性髓樣白血病的)的抗瘤性、針對人白血病源和淋巴瘤源細胞系的凋亡誘導活性。測試的細胞系是HL60( —種急性早幼粒細胞白血病細胞系)、JURL-MK2 ( 一種處于原始細胞危象的慢性髓系白血病)、M0LT-3 ( 一種急性T-細胞淋巴性白血病)和RAMOS ( —種源自Burkitt淋巴瘤的B細胞系)。癌細胞從37° C在含有5%C02的增濕空氣中補充有10%熱滅活胎牛血清、100U/ml青霉素和100pg/mL鏈霉素的無酚紅RPMI 1640培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)中指數(shù)生長的培養(yǎng)物獲得。將細胞收獲、用預溫的培養(yǎng)基洗滌并且重懸于完全培養(yǎng)基中。測試適宜的細胞計數(shù)和生存力。將完全培養(yǎng)基中來自每個細胞系的細胞以2-5 X IO5個細胞的濃度置于96孔板的孔內(nèi)。將候選藥物伊達比星的多個稀釋物以5μ L等分試樣添加至所述孔。候選藥物的終濃度是O. 01、0· 1、0· 5、I. 5、10和20 μ m。將平板在37。C在增濕的5%C02氣氛中孵育30分鐘。在這個調(diào)節(jié)期后，30 μ I無菌礦物油層積于每個孔的頂部。將微量滴定平板是置于孵育的分光光度計室(37° C)中并且每隔5分鐘測量600nm處的OD持續(xù)48小時時間。使用僅含有完全培養(yǎng)基并且不含細胞的孔，將讀數(shù)儀校準至零吸光度。全部測試一式三份進行。使用適宜的軟件進行數(shù)據(jù)采集和計算。將OD讀數(shù)針對時間作圖以提供細胞對藥物和候選藥物應答的動力學描述。計算每個測試孔的動力學單位。低于3的動力學單位視為負應答，并且高于3的動力學單位視為正應答。I. 5和3之間的動力學單位視為邊際應答(marginalresponse)。伊達比星在M0LT-3、JURL_MK2和RAMOS細胞系中引起超過3個動力學單位的凋亡性應答。HL-60細胞針對對照藥物具有2. 3個動力學單位的最大應答并且因而略微地下降小于藥物靈敏度閾值，僅顯示邊際靈敏度。因而，這個測試顯示，伊達比星可以不用于對抗急性早幼粒細胞白血病。另外，僅在高濃度時在Ramos細胞系中見到正應答，這表明伊達比星可能在治療Burkitt淋巴瘤時僅具有邊際使用,這歸因于在較高的藥物濃度上副作用可能增加。最后，采用M0LT-3細胞時在伊達比星的較低濃度上的較高動力學單位讀數(shù)可以表明可以優(yōu)選使用較低濃度的伊達比星來治療急性T-細胞淋巴性白血病。實施例2-對單一細胞系使用多種候選藥物或化療藥的篩選針對單一卵巢癌細胞系CA0V-3測試多種抗癌藥物以確定它們針對卵巢癌的適用性。測試按照與實施例I中相同的方式進行，但是采用更高的藥物濃度。結(jié)果顯示，長春瑞濱和奧沙利鉬不是治療卵巢癌的合適藥物。結(jié)果還顯示依立替康可能在治療卵巢癌時僅具有邊際用途，這歸因于需要使用高濃度的藥物以實現(xiàn)正應答。絲裂霉素、伊達比星、佐柔比星和米托蒽醌均在合理的濃度顯示正應答并且因而是用于治療卵巢癌的合適候選藥物。雖然上文僅描述了本發(fā)明的示例性實施方案，但是可以理解，這些實例的修改和變型是可能的，而不脫離本發(fā)明的精神和預期范圍。例如，在本說明書中，給出特定的量值。 本領(lǐng)域普通技術(shù)人員將理解，在許多情況下，與給出的量值相似但不完全相同的其他值可以是等同的，并且也可以由本發(fā)明包括。
權(quán)利要求
1.一種評價抗癌候選藥物在已知癌細胞系中誘導細胞凋亡的能力的方法，包括 在能夠由分光光度計讀取的平板的至少一個孔中放置源于已知癌細胞系的活癌細胞的單細胞懸液，其中所述癌細胞處于足以在孔底上形成細胞單層的濃度； 將至少一種候選藥物以足以實現(xiàn)候選藥物目標濃度的量添加至所述孔； 在大約600nm波長，使用分光光度計以選擇的時間間隔測量所述孔的光密度延續(xù)選擇的持續(xù)時間； 從所述光密度和時間量值確定動力學單位值； 使所述動力學單位值與以下情況相關(guān) a)在所述動力學單位值為正的情況下所述抗癌候選藥物在所述癌細胞系中誘導細胞凋亡的能力； b)在所述動力學單位值非正的情況下所述抗癌候選藥物不能夠在所述癌細胞系中誘導細胞凋亡。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中相關(guān)包括使所述動力學單位值與以下情況相關(guān) a)在所述動力學單位值大于I.5的情況下所述抗癌候選藥物在所述癌細胞系中誘導細胞凋亡的能力； b)在所述動力學單位值小于I.5的情況下所述抗癌候選藥物不能夠在所述癌細胞系中誘導細胞凋亡。
3.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中相關(guān)包括使大致線性的區(qū)域的斜率與以下情況相關(guān) a)在所述動力學單位值大于2的情況下所述抗癌候選藥物在所述癌細胞系中誘導細胞凋亡的能力； b)在所述動力學單位值小于2的情況下所述抗癌候選藥物不能夠在所述癌細胞系中誘導細胞凋亡。
4.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中相關(guān)包括使大致線性的區(qū)域的斜率與以下情況相關(guān) a)在所述動力學單位值大于3的情況下所述抗癌候選藥物在所述癌細胞系中誘導細胞凋亡的能力； b)在所述動力學單位值小于3的情況下所述抗癌候選藥物不能夠在所述癌細胞系中誘導細胞凋亡。
5.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中相關(guān)包括如果所述光密度曲線的斜率在所述持續(xù)時間范圍內(nèi)是負的，則使所述動力學單位值與所述癌細胞系中由所述抗癌候選藥物誘導自發(fā)性細胞死亡或壞死相關(guān)。
6.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述癌細胞處于2X IO5和I X IO6個細胞/mL之間的濃度。
7.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述癌細胞處于指數(shù)生長期。
8.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中將所述癌細胞置于平板的多個孔中并且每個孔具有不同的候選藥物目標濃度。
9.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，包括將至少一種額外的候選藥物以足以實現(xiàn)額外候選藥物目標濃度的量添加至所述孔。
10.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法,其中候選藥物目標濃度在O.01 μ M和ΙΟ,ΟΟΟμΜ之間。
11.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其 中選擇的時間間隔是5至10分鐘。
12.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述持續(xù)時間在12小時和120小時之間。
13.根據(jù)權(quán)利要求I所述的方法，其中所述已知的癌細胞系與某種癌類型相關(guān)，并且所述候選藥物能夠或不能夠在所述癌細胞系中誘導細胞凋亡與所述候選藥物能夠或不能夠在所述癌細胞類型中誘導細胞凋亡相關(guān)。
14.已知癌細胞系的細胞評價抗癌候選藥物誘導細胞凋亡的能力的用途，其中在能夠由分光光度計讀取的平板的至少一個孔中放置源于已知癌細胞系的活細胞的單細胞懸液，其中所述癌細胞處于足以在孔底上形成細胞單層的濃度； 將至少一種候選藥物以足以實現(xiàn)候選藥物目標濃度的量添加至所述孔； 在大約600nm波長，使用分光光度計以選擇的時間間隔測量所述孔的光密度延續(xù)選擇的持續(xù)時間； 確定所述光密度和時間量值的動力學單位值； 使所述動力學單位值與以下情況相關(guān) (a)在所述動力學單位值為正的情況下所述抗癌候選藥物在所述癌細胞系中誘導細胞凋亡的能力； (b)在所述動力學單位值非正的情況下所述抗癌候選藥物不能夠在所述癌細胞系中誘導細胞凋亡。
15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的用途，其中所述已知的癌細胞系與某種癌類型相關(guān)，并且所述候選藥物能夠或不能夠在所述癌細胞系中誘導細胞凋亡與所述候選藥物能夠或不能夠在所述癌細胞類型中誘導細胞凋亡相關(guān)。
全文摘要
本公開提供了一種通過以下方式評價抗癌候選藥物在已知癌細胞系中誘導細胞凋亡的能力的方法在平板的孔中放置已知癌細胞系的單細胞懸液，將至少一種候選藥物以足以實現(xiàn)候選藥物目標濃度的量添加至所述孔，以選擇的時間間隔測量光密度延續(xù)選擇的持續(xù)時間，從光密度和時間量值確定動力學單位值，并且使動力學單位值與以下情況相關(guān)如果動力學單位值是正的，則抗癌候選藥物能夠在所述癌細胞系中誘導細胞凋亡。相似的方法可以用來評價抗癌候選藥物在某個癌類型中誘導細胞凋亡的能力。
文檔編號G01N33/50GK102906565SQ201080066972
公開日2013年1月30日 申請日期2010年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者瑪?shù)贇W·佩里, 艾倫·E·霍奎斯特 申請人:戴克腫瘤學有限公司