專利名稱：Y型探針及其變形型及利用該y型探針的dna微陳列、試劑盒以及基因分析方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在基因型檢測及分析時(shí)，可通過改善靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度來廣泛用于診斷的，在ー個(gè)本體內(nèi)具有兩 個(gè)探針部位的Y型核苷酸探針(probe)及其變形型(d型或者b型探針)，以及利用該Y型核苷酸探針的DNA微陳列、試劑盒以及基因分析方法。
背景技術(shù)：
DNA微陳列或者DNA芯片是在載玻片等固相載體(solid support)上，以點(diǎn)(spot)方式，點(diǎn)樣了數(shù)十個(gè)至數(shù)億個(gè)基因探針的。在DNA微陳列上，放置從組織或者細(xì)胞、體液等檢體中提取之后，用熒光物質(zhì)(fluorescent dye)等來標(biāo)記的DNA、RNA、cDNA、cRNA、微小RNA、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction; PCR)產(chǎn)物等核酸,并執(zhí)行雜交反應(yīng)或者測序(sequencing)反應(yīng),可通過突光掃描機(jī)等設(shè)備來分析在其反應(yīng)中出現(xiàn)的標(biāo)記物質(zhì)的信號。據(jù)此，通過一次實(shí)驗(yàn)可勘察大單位基因的表達(dá)變化或者基因型(genotype)。DNA微陳列是迄今在基因相關(guān)研究或者臨床診療當(dāng)中不可缺少的工具，該DNA微陳列利用于基因的功能和基因組研究等基礎(chǔ)科學(xué)研究，而且掌握基因疾病的機(jī)制，并樹立診斷指針，查明特定藥物的作用機(jī)制和副作用，并可廣泛利用于設(shè)定疾病的治療決策等臨床診療(PetrikJ.Diagnostic applications of microarrays.Transfusion Medicine.2006;16:233—247;Wheelan SJ，Murillo FM and Boeke JD.The incredible shrinking world of DNAmicroarrays.Mol Biosyst.2008;4(7):726-732;Li X，Quigg RJ，Zhou J，Gu W,Nagesh RaoP, Reed EF.Clinical utility of microarrays:current status, existing challengesand future outlook.Current Genomics.2008;9 (7):466_74)。DNA微陳列根據(jù)置于其上或者點(diǎn)樣(spotting)在其上的探針的種類，劃分為寡核苷酸微陳列和置有cDNA或PCR產(chǎn)物的其他微陳列等兩種DNA微陳列。作為迄今實(shí)現(xiàn)商業(yè)化的微陳列，大部分主要使用寡核苷酸微陳列。寡核苷酸微陳列根據(jù)其制備方法大體上可劃分為兩種。一個(gè)是在固相載體上直接合成寡核苷酸的，可舉例光版印刷(photolithograpy)方式的昂飛(Affymetrix)公司的芯片、噴墨方式的安捷倫(Agilent)公司的芯片、電子合成方式的科恩比矩陣(Combimatrix)公司的芯片、光化學(xué)合成方式的羅氏(Nimblegen)公司的芯片等。另ー個(gè)是在固相載體上點(diǎn)樣(spotting)或者印上另行預(yù)先制備的寡核苷酸探針的方法。目前處于后者更為廣泛利用的趨勢，作為代表性的例子可舉例應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystem Inc, ABI)公司的產(chǎn)品、柯德爾墨水(Codel ink)公司的產(chǎn)品以及光照派(Illumina)公司的產(chǎn)品等。這些微陳列產(chǎn)品上點(diǎn)樣了長度為18個(gè)至75個(gè)堿基(bp)的單鏈的直線型(liner, single strand)寡核苷酸探針，點(diǎn)的數(shù)量多樣,最少為12000個(gè),最多為 10億 7200 萬個(gè)(Wheelan SJ, Murillo FM and Boeke JD.The incredible shrinkingworld of DNA microarrays.Mol Biosyst.2008 ；4 (7):726_732)。DNA微陳列執(zhí)行以往常 規(guī)的基因檢測進(jìn)行過的三種工作，但是，該DNA微陳列與以往的基因檢測法的不同點(diǎn)在于:能夠以所謂高吞吐量(high-throughput)或大單位一下子檢測多個(gè)基因，由此大大減少時(shí)間和費(fèi)用，還可應(yīng)用于臨床診斷。利用DNA微陳列的第一檢測法是尋出特定堿基序列的基因是否存在于檢體內(nèi)的定性分析(qualitative analysis)。例如是將成為疾病的病原菌的固有基因的堿基序列用作探針來制備微陳列，在其上放置檢體的核酸進(jìn)行雜交反應(yīng)，由此尋出靶基因來診斷病原菌的方法。利用這種所謂基因型分析(genotyping)，可準(zhǔn)確掌握作為宮頸癌病原菌的人乳頭瘤病毒(human papilloma virus, HPV)或作為流感病原菌的流行性感冒病毒(influenza virus)、性感染病原菌的種類以及菌株或亞種(strain)。而且，由于掌握是否存在各個(gè)癌癥固有的基因，還可診斷特定癌癥。還可預(yù)測要檢測的細(xì)菌或癌癥的惡性度或預(yù)后是否產(chǎn)生藥物反應(yīng)及副作用。這還可以用低密度(low density)微陳列來實(shí)現(xiàn),具有制備容易，費(fèi)用低廉，有用于臨床診斷的優(yōu)點(diǎn)，是在商業(yè)化最容易實(shí)現(xiàn)的形態(tài)的DNA芯片(I^SM, Choi TH, Lee SY,Yoo NC.Applications of DNA microarray in disease diagnostics.T Microbiol Biotechnol.2009:19 (7):635-46)。利用DNA微陳列的第二檢測法是，用于確認(rèn)特定堿基序列的基因在檢體內(nèi)存在多少的定量分析(quantitative analysis)。這將是首次登場的cDNA微陳列表現(xiàn)的檢測法(Shena M, Shalon D, Davis Rff,Broiwn P0.Quantitative monitoring of gene expressionpattern with a amplementary DNA microarray.Science.1995; 270:467-470)。在微陳列內(nèi)點(diǎn)樣要勘察的基因的多個(gè)探針，并用分別不同的熒光染料(fluorescent dye)標(biāo)記靶物質(zhì)或靶疾病的對照物質(zhì)或者對照組的RNA或cDNA、cRNA之后，置于微陳列上進(jìn)行雜交反應(yīng)，由此掌握基因表達(dá)時(shí)，兩組之間究竟出現(xiàn)何種差異的方法。利用DNA微陳列的第三檢測法是，用于確認(rèn)基因的堿基序列的變化，具體是檢測單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)、點(diǎn)突變(point mutation)或者缺失(deletion)的方法,進(jìn)而,還可以確認(rèn)特定基因的復(fù)制數(shù)(copy number)。通常,針對要分析的堿基分別采用單堿基的寡核苷酸探針分為野生型(wild type)和突變型(mutantor variant type) 2種,或者分為A、C、G、T等4個(gè)種類,然后在微陳列上點(diǎn)樣，由此制備DNA芯片。隨后，利用ー種方法:在其上放置檢體DNA或cDNA，或者放置PCR產(chǎn)物，并在非常嚴(yán)格的條件(highly stringent condition)下執(zhí)行雜交反應(yīng),來尋 出完全一致的探針。即，在微陳列上利用等位基因特異性寡核苷酸雜交法(allele specific oligonucleotidehybridization, ASH)或雜交測序(sequencing by hybridization, SBH)方法。好幾家企業(yè)正在銷售以等位基因特異性寡核苷酸雜交方式檢測人體的整體SNP或者重要SNP的微陳列。例如，就昂飛(Affymetrix)公司的SNP芯片而言，將對于ー個(gè)SNP采用20個(gè)至28個(gè)多種完全一致型(perfect match type)及不一致型(mismatch type)的寡核苷酸探針利用于微陳列(Rabbee N and Speed TP.Agenotype calling algorithm for AffymetrixSNP arrays.Bioinformatics2006;22:7-12;Liu WM, X.Yang XD G, Matsuzaki H,HuangJ, Mei R, Ryder TB, Webster TA, Dong S`, Liu G, K.ff.Jones Kff, G.C.Kennedy GC and Kulp
D.Algorithms for large-scale genotyping microarrays, Bioinformatics.2003;19:2397-2403)。但是，利用DNA微陳列要對多個(gè)靶的單堿基的差異進(jìn)行準(zhǔn)確的識別，實(shí)際上存在很多困難。對此，最近針對DNA微陳列，強(qiáng)大的競爭產(chǎn)品也上市了。例如，作為連讀嵌入式數(shù)據(jù)庫引擎(giga base)的堿基的所謂高吞吐量(high-throughput)堿基序列分析設(shè)備的宜曼達(dá)(Illumania)公司的Solexa和Helicos、羅氏(Roche)公司的454設(shè)備、應(yīng)用生物系統(tǒng)(Applied Biosystems)公司的SOLiD。實(shí)際上這些產(chǎn)品與DNA微陳列相比時(shí)，在堿基序列分析的量上超過了 DNA微陳列，而且，在十幾天內(nèi)可解讀人體基因組的整體堿基序列(Wheelan SJj Murillo FM and B oeke JD.The incredible shrinking world ofDNAmicroarrays.Mol Biosyst.2008;4 (7):726_732)。微陳列于1995年 由希娜(Sherma)首次發(fā)表之后，雖然其歷史長久，但臨床上實(shí)際利用的產(chǎn)品只在少數(shù)。對于美國來說，作為藥物基因組學(xué)(pharmacogenetics)檢測產(chǎn)品的AmpliChip CYP450、作為乳房癌診斷芯片的MammaPrint、用于檢測p53突變的AmpliChipP53檢測、用于勘察癌癥的根源的PathwOTk Tissue of Origin檢測、用于勘察染色體異常的BAC airay檢測法備受美國食品與藥物管理局(FDA)的認(rèn)可而被使用(Li X，QuiggRJj Zhou J, Gu W，Nagesh Rao P，Reed EF.Clinical utility of microarrays: currentstatus,existing challenges and future outlook.Curr Genomics.2008;9(7):466-74;Heller T，Kirchheiner J，Armstrong VW,Luthe H, Tzvetkov M, BrockmollerJ，Oellerich M.AmpliChip CYP450 GeneChip:a new gene chip that allows rapidand accurate CYP2D6 genotyping.Ther.Drug Monit.2006;28:673-677;Mook S，Van’tVeer LJ，Rutgers EJj Piccart-Gebhart MJj Cardoso F.1ndividualization of therapyusing Mammaprint: from development to the MINDACT Trial.Cancer Genomics Proteomics.2007;4:147-155;Lawrence HJ，Truong S，Patten N，N akao A, Wu L.detection ofp53mutations in cancer by the amplichip p53test)。并且，在韓國和歐洲等國家，用于診斷人乳頭瘤病毒(HPV)的基因型的芯片備受食品與藥物管理局的認(rèn)可而被售賣。為了將DNA微陳列廣泛利用于臨床診斷，需要解決的問題不少。即使是任何一種形態(tài)的DNA微陳列，在分析信號時(shí)出現(xiàn)的非特異性信號，所謂本底噪聲(backgroundnoise)均成為共同問題。這將給分析或產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)化帶來困難。因此，實(shí)際上目前提出了對于DNA微陳列的準(zhǔn)確度或價(jià)值的嚴(yán)重非難(Allison DB，Cui XQj Page GP and SabripouM.Microarray data analysis:From disarray to consolidation and consensus,Genetics.2006;7:55-65;Draghici SP，Eklund SPK and Eklund and Szallasi Z.Reliabilityand reproducibility issues in DNA microarray measurements.Trends in Genetics 2006;22:pp.101_109;Kothapalli R，Yoder SJ，Mane S and Loughran TPj Microarrayresults:How accurate are they .BMC Bioinformatics.2002;3:22)。DNA微陳列在許多點(diǎn)上一下子進(jìn)行多次檢測，需要對其資料進(jìn)行處理，出現(xiàn)實(shí)際上不能容易進(jìn)行準(zhǔn)確的資料分析和統(tǒng)計(jì)處理的問題。通常釆用對檢測結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析時(shí)，將p值(value)調(diào)到0.05，并接受小于0.05、小于5%的錯(cuò)誤的方法。但是，如果在微陳列上，分析數(shù)千萬到10億多個(gè)的點(diǎn)時(shí)，其中，約5%的數(shù)百至數(shù)千萬的點(diǎn)的資料呈假陽性或假陰性，這將成為嚴(yán)重的大規(guī)模錯(cuò)誤。為了避免這種錯(cuò)誤，試圖過分析多個(gè)微陳列的方法，但是當(dāng)考慮到個(gè)別微陳列的價(jià)格昂貴的問題時(shí)，在費(fèi)用方面上存在很多困難。在實(shí)際操作利用微陳列的實(shí)驗(yàn)時(shí)，毎次做實(shí)驗(yàn)結(jié)果都不同，而且各個(gè)微陳列的結(jié)果上出現(xiàn)大差異的情況較多，甚至，即使在相同的一個(gè)微陳列內(nèi)，也按不同點(diǎn)出現(xiàn)差異。這種問題當(dāng)中最大的因素之一是實(shí)驗(yàn)的對照組(control)未被確實(shí)定立。換言之，在DNA微陳列上進(jìn)行雜交實(shí)驗(yàn)時(shí)，按各個(gè)點(diǎn)尚未明確設(shè)定內(nèi)部參照物質(zhì)(internal reference)。
在DNA微陳列實(shí)驗(yàn)時(shí)可能會出現(xiàn)的錯(cuò)誤分為兩種，一個(gè)是基于各實(shí)驗(yàn)的檢體或目的的特有的錯(cuò)誤，另ー個(gè)是微陳列自身或檢測過程中引起的錯(cuò)誤。前者與檢體的不均勻性(heterogeneity)和多態(tài)性、隨著生理狀態(tài)而發(fā)生的變化、基因與環(huán)境的相互作用等相關(guān)。后者是DNA微陳列自身引起的錯(cuò)誤(slide effect)，例如，制備DNA微陳列時(shí)出現(xiàn)的錯(cuò)誤:固相載體即載玻片的種類和表面化學(xué)、點(diǎn)樣探針時(shí)使用的微針、在各點(diǎn)上點(diǎn)樣的探針的量、探針與載玻片的相互作用，探針是否堅(jiān)固地固定于載玻片等。而且，雜交反應(yīng)進(jìn)行的多么順利也是關(guān)鍵，這取決于溫度、時(shí)間以及緩沖液的條件。標(biāo)記物質(zhì)是否好好標(biāo)記(labeling)在檢體核酸也是關(guān)鍵(Bakay M, Chen YW, Borup R, Zhao P，Nagaraju K and
E.P.Hofiman EP.sources of variability and efiect 01 experiments丄 approach onexpression profiling data interpretation.BMC Bioinformatics.2002;3:4;Han ES, WuY,McCarter R，Nelson JF，Richardson A and Hilsenbeck S S.Reproducibility, sourcesof variability, pooling, and sample size:1mportant considerations for the designof high-density oligonucleotide array experiments.Journal of Gastroenterology.2004;59:306-315; Huber W, Heydebreck A, Sultmann H，Poustka A and VingronM,Variance stabilization applied to microarray data calibration and to thequantification of differential expression,Bioinformatics.2002;18:96-104;Mol1y MPj Brzezinski EE，Hang JQj McDowell MT and VanBogelen RA.0vercoming technicalvariation and biological variation in quantitative proteomics.Proteomics.2003
;3:1912-1919;Oleksiak MFj G.A.Churchill GA and D.L.Crawford, Variation in geneexpres sion within and among natural populations,Nature Genetivs.2002;32:261—266;Sprui丄丄 SE，Hardy JLS and Weir B.Assessing sources of variability inmicroarray gene expression data.BioTechniques.2002:916-923;Whitney AR，DiehnM，Popper SJj Alizadeh AAj J.C.Boldrick JC，Reiman DA and Brown P0.1ndividualityand variation in gene expression patterns in human blood,Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.2003;100:1896-1901;Zakharkin SO, Kim K，Mehta T，Chen L,Barnes S, ScheirerKE，Parrish RS，Allison DB and Page G P.Sources of variation in Affymetrixmicroarray experiments.BMC Bioinformatics.2005;6:214)。在進(jìn)行DNA微陳列實(shí)驗(yàn)時(shí)可能會出現(xiàn)的另一個(gè)問題與探針相關(guān)。如上所述，迄今，大部分DNA微陳列使用直線型的單螺旋寡核苷酸探針。但是，這些探針在固相載體上進(jìn)行雜交反應(yīng)時(shí)，與液體狀態(tài)下進(jìn)行的雜交不同地難以調(diào)整成`適當(dāng)條件。設(shè)計(jì)而制備適當(dāng)?shù)墓押塑账崽结樖枪押塑账嵛㈥惲械摹鞍⒒锼闺臁?，也是成功的重要條件。因此，為了改善現(xiàn)有直線型寡核苷酸探針的問題，試圖過多種變形探針的設(shè)計(jì)方法。例如，將天然的核酸在其堿基或糖環(huán)(sugar ring)或者磷酸雙酯骨架(phosphodiesterbackbone)改變結(jié)構(gòu)的所謂核酸衍生物(nucleic acid analog)或仿制品(mimic)。作為代表性的例子包含肽核酸(peptide nucleic acid, PNA)、鎖核酸(locked nucleicacid, LNA)及嗎B非基(morpholino)等。PNA或LNA與常規(guī)的寡核苷酸相比時(shí),其熔融溫度(Tm)上出現(xiàn)明顯的差異，具有尤其對單堿基的SNP或突變分析優(yōu)秀的優(yōu)點(diǎn)(Karkareb, Bhatnagar D.Promising nucleic acidanalogs and mimics:cnaracteristic featuresand applications of PNA，LNA，and morpholin0.Appl Microbiol Biotechnol.2006;71(5):575-86;TolstrupN, Nielsen PS,Kolberg TG,Frankel AM,Vissing H,KauppinenS.01igoDesign:0ptimal design of LNA (locked nucleic acid) oligonucleotidecapture probes for gene expression profiling.NucleicAcids Res.2003;31(13):3758-62;Nhakeel S, Karim S and Ali A.Peptide nucleic acid (PNA)-a review.J ournal of ChemicalTechnology and biotechnology.2006; 81:892-899)。但是，不能廣泛利用于分析多個(gè)基因的表達(dá)，當(dāng)前尚未開發(fā)出如同本發(fā)明的Y型探針，在內(nèi)部一起結(jié)合追加的對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基因的探針的形態(tài)。作為多種變形探針的其他例子，可舉例寡重生(0LIG0SPAWN)。這是由表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tag,EST)的大規(guī)模單基因簇(unigene)數(shù)據(jù)庫中設(shè)計(jì)橫穿寡核苷酸探針(Overgo probe)的方法(Zheng.T, Svensson TT, Madishetty K, Close TI, TiangT,Lonardi S.0ligoSpawn: a software tool for the design of overgo probes from largeunigene datasets.BMC Bioinformatics.2006 Tan9: 7: 7)。這雖然有利于快速設(shè)計(jì)寡核苷酸探針，但尚未開發(fā)出如同本發(fā)明的Y型探針，在內(nèi)部一起結(jié)合追加的對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基因的探針的形態(tài)。作為多種變形探針的另一個(gè)例子，還涌躍起進(jìn)行基因組DNA瓦片陳列(GenomicDNA tiling array) (Bertone P, Trifonov V, Rozowsky TS, Schubert F, Emanuelsson0,Karro T.Kao MY, Snyder M, Gerstein M.Design optimization methods for genomicDNA tiling arrays.Genome Res.2006;16 (2): 271-81;Wheelan SJ, Murillo FM andBoeke JD.The incredible shrinking world of DNA microarrays.Mol Biosyst.2008;4(7):26-732)。這是在一個(gè)探針放入多個(gè)亞探針，接著在微陳列的一個(gè)點(diǎn)內(nèi)嵌入多個(gè)探針來一下子檢測多個(gè)基因的瓦片方式寡核苷酸微陳列`(mult1-tiling oligonucleotidemicroarray)。這是在一個(gè)探針內(nèi)一下子連接位于類似位置的多個(gè)寡核苷酸而層壓的形態(tài)的探針，對確認(rèn)巨大基因組整體的基因表達(dá)有效。但是，這只是單純地將多個(gè)寡核苷酸連接為縱長的直線，而無法分開識別進(jìn)入到一個(gè)瓦片(tiling)探針內(nèi)的各個(gè)寡核苷酸和亞探針。這雖然對檢測基因數(shù)的延長有效率，但并不像本發(fā)明的Y型探針包含內(nèi)部對照參照物質(zhì)，因此檢測的靈敏度或特異度及再現(xiàn)性難以被視為顯著提高。如上所述，為了 DNA微陳列廣泛利用于臨床診斷，DNA微陳列所使用的寡核苷酸探針需要進(jìn)一步改善，而且可使檢測法和結(jié)果解讀均為標(biāo)準(zhǔn)化是關(guān)鍵。首先，為了實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化，需要按各個(gè)點(diǎn)添加內(nèi)部參照物質(zhì)或?qū)φ瘴镔|(zhì)(internal reference or control)的探針。這是為了解決各個(gè)點(diǎn)與微陳列、各個(gè)點(diǎn)與載玻片、各個(gè)點(diǎn)與雜交反應(yīng)的差異及錯(cuò)誤而必須要采用的。

發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問題本發(fā)明的目的在于，提供在各點(diǎn)上將要檢測的靶基因和對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基因一起用作探針而嵌入的新穎Y型探針及其變形型，由此改善以往寡核苷酸探針，并解決現(xiàn)有寡核苷酸微陳列的問題，實(shí)際應(yīng)用于臨床診斷。問題的解決手段本發(fā)明者為了解決上述的現(xiàn)有寡核苷酸微陳列的問題，講究了一個(gè)探針和在一個(gè)點(diǎn)內(nèi)將要檢測的靶基因和對照基因一起用作探針而嵌入的方法。一起結(jié)合靶基因的探針和對照基因的探針來制成一個(gè)探針，以可充分統(tǒng)計(jì)的數(shù)字(例如，20個(gè)以上)，在微陳列上對該探針進(jìn)行點(diǎn)樣之后，在其上側(cè)放置檢體核酸，即DNA或RNA、cDNA、cRNA、微小RNA等進(jìn)行雜交反應(yīng)時(shí)，如果分別將靶基因和對照基因標(biāo)記為Cy_3及Cy-5，則在各點(diǎn)上除外本底信號之后的信號中測定了對照基因與靶基因的信號之比(Cy3/Cy5)，如果在各個(gè)點(diǎn)上檢索該比之后計(jì)算其平均及標(biāo)準(zhǔn)偏差，則可實(shí)現(xiàn)更加正確的的統(tǒng)計(jì)分析。這相當(dāng)于在各個(gè)點(diǎn)內(nèi)嵌入對照組來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，由此使假陽性和假陰性最小化，避免點(diǎn)之間差異引起的錯(cuò)誤，從而可實(shí)現(xiàn)順暢的正態(tài)化(normalization)。由此,使上述的滑動(dòng)效果，即DNA微陳列導(dǎo)致的錯(cuò)誤最小化，僅通過少數(shù)的微陳列的實(shí)驗(yàn)，即可獲得可統(tǒng)計(jì)的資料，因此還可以顯著減少各實(shí)驗(yàn)中所需的費(fèi)用和時(shí)間。據(jù)此，本發(fā)明者發(fā)明了在一個(gè)本體內(nèi)以Y字形態(tài)放置兩個(gè)寡核苷酸探針部位的本發(fā)明的Y型探針以及在固相載體上點(diǎn)樣該Y型探針的方法。同時(shí)，還研制出了使Y型探針中的一側(cè)不對稱地變短的變形，即d字形或者b字形的探針。由于本發(fā)明的探針一次包含兩個(gè)寡核苷酸探針或者肽核酸(PNA)探針并形成為Y字形態(tài)，因而，所包含的各探針與各自的互補(bǔ)性堿基序列的核酸進(jìn)行反應(yīng)，由此同時(shí)發(fā)生兩個(gè)雜交反應(yīng)，在進(jìn)行該反應(yīng)時(shí)，嵌入兩個(gè)不同的檢索用染料(dye)，從而可分析其反應(yīng)。本發(fā)明者開發(fā)及制備出如此的Y字形雙重寡核苷酸探針(Y-shaped duplex oligonucleotideprobe,以下被稱為‘Y字形探針’或者‘Υ字探針’或者‘Υ型探針’)，還開發(fā)了通過利用該Y字形雙重寡核苷酸探針來檢測基因，并將該Y字形雙重寡核苷酸探針應(yīng)用于臨床診斷的方法。`本發(fā)明的探針由左側(cè)探針部分(left side probe)、左側(cè)莖區(qū)部分(left sidestem)、右側(cè)莖區(qū)部分、右側(cè)探針部分、連接肽(linker)(或者間隔(spacer))部分等五種部位形成。本探針的左側(cè)及右側(cè)探針部分由最多達(dá)到150個(gè)的寡核苷酸或者PNA形成，按照目的可應(yīng)用多種堿基序列。只不過，就兩側(cè)的寡核苷酸探針而言，其堿基序列的一側(cè)為正向(5’ 一3’)，另一側(cè)為反向(3’ 一5’)。莖區(qū)部分由最多達(dá)到40個(gè)的互補(bǔ)性寡核苷酸形成，并起到支撐向上方相連接的兩側(cè)探針的作用?？刹捎盟械那o區(qū)部分的堿基序列，若使用端粒堿基順序則方便。連接肽起到將兩側(cè)的探針和莖區(qū)固定在載玻片等固相載體上的作用。作為DNA微陳列的載體，廣泛利用經(jīng)過醛處理的載玻片，在該情況下，作為連接肽適合采用內(nèi)部氨基發(fā)生變形的多個(gè)碳基組(internal Amino Modifier Cn dT;iAmMCnT)。除此之外，將在末端帶有生物素(biotin)的多個(gè)碳基組用作連接肽，上述探針和莖區(qū)還可以通過利用該連接肽，固定在包被鏈毒親和素(streptoavidin)的載體上。如果利用陣列儀(arrayer)將本發(fā)明的Y字形探針點(diǎn)樣在載玻片等載體，則完成DNA微陳列。其中，用突光染料(fluorescent dye)等來標(biāo)記要檢測的祀核酸，即DNA或RNA、cDNA、cRNA、微小RNA等之后,放置該祀核酸進(jìn)行雜交反應(yīng)之后,可用熒光掃描機(jī)來分析此時(shí)產(chǎn)生的突光信號。此時(shí)的掃描機(jī)根據(jù)檢測目的和方法可選擇單色、雙色或者四色的掃描機(jī)。本發(fā)明的Y字形寡核苷酸探針，相比單一直線型探針具有更優(yōu)秀的優(yōu)點(diǎn)。第一，由于在一個(gè)整體的探針內(nèi)包含兩個(gè)探針部位，因而進(jìn)行雙重檢索，由此可進(jìn)行更準(zhǔn)確的分析。第二，通過一起檢索對照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或內(nèi)部參照物質(zhì)，來使假陰性結(jié)果(false negativeresult)和假陽性結(jié)果(false positive result)最小化,因此可改善檢測的靈敏度和特異度。第三，通過避免點(diǎn)間錯(cuò)誤，可實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的統(tǒng)計(jì)分析。第四，可實(shí)現(xiàn)對于對照物質(zhì)的靶物質(zhì)的相對性計(jì)量。第五，由于存在莖區(qū)部位，對于熔融溫度(Tm)或時(shí)效處理溫度來說，在熱力學(xué)上可更加進(jìn)行區(qū)別化，這將在以等位基因特異雜交方式對單一堿基的突變進(jìn)行分析時(shí)，會更清楚地掌握變化。第六，莖區(qū)部位位于其上側(cè)的探針部位和連接肽及載玻片載體之間，來減少空間妨礙或電磁場妨礙，并且使雜交反應(yīng)順利進(jìn)行。根據(jù)本發(fā)明，第一，可提 供可分析要診斷的疾病及各基因的DNA或者RNA的特定序列有無的Y型探針及其設(shè)計(jì)和制備方法，第二，可提供點(diǎn)樣了Y型探針的生物芯片及其制備方法，第三，可提供能夠有效地與上述生物芯片進(jìn)行反應(yīng)的PCR方法和熒光標(biāo)記方法，第四，可提供利用上述生物芯片來檢測靶基因，并分析基因型、基因表達(dá)程度及基因堿基序列的突變的方法，第五，可提供能夠?qū)⑸鲜錾镄酒糜谂R床的方法。發(fā)明的主旨本發(fā)明提供一種在一個(gè)本體具有兩個(gè)探針部位的Y字形的核苷酸探針。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針向5’ 一3’的方向以及從左側(cè)上方朝向右側(cè)上方的方向，依次由(I)左側(cè)探針部位、(2)左側(cè)莖區(qū)部位、(3)連接肽部位、(4)右側(cè)莖區(qū)部位以及(5)右側(cè)探針部位形成。本發(fā)明提供d字形的核苷酸探針，上述Y字形探針的(I)左側(cè)探針部位被去除，由
(2)左側(cè)莖區(qū)部位、(3)連接肽部位、(4)右側(cè)莖區(qū)部位及(5)右側(cè)探針部位形成。本發(fā)明提供b字形的核苷酸探針，上述Y字形探針的(5)右側(cè)探針部位被去除，由(I)左側(cè)探針部位、(2)左側(cè)莖區(qū)部位、(3)連接肽部位及(4)右側(cè)莖區(qū)部位形成。優(yōu)選地，就本發(fā)明的上述Y字形、d字形及b字形的探針而言，上述左側(cè)莖區(qū)部位和右側(cè)莖區(qū)部位呈現(xiàn)由具有互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸來相結(jié)合的結(jié)構(gòu)，上述左側(cè)莖區(qū)部位或者右側(cè)莖區(qū)部位，在分別相對于左側(cè)莖區(qū)部位或者右側(cè)莖區(qū)部位的整體堿基序列中，包含一半以上的G堿基。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述左側(cè)莖區(qū)部位和右側(cè)莖區(qū)部位呈現(xiàn)由具有互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸來相結(jié)合的結(jié)構(gòu)，莖區(qū)部位的堿基序列包含端粒的堿基序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述左側(cè)莖區(qū)部位或者右側(cè)莖區(qū)部位，由堿基單體反復(fù)一次以上而形成，上述堿基單體選自包含以下的堿基單體的組中。TTGGG ；TAGGG ；TTGGGG ；TTTGGG ；TTAGGG ；TTTGGGG ；TTTAGGG ；TTTTGGGG ；TTTAGGGG。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述左側(cè)探 針部位或者右側(cè)探針部位具有與靶基因互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸。
優(yōu)選地,本發(fā)明的上述左側(cè)探針部位或者右側(cè)探針部位是具有15個(gè)至150個(gè)的堿
基序列的寡核苷酸。優(yōu)選地，就本發(fā)明的上述左側(cè)探針部位而言，從上方到下方的堿基序列以5’ 一 3’的順序排列；就上述右側(cè)探針部位而言，從下方到上方的堿基序列以5’ 一3’的順序排列。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述連接肽部位為了與包被醛固相載體相結(jié)合，由作為氨基改性雙脫氧胸苷的C6dT、C3dT、C12dT或者C18dT形成。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針由肽核酸(PNA)形成。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針通過合成方法來制備而得，該合成方法包括以下步驟:I)脫除三苯甲基步驟；2)偶聯(lián)步驟；3)加帽步驟；以及4)氧化步驟。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位分別由寡核苷酸形成，該寡核苷酸具有分別與一個(gè)靶基因內(nèi)的兩個(gè)相互不同的部位互補(bǔ)的堿基序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位分別由寡核苷酸形成，該寡核苷酸具有與一個(gè)祀基因內(nèi)的相同的部位互補(bǔ)的堿基序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位分別由寡核苷酸形成，該寡核苷酸具有分別與相互不同的靶基因互補(bǔ)的堿基序列。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位中的一側(cè)探針部位由具有與靶基因互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸形成；剩余的一側(cè)`探針部位由具有與對照基因互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸形成。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述對照基因與靶基因沒有互補(bǔ)性，并且在檢體中不存在或者表達(dá)。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述對照基因是大腸桿菌的motD基因。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針是具有序列號5至序列號50中的一個(gè)以上堿基序列的
寡核苷酸。本發(fā)明提供一種DNA微陳列，該DNA微陳列是上述探針在固相載體進(jìn)行點(diǎn)樣而形成的。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述固相載體選自包含載玻片、玻珠、微型孔板、硅晶片及尼龍膜的組中。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述DNA微陳列還點(diǎn)樣了人β —珠蛋白基因。優(yōu)選地，本發(fā)明的作為上述探針的點(diǎn)樣部位的加樣孔(well)劃分為8個(gè)。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針由具有序列號5至序列號50中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于HPV的檢測及基因型分析。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針與具有5’末端由Cy5來標(biāo)記的序列號4的堿基序列的寡核苷酸引物和5’末端由Cy3來標(biāo)記的序列號I的堿基序列的寡核苷酸引物互補(bǔ)地相結(jié)
八
口 ο優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針由具有序列號51至序列號55中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于作為性傳播疾病(STD)的病原菌的檢測以及基因型分析，上述病原菌分別為淋球菌(NG)、沙眼衣原體(CT)、單純性皰疹病毒(HSV)、梅毒螺旋體(TP)及杜克雷嗜血桿菌(HD)。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針由具有序列號56至序列號199中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于A型流感病毒的檢測以及基因型分析。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針由具有序列號212至序列號213的堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于表皮生長因子受體(EGFR)基因和β -肌動(dòng)蛋白的表達(dá)分析。優(yōu)選地，就本發(fā)明的上述探針而言，左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位中的某一側(cè)由與靶核酸的有義鏈的單核苷酸多態(tài)性(SNP)部位互補(bǔ)的寡核苷酸形成，剩余的一側(cè)由與不具有靶核酸的反義鏈的SNP部位的部位互補(bǔ)的寡核苷酸形成，上述探針用于SNP分析。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針由序列號220至序列號239中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于 ACE、ADRB2、Apo E、CETP, CFH、ESRl、ILIA、MTHFR 或者 N0S3 基因的SNP分析。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述探針由序列號258至序列號272中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于K-ras基因的突變分析。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述d字形探針的右側(cè)探針部位由具有與A、C、G或者T的點(diǎn)突變互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸形成；此時(shí)，將與點(diǎn)突變互補(bǔ)的堿基位于右側(cè)探針部位的中心部位；右側(cè)探針部位的長度為15bp至30bp，上述d字形探針用于點(diǎn)突變分析。本發(fā)明提供一種檢體的基因分析用試劑盒，該檢體的基因分析用試劑盒包含:上述DNA微陳列；針對檢體的靶基因的PCR反應(yīng)用引物對；緩沖液；以及雜交反應(yīng)用緩沖液。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述PCR反應(yīng)用引物對用于A型流感病毒的基因擴(kuò)增，上述PCR反應(yīng)用引物對是具有選自序列號208至`序列號211中的堿基序列的寡核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述PCR反應(yīng)用引物對用于β -肌動(dòng)蛋白和EGFR基因的定量型實(shí)時(shí)PCR，上述PCR反應(yīng)用引物對分別是具有序列號214至序列號219的堿基序列的寡核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述PCR反應(yīng)用弓丨物對用于SNP檢測，上述PCR反應(yīng)用弓丨物對是具有選自序列號240至序列號257中的兩個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述試劑盒用于疾病的診斷、預(yù)防、預(yù)測或者對癥治療。本發(fā)明提供一種基因分析方法，該基因分析方法包括在上述DNA微陳列上放置用標(biāo)記物質(zhì)來標(biāo)記的檢體的靶核酸，并對上述探針和靶核酸進(jìn)行雜交的步驟。優(yōu)選地,本發(fā)明的上述標(biāo)記物質(zhì)是選自包含Cy3、Cy5、Cy5.5、氟硼突(Bodipy)、Alexa 488、Alexa 532、Alexa 546、Alexa 568>Alexa594>Alexa 660、羅丹明(Rhodamine)、TAMRA> FAM> FITC、Fluor X、ROX、德克薩斯紅(Texas Red)、澄青(Orange green) 488X、澄青 514X、HEX、TET、JOE、牡蠣(Oyster) 556、牡蠣 645、氟硼熒 630/650、氟硼熒 650/665、Calfluor Orange 546、Calfluor red 610>Quasar 670 及生物素的組中的一個(gè)以上的標(biāo)記物質(zhì)。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述祀核酸通過PCR、RT-PCR或者試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄(in vitrotranscription)方法,用標(biāo)記物質(zhì)來標(biāo)記。優(yōu)選地，本發(fā)明的基因分析方法，還包括如下步驟:經(jīng)過上述雜交反應(yīng)之后，利用熒光掃描機(jī)來分析標(biāo)記物質(zhì)的信號，來勘察靶核酸的表達(dá)程度。優(yōu)選地,本發(fā)明的上述信號分析是通過正態(tài)化過程(normalization)來進(jìn)行的。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述正態(tài)化過程是在各點(diǎn)上除外本底的噪聲信號，來勘察Cy5和Cy3的信號，重新與作為持家基因的β -肌動(dòng)蛋白基因的Cy3信號進(jìn)行比較的三重正態(tài)化過程。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述靶核酸選自包含DNA、RNA、cDNA及cRNA的組中。優(yōu)選地，本發(fā)明的上述cDNA通過RT-PCT，并用Cy3來標(biāo)記；上述cRNA通過試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄，并用Cy3來標(biāo)記。優(yōu)選地，在用本發(fā)明的上述Cy3來標(biāo)記的cDNA或者cRNA上雜交了混合物，該混合物由用Cy5來標(biāo)記的作為外部對照物質(zhì)(external control)的大腸桿菌的motD基因混合。并且，本發(fā)明涉及一種利用Y型探針的臨床診斷方法，該臨床診斷方法包括如下步驟:第一步驟:設(shè)計(jì)Y型探針的步驟；第二步驟:合成Y型探針的步驟；第三步驟:利用Y型 探針來制備DNA微陳列的步驟；第四步驟:準(zhǔn)備要置于微陳列上的核酸檢體，通過PCR或者試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄等方法，將標(biāo)記物質(zhì)(labeling dye)粘在上述核酸檢體的步驟；第五步驟:將檢體置于DNA微陳列，并進(jìn)行雜交反應(yīng)的步驟；第六步驟:在DNA微陳列上進(jìn)行雜交反應(yīng)之后，對其信號進(jìn)行解讀及分析的步驟；第七步驟:利用Y型探針來掌握靶基因及對照基因的存在與否及存在量的步驟；第八步驟:利用Y型探針來進(jìn)行多種基因型分析，并將該Y型探針應(yīng)用于臨床診療的步驟，具體而言，是診斷HPV或流行性感冒及性傳播的病原菌，并且表明其類型，由此決定疾病診斷和治療方針的步驟；第九步驟:利用Y型探針來分析多個(gè)基因的表達(dá)程度的步驟；第十步驟:利用Y型探針來分析特定堿基序列的突變，即SNP或點(diǎn)突變等的步驟；第十一步驟:將Y型探針應(yīng)用于臨床診斷的步驟，具體而言，是通過SNP分析預(yù)測發(fā)病的危險(xiǎn)，來預(yù)先預(yù)防發(fā)病，或者通過SNP分析預(yù)測藥物效果及副作用來對癥選藥，或者通過突變分析及基因表達(dá)分析，篩選(screening)或者診斷疾病，或者預(yù)測藥物效果，對癥選藥的步驟。發(fā)明的效果根據(jù)利用本發(fā)明的Y型探針及其變形型的基因分析用DNA微陳列(芯片)及試劑盒，都能準(zhǔn)確地分析特定基因的存在及其類型，以及表達(dá)程度和堿基序列的變化，進(jìn)而不僅能夠快速而準(zhǔn)確地診斷感染和癌癥等各種疾病，還能分類病癥，預(yù)測嚴(yán)重度和預(yù)后，決定治療方針，對癥下藥等，由此十分有用于臨床診療。


圖1是表示本發(fā)明的Y型探針的一例的示意圖。圖2是用于將本發(fā)明的Y型探針與芯片表面相結(jié)合的反應(yīng)物質(zhì)iAmMC6T( internalAmino Modifier C6 dT)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖3是通過PCR使作為宮頸癌誘因病毒(HPV)的人β珠蛋白(human betaglobin;HBB)基因擴(kuò)增來對其進(jìn)行電泳的照片(實(shí)施例5)。圖3是用Cy5來標(biāo)記HPV-16L1基因，用Cy3來標(biāo)記HBB基因，在人工晶癌細(xì)胞(0&^)的細(xì)胞株(即￥_16型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì))中通過公知的方法提取DNA，利用表I的LI基因和HBB基因各自的引物來執(zhí)行PCR，在0.8%瓊脂糖凝膠執(zhí)行電泳的結(jié)果。道(Lane)M:100bp尺寸標(biāo)記，道1:陰性對照組，道2:HPV_16L1基因的PCR產(chǎn)物(185bp)，道3:HBB基因的PCR產(chǎn)物(102bp)。圖4是可診斷宮頸 癌誘因病毒(HPV)的DNA生物芯片的各加樣孔(well)內(nèi)所出現(xiàn)的方格(grid)(實(shí)施例4)。紅色部分是在HPV中間點(diǎn)樣高危型的部分，綠色部分是在HPV中間點(diǎn)樣低危型的部分，黃色部分是點(diǎn)樣HBB基因的部分，藍(lán)色部分是在本發(fā)明的Y型探針中間點(diǎn)樣一個(gè)YP16S和YP16AS的部分。圖5是在利用圖4的方格來制備的22種的HPV芯片上同時(shí)點(diǎn)樣本發(fā)明的Y型探針，并利用HPV-16 (Cy5標(biāo)記)和HBB (Cy3標(biāo)記)來雜交之后的掃描圖片(實(shí)施例5)。孔板(Well) l&2:HPV16-Cy5&HBB-Cy5 標(biāo)記的檢體、孔板(Well) 3&4:HBB_Cy5 標(biāo)記的檢體、孔板(Well) 5&6:HPV16-Cy5&HBB的正向引物上用Cy3來標(biāo)記的檢體、孔板(Well)7&8:HPV16-Cy5&HBB的反向引物上用Cy3來標(biāo)記的檢體。圖6是在利用HBB正向_Cy3PCR產(chǎn)物來雜交的芯片中，在532nm下僅對一個(gè)加樣孔進(jìn)行掃描的圖片(實(shí)施例6)。圖7是在3%瓊脂糖凝，對利用STD芯片用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)來執(zhí)行PCR的產(chǎn)物進(jìn)行電泳的圖片。M:100bp DNA尺寸標(biāo)記，道(Lanel)至6經(jīng)過單一PCR，并分別表示為杜克雷嗜血桿菌的PCR產(chǎn)物(440bp )、皰疹病毒I型的PCR產(chǎn)物(384bp )、皰疹病毒2型的PCR產(chǎn)物(400bp )、沙眼衣原體的PCR產(chǎn)物(32Ibp)、淋球菌的PCR產(chǎn)物(284bp)以及梅毒的PCR產(chǎn)物(260bp)，道7是使用上述5個(gè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并通過實(shí)施例9的方法執(zhí)行多重PCR的產(chǎn)物，可確認(rèn)5個(gè)基因均實(shí)現(xiàn)PCR。圖8是在利用Y型探針的STD芯片上，對用陽性物質(zhì)來使淋球菌雜交的結(jié)果進(jìn)行掃描的圖片(實(shí)施例9)。圖9是在利用Y型探針的STD芯片上，對用陽性物質(zhì)來使沙眼衣原體雜交的結(jié)果進(jìn)行掃描的圖片(實(shí)施例9)。圖10是在利用Y型探針的STD芯片上，對用陽性物質(zhì)使梅毒螺旋體雜交的結(jié)果進(jìn)行掃描的圖片(實(shí)施例9)。圖11是在利用Y型探針的STD芯片上，對用陽性物質(zhì)使杜克雷嗜血桿菌雜交的結(jié)果進(jìn)行掃描的圖片(實(shí)施例9)。圖12是在利用Y型探針的STD芯片上，對用陽性物質(zhì)使單純性皰疹病毒雜交的結(jié)果進(jìn)行掃描的圖片(實(shí)施例9)。圖13表示利用Y型探針的A型流感病毒芯片的方格(實(shí)施例10)。圖14是對用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)使A型流感病毒芯片雜交的結(jié)果進(jìn)行掃描的圖片(實(shí)施例10)。H基因由Cy5來標(biāo)記，N基因由Cy3來標(biāo)記，RPP、SWH1、SW infA及infA均由Cy5來標(biāo)記。第一圖片是利用本發(fā)明的Y型探針，在532nm和635nm下掃描的圖片,豬(swine)流行性感冒(HlNl)的病毒僅在本發(fā)明芯片的HlNl、HlONl、infA、RPP、swHl及swinfA的點(diǎn)上表示信號，在第二波長635nm下僅表示NI基因的信號，在第三波長532nm下，僅在HlNl、infA、RPP、swHl及swinfA的點(diǎn)上表示信號。因此，證明了本發(fā)明的芯片中所使用的Y型探針分別與豬流行性感冒病毒基因進(jìn)行雜交。圖15a是利用拖慢(TaqMan)探針，均對各個(gè)RnaseP、SffHU Sff infA及infA基因進(jìn)行一步法實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(One step Real time RT-PCR)之后,使用轉(zhuǎn)子基因(rotor gene) 6.0軟件來分析的結(jié)果。使用從陰性對照組(nc, negative control)、陽性對照組(pc, positive control ;新型流行性感冒陽性病毒的RNA)及患者的檢體提取的RNA，來執(zhí)行實(shí)時(shí)RT-PCR，由此確認(rèn)，患者的三個(gè)檢體僅在RnaseP中被檢測而呈陰性，陽性對照組中的SWHl、Sff infA、infA和RNaseP基因均得到擴(kuò)增。圖15b是利用拖慢(TaqMan)探針，并通過7個(gè)臨床檢體僅分析各個(gè)RNaseP和SWHl基因的結(jié)果。7個(gè)檢體當(dāng)中，只有兩個(gè)檢體從SWHl和RNaseP中被檢測且呈陽性，剩余的4個(gè)檢體的基因當(dāng)中，只有RNaseP基因均得到擴(kuò)增，因此呈陰性，一個(gè)檢體連RNaseP基因也得不到擴(kuò)增，因此進(jìn)行復(fù)檢。圖16是在2%瓊脂糖凝膠,對通過執(zhí)行實(shí)時(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real timeRT-PCR)而獲得的結(jié)果中的RNase P基因和SWHl基因的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳的圖片。由本圖片所確認(rèn)，對于實(shí)際檢體來說，由于僅靠PCR產(chǎn)物的大小，在電泳難以區(qū)分陽性和陰性，因而HlNl需要執(zhí)行通過使用本發(fā)明的DNA芯片或?qū)崟r(shí)反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RealtimeRT-PCR)方法來確認(rèn)的檢測。M:100bp DNA尺寸標(biāo)記、N:陰性對照組(Negative control)、道(Lane) I至6:利用患者的檢體來獲得的PCR產(chǎn)物、cDNA:新型流行性感冒陽性物質(zhì)的cDNA。圖17是表示本發(fā)明的基因表達(dá)檢測用Y型探針的基本結(jié)構(gòu)和在點(diǎn)樣該基本結(jié)構(gòu)的微陳列上，對檢體和對照物質(zhì)的cRNA進(jìn)行雜交的示意圖。圖18是表示利用Y型探針來分析基因表達(dá)時(shí)的外部對照物質(zhì)的示意圖。具體地表示，實(shí)施例11所使用的T7啟動(dòng)子和包含多聚A尾巴、大腸桿菌motD基因的合成寡核苷酸(A)及質(zhì)粒(B)序列。將這些用作模板(templ`ate),加入Cy_5,進(jìn)行試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄,制作用熒光標(biāo)記的靶之后，與從檢體中獲得的cRNA混合而用于在DNA微陳列上執(zhí)行的雜交反應(yīng)。圖19是從正常人和患者的檢體中提取RNA之后合成cDNA，通過Y型探針微陳列來分析EGFR基因和β-肌動(dòng)蛋白基因的表達(dá)的圖片(實(shí)施例11)。圖20是從正常人和患者的檢體中提取RNA之后合成cDNA，通過qRT_PCR來分析EGFR基因和β-肌動(dòng)蛋白基因的表達(dá)的結(jié)果(實(shí)施例11)。由此可知，肌動(dòng)蛋白基因的Ct值在兩個(gè)檢體之間未出現(xiàn)差異，EGFR基因在患者身上可以表達(dá)，但在正常人身上無法表達(dá)。圖21表示利用包含Y型探針的SNP基因型芯片來檢測基因的結(jié)果，圖21是利用雙色(dual color)熒光掃描機(jī)的圖片。在各點(diǎn)上去除本底信號之后，勘察Cy_5對比Cy_3的經(jīng)過正態(tài)化處理的信號(normalized signal),據(jù)此尋出完全一致的點(diǎn)的探針,其結(jié)果，呈現(xiàn)對CFH、CETP及MTHFR基因不利的(unfavorable, high risk) SNP。即，與用各基因的Cy3來標(biāo)記的PCR反應(yīng)物質(zhì)進(jìn)行雜交而產(chǎn)生的報(bào)道基因有SNP的情況下，掃描時(shí)用綠色來表示，與用Cy5來標(biāo)記的PCR反應(yīng)物質(zhì)雜交而產(chǎn)生的參比基因是沒有SNP的部分，因此掃描時(shí)經(jīng)常用紅色來表示。因此，對于在一個(gè)基因中的Y型探針來說，當(dāng)各基因沒有SNP部分時(shí)，均用Cy5來表示，當(dāng)具有SNP部分時(shí)，用互補(bǔ)色來表示。因此，本檢體中，在補(bǔ)體因子(CFH, Complement factor H)基因的第 402 密碼子出現(xiàn)了 SNP (Y402H, rsl061170)，在膽固醇酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(CETP,Cholesterol ester transporter protein)基因的第 1553 喊基出現(xiàn)了 SNP (G1533A)。并且,在亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR, Methylene tetrahydrofolatereductase)的第 677 次堿基分別表示 SNP (C677T, Ala222Val)。圖22是表示對于K-ras基因的第12密碼子的GTT (Gly)和AGT (Ser)的d型探針的結(jié)構(gòu)的示意圖。圖23是K-ras DNA微陳列的掃描圖片。分析肺癌患者的血液檢體的結(jié)果表明，K-ras基因的第12密碼子由GTT突變?yōu)锳GT (Glyl2Ser)。
具體實(shí)施例方式以下，通過實(shí)施例更詳細(xì)地說明本發(fā)明。然而，以下實(shí)施例只是用于證明本發(fā)明的結(jié)構(gòu)及效果的一例，而不表示本發(fā) 明局限于以下實(shí)施例。實(shí)施例1:Y型探針的設(shè)計(jì)對DNA芯片開發(fā)起到最重要作用的過程是研制本發(fā)明的Y字形態(tài)的雙重寡核苷酸探針的結(jié)構(gòu)。其中，包括如下工序:粘貼用于將該探針置于固相載體(solidsupport, features)的連接肽的工序；粘貼間隔(spacer),為了察看信號，粘貼標(biāo)記物質(zhì)(labeling dye)的工序。本發(fā)明的Y型探針是連續(xù)的一個(gè)寡核苷酸，并呈以Y字形樹枝形態(tài)，將兩個(gè)不同的寡核苷酸探針置于莖區(qū)上的類似于樹的結(jié)構(gòu)。如同將該樹種在地上的根部，即為將上述探針置于載玻片等固定載體的部分叫做連接肽或者間隔。檢體像雪一樣掉落在該樹上，對于該檢體來說，如果具有與樹的兩支的探針互補(bǔ)的序列的DNA或者RNA選擇性地相結(jié)合，則發(fā)生雜交反應(yīng)，剩余的雪(檢體)將被洗去。在該雜交反應(yīng)粘貼標(biāo)記物質(zhì)(labeling dye)來解讀其信號。本發(fā)明的Y型探針與文獻(xiàn)中揭示的所謂分子信標(biāo)(molecular beacon)或者發(fā)卡探針(hairpin probe)不同，即在結(jié)構(gòu)上沒有所謂環(huán)(loop)部分，而且也不使用粹滅探針(quencher probe)。(Wang K, Tang Z, Yang CJ, Kim Y, Fang X, Li ff, Wu Y, MedleyCD，Cao Z and Li J.Molecular engineering of DNA:Molecular beacon.Angew ChemInt Ed Engl.2009;48 (45):856-870;Li Y，Zhou X and Ye D.Molecular beacons:anoptimal multifunctional biological role.Biochemical and Biophysical ResearchCommunincation.2008;373:457—461;Yao GY and Tan W.Molecular-beacon-basedarray for sensitive DNA analysis.Anakytical Biichemistry.2004;331:216-223;Broude NE.Stem-1oop oligonucleotides:a robust tool for molecular biology andbiotechnology.Trends in Biotechnology.2002; 20 (6): 249-256)。因此，是個(gè)與信標(biāo)完全不同的探針。而且，在結(jié)構(gòu)或者作用方法上，與其他文獻(xiàn)中揭示的信標(biāo)變形的探針完全不同(Tsourkas A，Behlke MA and Bao G.Structure-function relationship ofshared stem and conventional molecular beacons.Nucleic Acids Research.2002;30( 19): 4208-4215;Misra A，Kumar P and Gupta KC.Design and Synthesis ofhairpin probe for specific mis—match discrimination.Nucleic Acids SymposiumSeries.2007;51:311-312;Riccelli RVjMerante F，Leung KTjBortolin S，ZastawnyRLj Janeczko R and Benight AS.Nucleic Acid Research.2001;29 (4):996-1004)。如圖1所示，本發(fā)明的Y型探針從5’ 一3’方向來看，并且從左側(cè)上方開始向右側(cè)上方時(shí)，由(I)左側(cè)探針部位(left side probe, A部位)、(2)左側(cè)莖區(qū)部位(left sidestem, B部位)、(3)連接肽至間隔部位(C部位)、(4)右側(cè)莖區(qū)部位(right side stem, D部位)以及(5)右側(cè)探針部位(right side probe, E部位)構(gòu)成。以下，更詳細(xì)的說明各部位的結(jié)構(gòu)如下。(I)莖區(qū)部位(stem part)為了適當(dāng)定位本發(fā)明的Y型探針，優(yōu)先適當(dāng)?shù)刂苽溆糜谥卧揧型探針的莖部分。莖成為由具有互補(bǔ)性的序列的寡核苷酸結(jié)合的結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地，為了堅(jiān)固地結(jié)合，C-G堿基需占一半以上，在C-G堿基之間插入T或者A堿基。例如，GnTGmTGo的形態(tài)。雖然可以采用多種堿基序列的結(jié)構(gòu)，但優(yōu)選的是生體內(nèi)自然存在。在有核生物的染色體的末端存在由反復(fù)的堿基序列構(gòu)成的端粒(telomere)，就人等哺乳類而言，其序列呈現(xiàn)反復(fù)了 TTAGGG或TTTAGGG或T1-3 (T/A) G3-的結(jié)構(gòu)，就其他生物而言，其序列呈現(xiàn)反復(fù)了TTGGGG或TTTTGGGG的結(jié)構(gòu)。在免疫球蛋白的開關(guān)部位(switch portion)上也出現(xiàn)類似的結(jié)構(gòu)(Balagurumoothy P, Brahmachari SK, Mohnaty D, Bansal M and SasisekharanV.Hairpin and parallel quartet structures for telomeric sequences.Nucleic AcidsResearch.1992;20 (15):4061-4067;Balagurumoothy P and Brahmachari SK.Structureand stability of human telomeric sequence.Journal of Biochemistry.1994;269
(34):21858-21869)0優(yōu)選地，發(fā)明的莖部位成為在其一側(cè)的鏈上反復(fù)以下的堿基一次或兩次以上的結(jié)構(gòu)。例)1.TTGGG`2.TAGGG3.TTGGGG4.TTTGGG5.TTAGGG6.TTTGGGG7.TTTAGGG8.TTTTGGGG9.TTTAGGGGS卩，最短為5個(gè)至9個(gè)的寡核苷酸互補(bǔ)結(jié)合，并可以延長其長短。當(dāng)考慮到經(jīng)濟(jì)費(fèi)用和效率時(shí)，如果利用由TTAGGG-AATCCC的堿基序列形成的人體的端粒的最小單位就很簡便。但是，其長度可以不受限制地變形。通常，只要是C6、C12或者C18就無妨。(2)左側(cè)及右側(cè)探針部分其中，寡核苷酸探針設(shè)計(jì)成與要檢測的靶基因互補(bǔ)，并且可以采用任何堿基序列。但是，必須適當(dāng)設(shè)計(jì)左側(cè)及右側(cè)探針的寡核苷酸的堿基序列和長度。需要注意的是，選擇探針的優(yōu)選的基本原則在于，左側(cè)和右側(cè)的寡核苷酸相互具有互補(bǔ)性，而防止左側(cè)和右側(cè)的寡核苷酸相結(jié)合，并且，防止各自構(gòu)成二次結(jié)構(gòu)。在Y型探針的設(shè)計(jì)中，另一個(gè)重要的是方向。左側(cè)探針(A部位)包含反向的3’ 一5’順序的序列，右側(cè)探針(E部位)需要構(gòu)成正向的5’ 一3’順序的序列。左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位的長度，通常是優(yōu)選為15bp至75bp左右，根據(jù)用途，可以是延長到150bp左右，或者相反地還可縮短為小于15bp。各探針的準(zhǔn)確的長度隨著如何決定實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、靶基因的結(jié)構(gòu)及堿基序列上的特征、檢測的靈敏度和特異度、再現(xiàn)性、噪聲、偏壓(bias)而不同。當(dāng)要提高特異度時(shí),通常使用最短為15bp至25bp的寡核苷酸。當(dāng)著重于靈敏度時(shí)，通常 使用最長為40bp至70bp的寡核苷酸。當(dāng)為了 SNP或突變而要進(jìn)行等位基因特意雜交分析時(shí)，探針長度為15個(gè)至22個(gè)左右，研制能夠識別其中心部的I個(gè)堿基或者兩三個(gè)堿基之差。當(dāng)檢體為相對于特定基因的PCR產(chǎn)物，在其產(chǎn)物尋出特定堿基序列的存在而要分析基因型時(shí)，例如，當(dāng)要分析病毒或細(xì)菌感染的準(zhǔn)確的種和亞種的基因型時(shí)，將探針長度為20個(gè)左右，尤其選擇3堿基以上在中心部出現(xiàn)差異。根據(jù)序列存在不能使用的喊基。左側(cè)和右側(cè)的探針長度無需相互對稱，根據(jù)目的和用途，左側(cè)探針的長度極端的變短，如圖22所示，也可成為d字形。并且，右側(cè)的探針極端的變短，還可成為b字形。寡核苷酸探針的堿基序列及長度的決定參照公知的方法即可。即，在要檢測的靶基因的部位中，需要選擇與非祀向(non-targeting)基因互補(bǔ)性最小的特異部位。接著，探針應(yīng)設(shè)計(jì)成，通過調(diào)整雜交溫度，使探針的熔解溫度(Tm)的范圍在適當(dāng)范圍內(nèi)。此時(shí)，當(dāng)然要加入C+G的百分比和探針長度來計(jì)算。防止構(gòu)成二次結(jié)構(gòu)，優(yōu)選地分析自我折疊能源(self folding energy)。通常使用的方法是，以滑動(dòng)窗口(sliding window)方式提取候補(bǔ)探針集合之后，基于該候補(bǔ)組，除了與對象基因進(jìn)行互補(bǔ)結(jié)合以外，考慮多個(gè)條件等來最終選擇最順利發(fā)生雜交的可能性高的探針。還可以通過虛擬雜交模塊(virtualhybridization module)可選定最佳的探針。探針集合設(shè)計(jì)可被視為，尋出發(fā)生雜交的可能性高的序列的最優(yōu)化問題，在這種觀點(diǎn)上，還使用進(jìn)化計(jì)算方法。并且，還使用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)等的學(xué)習(xí)方法(David P.Kreil, Roslin R.Russell and Steven Russell.Microarray Oligonucleotide Probes.Methods in Enzymology2006;410:73-98;Lemoline S, Combes F and Le Crom S.An evaluation of custom microarray application:theoligonucleotide design challenge.Nucleic Acids Research.2009;37(6):1726-1739)。簡便的方法使用被商業(yè)化而在市場售賣的寡核苷酸探針設(shè)計(jì)程序。例如，ArrayOligoSeIector、CommOligo、HPD、Mprime、01iD、01igoArray、OLigodb、OLigoFaktory、OLigoPicker、POligoWiz、Oliz、Ospery、PICKY、PROBEmer> Probesel> ProbeSelect、R0S0、SEPON及YODA等。這些大部分提供交叉雜交(cross hybridization)分析、適當(dāng)探針的數(shù)分析、避免所謂的低復(fù)雜度區(qū)(low complexity zone)、方向設(shè)定等必要的基本信息。(Bozdech Z, Zhu J, Joachimiak MP, Cohen FE, Pulliam B, DeRisi JL.Expression profiling of the schizont and trophozoite stages of Plasmodiumfalciparum with a 1ng-oligonucleotide microarray.Genome Biol.2003;4:R9;LiX, He Z,Zhou J.Selection of optimal oligonucleotide probes for microarraysusing multiple criteria, global alignment and parameter estimation.NucleicAcids Res.2005;33:6114-6123;Rimour S, Hill D, Militon C, Peyret P.GoArrays:highlydynamic and efficient microarray probe design.Bioinformatics.2005;21:1094-1103;Chung WH, Rhee SK, Wan XF, Bae JW, Quan ZX, Park YH.Design of long oligonucleotideprobes for functional gene detection in a microbial community.Bioinformatics.2005;21:4092-4100;Rouchka EC, Khalyfa A, Cooper NG.MPrime: efficient
權(quán)利要求
1.一種Y字形的核苷酸探針，其特征在于，在一個(gè)本體具有兩個(gè)探針部位。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針，其特征在于，上述探針向5’一3’的方向以及從左側(cè)上方朝向右側(cè)上方的方向，依次由(I)左側(cè)探針部位、(2)左側(cè)莖區(qū)部位、(3)連接肽部位、(4)右側(cè)莖區(qū)部位以及(5)右側(cè)探針部位形成。
3.一種d字形的核苷酸探針，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針的(I)左側(cè)探針部位被去除，由(2)左側(cè)莖區(qū)部位、(3)連接肽部位、(4)右側(cè)莖區(qū)部位及(5)右側(cè)探針部位形成。
4.一種b字形的核苷酸探針，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求2所述的探針的(5)右側(cè)探針部位被去除，由(I)左側(cè)探針部位、(2)左側(cè)莖區(qū)部位、(3)連接肽部位及(4)右側(cè)莖區(qū)部位形成。
5.根據(jù)權(quán)利要求2至4中的任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于， 上述左側(cè)莖區(qū)部位和右側(cè)莖區(qū)部位呈現(xiàn)由具有互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸來相結(jié)合的結(jié)構(gòu)； 上述左側(cè)莖區(qū)部位或者右側(cè)莖區(qū)部位，在分別相對于左側(cè)莖區(qū)部位或者右側(cè)莖區(qū)部位的整體喊基序列中，包含一半以上的G喊基。
6.根據(jù)權(quán)利要求2至4中的任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于， 上述左側(cè)莖區(qū)部位和右側(cè)莖區(qū)部位呈現(xiàn)由具有互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸來相結(jié)合的結(jié)構(gòu)； 莖區(qū)部位的喊基序列包含端 粒的喊基序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的探針，其特征在于，上述左側(cè)莖區(qū)部位或者右側(cè)莖區(qū)部位，由堿基單體反復(fù)一次以上而形成，上述堿基單體選自包含以下的堿基單體的組中:TTGGG、TAGGG、TTGGGG、TTTGGG、TTAGGG、TTTGGGG、TTTAGGG、TTTTGGGG、TTTAGGGG。
8.根據(jù)權(quán)利要求2至4中的任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于，上述左側(cè)探針部位或者右側(cè)探針部位是具有與靶基因互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求2至4中的任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于，上述左側(cè)探針部位或者右側(cè)探針部位是具有15個(gè)至150個(gè)的堿基序列的寡核苷酸。
10.根據(jù)權(quán)利要求2至4中的任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于， 就上述左側(cè)探針部位而言，從上方到下方的堿基序列以5’ 一3’的順序排列； 就上述右側(cè)探針部位而言，從下方到上方的堿基序列以5’ 一3’的順序排列。
11.根據(jù)權(quán)利要求2至4中的任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于，上述連接肽部位為了與包被醛固相載體相結(jié)合，由作為氨基改性雙脫氧胸苷的C6dT、C3dT、C12dT或者C18dT形成。
12.根據(jù)權(quán)利要求1至4中的任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于，上述探針由肽核酸(PNA)形成。
13.根據(jù)權(quán)利要求1至4中的任一項(xiàng)所述的探針，其特征在于， 上述探針通過合成方法來制備而得，該合成方法包括以下步驟: 1)脫除三苯甲基步驟； 2)偶聯(lián)步驟； 3)加帽步驟；以及 4)氧化步驟。
14. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的探針，其特征在于，上述左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位分別由寡核苷酸形成，該寡核苷酸具有分別與一個(gè)靶基因內(nèi)的兩個(gè)相互不同的部位互補(bǔ)的堿基序列。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的探針，其特征在于，上述左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位分別由寡核苷酸形成，該寡核苷酸具有與一個(gè)靶基因內(nèi)的相同的部位互補(bǔ)的堿基序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的探針，其特征在于，上述左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位分別由寡核苷酸形成，該寡核苷酸具有分別與相互不同的靶基因互補(bǔ)的堿基序列。
17.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的探針，其特征在于， 上述左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位中的一側(cè)探針部位由具有與祀基因互補(bǔ)的喊基序列的寡核苷酸形成； 剩余的一側(cè)探針部位由具有與對照基因互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸形成。
18.根據(jù)權(quán)利要求17所述的探針，其特征在于，上述對照基因不與靶基因具有互補(bǔ)性，并且在檢體中不存在或者表達(dá)。
19.根據(jù)權(quán)利要求17所述的探針，其特征在于，上述對照基因是大腸桿菌的motD基因。
20.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的探針，其特征在于，上述探針是具有序列號5至序列號50中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸。
21.一種DNA微陳列，其特征在于，根據(jù)權(quán)利要求1至4中的任一項(xiàng)所述的探針在固相載體進(jìn)行點(diǎn)樣而形成。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，上述固相載體選自包含載玻片、玻珠、微型孔板、硅晶片及尼龍膜的組中。
23.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，上述DNA微陳列還點(diǎn)樣了人β—珠蛋白基因。
24.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，作為上述探針的點(diǎn)樣部位的加樣孔劃分為8個(gè)。
25.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，上述探針由具有序列號5至序列號50中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于HPV的檢測及基因型分析。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的DNA微陳列，其特征在于，上述探針與具有5’末端由Cy5來標(biāo)記的序列號4的堿基序列的寡核苷酸引物和5’末端由Cy3來標(biāo)記的序列號I的堿基序列的寡核苷酸引物互補(bǔ)地相結(jié)合。
27.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，上述探針由具有序列號51至序列號55中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于作為性傳播疾病(STD)的病原菌的檢測以及基因型分析，上述病原菌分別為淋球菌(NG)、沙眼衣原體(CT)、單純性皰疹病毒(HSV)、梅毒螺旋體(TP )及杜克雷嗜血桿菌(HD )。
28.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，上述探針由具有序列號56至序列號199中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于A型流感病毒的檢測以及基因型分析。
29.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，上述探針由具有序列號212至序列號213的堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于β_肌動(dòng)蛋白和表皮生長因子受體(EGFR)基因的表達(dá)分析。
30.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，就上述探針而言，左側(cè)探針部位和右側(cè)探針部位中的某一側(cè)由與靶核酸的有義鏈的單核苷酸多態(tài)性(SNP)部位互補(bǔ)的寡核苷酸形成，剩余的一側(cè)由與不具有靶核酸的反義鏈的SNP部位的部位互補(bǔ)的寡核苷酸形成，上述探針用于SNP分析。
31.根據(jù)權(quán)利要求30所述的DNA微陳列，其特征在于，上述探針由序列號220至序列號239中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于ACE、ADRB2、Apo E、CETP、CFH、ESR1、ILIA、MTHFR或者NOS3基因的SNP分析。
32.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于，上述探針由序列號258至序列號272中的一個(gè)以上堿基序列的寡核苷酸形成，并且用于K-ras基因的突變分析。
33.根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列，其特征在于， 上述d字形探針的右側(cè)探針部位由具有與A、C、G或者T的點(diǎn)突變互補(bǔ)的堿基序列的寡核苷酸形成； 此時(shí)，將與點(diǎn)突變互補(bǔ)的堿基位于右側(cè)探針部位的中心部位； 右側(cè)探針部位的長度為15bp至30bp，上述d字形探針用于點(diǎn)突變分析。
34.一種檢體的基因分析用試劑盒，其特征在于， 包含: 根據(jù)權(quán)利要求21所述的DNA微陳列； 針對檢體的靶基因的PCR反應(yīng)用引物對； 緩沖液；以及 雜交反應(yīng)用緩沖液。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑 盒，其特征在于，上述PCR反應(yīng)用引物對用于A型流感病毒的基因擴(kuò)增，上述PCR反應(yīng)用引物對是具有選自序列號208至序列號211中的堿基序列的寡核苷酸。
36.根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其特征在于，上述PCR反應(yīng)用引物對用于β-肌動(dòng)蛋白和EGFR基因的定量型實(shí)時(shí)PCR，上述PCR反應(yīng)用引物對分別是具有序列號214及序列號215、序列號217及序列號218的堿基序列的寡核苷酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其特征在于，上述PCR反應(yīng)用引物對用于SNP檢測，上述PCR反應(yīng)用引物對是具有選自序列號240至序列號257中的兩個(gè)以上喊基序列的寡核苷酸。
38.根據(jù)權(quán)利要求34所述的試劑盒，其特征在于，上述試劑盒用于疾病的診斷、預(yù)防、預(yù)測或者對癥治療。
39.一種基因分析方法，其特征在于，包括在權(quán)利要求21的DNA微陳列上放置用標(biāo)記物質(zhì)來標(biāo)記的檢體的靶核酸，并對上述探針和靶核酸進(jìn)行雜交的步驟。
40.根據(jù)權(quán)利要求39所述的基因分析方法，其特征在于，上述標(biāo)記物質(zhì)是選自包含Cy3、Cy5、Cy5.5、氣砸突、Alexa 488> Alexa 532> Alexa 546> Alexa 568> Alexa 594> Alexa660、羅丹明、TAMRA, FAM、FITC、Fluor X、R0X、德克薩斯紅、橙青 488X、橙青 514X、HEX、TET、JOE、牡蠣 556、牡蠣 645、氟硼熒 630/650、氟硼熒 650/665、Calf Iuor Orange 546、Calfluorred 610, Quasar 670及生物素的組中的一個(gè)以上的標(biāo)記物質(zhì)。
41.根據(jù)權(quán)利要求39所述的基因分析方法，其特征在于，上述靶核酸通過PCR、RT-PCR或者試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄方法，用標(biāo)記物質(zhì)來標(biāo)記。
42.根據(jù)權(quán)利要求39所述的基因分析方法，其特征在于，還包括如下步驟: 經(jīng)過上述雜交反應(yīng)之后，利用熒光掃描機(jī)來分析標(biāo)記物質(zhì)的信號，來勘察靶核酸的表達(dá)程度。
43.根據(jù)權(quán)利要求42所述的基因分析方法，其特征在于，上述信號分析是通過正態(tài)化過程來進(jìn)行的。
44.根據(jù)權(quán)利要求43所述的基因分析方法，其特征在于，上述正態(tài)化過程是在各點(diǎn)上除外本底的噪聲信號，來勘察Cy5和Cy3的信號，重新與作為持家基因的β_肌動(dòng)蛋白基因的Cy3信號進(jìn)行比較的三重正態(tài)化過程。
45.根據(jù)權(quán)利要求39所述的基因分析方法，其特征在于，上述靶核酸選自包含DNA、RNA、cDNA 及 cRNA 的組中。
46.根據(jù)權(quán)利要求45所述的基因分析方法，其特征在于， 上述cDNA通過RT-PCT，并用Cy3來標(biāo)記； 上述cRNA通過試管內(nèi)轉(zhuǎn)錄,并用Cy3來標(biāo)記。
47.根據(jù)權(quán)利要求46所述的基因分析方法，其特征在于，在用上述Cy3來標(biāo)記的cDNA或者cRNA上雜交了混合物，該混合物由用Cy5來標(biāo)記的作為外部對照物質(zhì)的大腸桿菌的motD基因混合而成。
全文摘要
本發(fā)明涉及在基因型檢測及分析時(shí)，可通過改善靈敏度、特異度及準(zhǔn)確度來廣泛用于診斷的，在一個(gè)本體內(nèi)具有兩個(gè)探針部位的Y型核苷酸探針(probe)及利用該Y型核苷酸探針(probe)的DNA微陳列、試劑盒以及基因分析方法。本Y型探針的結(jié)構(gòu)由左側(cè)探針部分、左側(cè)莖區(qū)部分、連接肽(linker)、右側(cè)莖區(qū)部分以及右側(cè)探針部分等五種部位形成。本發(fā)明的DNA微陳列同時(shí)重復(fù)檢索相同的基因，或者同時(shí)檢索不同的兩個(gè)靶基因，由此能夠提高檢測的準(zhǔn)確度。尤其是，在一個(gè)點(diǎn)(spot)同時(shí)檢索靶基因和對照基因，由此在分析時(shí)減少錯(cuò)誤，并可實(shí)現(xiàn)定量分析，還能容易實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。本發(fā)明的Y型探針均可利用于基因型分析、基因表達(dá)分析、突變或者SNP分析，并且可廣泛利用于疾病診斷和預(yù)測、治療決策等基因診斷。
文檔編號G01N33/52GK103097533SQ201080066318
公開日2013年5月8日 申請日期2010年3月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月26日
發(fā)明者文宇哲, 吳明烈 申請人:固德基因公司