專利名稱：呋喃妥因代謝物elisa檢測(cè)試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及檢測(cè)呋喃妥因代謝物殘留量的試劑盒，特別是檢 測(cè)動(dòng)物源性食品中呋喃妥因代謝物殘留量的酶聯(lián)免疫檢測(cè)(ELISA)試劑盒，ELISA(Enzyme Linked ImmunosorbnentAssay)是酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定的簡(jiǎn)稱，它是繼免疫熒光和放射免 疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種酶免技術(shù)。( 二)背景技術(shù)硝基呋喃類藥物因有非常好的抗菌作用和藥動(dòng)力學(xué)的特性，曾經(jīng) 被廣泛應(yīng)用，作為禽類、水產(chǎn)和豬促生長(zhǎng)的添加劑。但在長(zhǎng)時(shí)間的實(shí)驗(yàn)研究過程中發(fā)現(xiàn)，硝 基呋喃類藥物和代謝物均可以使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物發(fā)生癌變和基因突變，正因?yàn)槿绱瞬艑?dǎo)致此類藥 物禁止在治療和飼料中使用。呋喃妥因在1995年被禁用。由于硝基呋喃類藥物在體內(nèi)很快就能被代謝，而在組織中結(jié)合的代謝產(chǎn)物則能存 留較長(zhǎng)的一段時(shí)間，所以在分析此類藥物的殘留時(shí)經(jīng)常要分析其代謝后的產(chǎn)物，管理部門 就以檢測(cè)代謝產(chǎn)物為手段達(dá)到檢測(cè)硝基呋喃類殘留的目的。呋喃妥因代謝產(chǎn)物AHD ；呋喃 它酮代謝產(chǎn)物AMOZ ；呋喃唑酮代謝產(chǎn)物AOZ ；硝基糠腙(呋喃西林)代謝產(chǎn)物SEM。用來檢測(cè)呋喃妥因代謝物的最常用方法是LC-UV，LC-MS和LC-MS/MS。酶聯(lián)免疫 方法結(jié)合了色譜技術(shù)，采用AHD衍生物的特異性抗體，具有很高的精確度和靈敏度，較低的 操作技術(shù)要求和短暫的檢測(cè)時(shí)間，檢測(cè)樣本量大等特點(diǎn)在檢測(cè)中很好的表現(xiàn)出來。(三)實(shí)用新型內(nèi)容本實(shí)用新型所要解決的問題是提供一種小巧輕便的呋喃妥 因代謝物殘留量檢測(cè)試劑盒，其操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，成本低，穩(wěn)定性好，需 要的技術(shù)含量不高，可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品中呋喃妥因代謝物殘留量的測(cè)定，減少了檢 測(cè)樣本所需要的時(shí)間。本實(shí)用新型的技術(shù)方案是一種呋喃妥因代謝物ELISA檢測(cè)試劑盒，包括盒體和 盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一張蓋板膜、15瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個(gè)自封袋、一份 說明書和一份質(zhì)檢報(bào)告，其特征在于酶標(biāo)板采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微 孔條上預(yù)包被呋喃妥因代謝物偶聯(lián)抗原制成的檢測(cè)板，15瓶試劑分別為-J瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、 酶標(biāo)二抗、抗體濃縮液、顯色液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液，下凹瓶 位共15個(gè)。酶標(biāo)板由外框支撐架及放置其上的可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個(gè)可拆 裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔，放入真空鋁箔袋中，盒體為硬紙盒，下凹瓶位由塑料泡沫 制成，以塑料硬膜為蓋板膜，蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致，將15瓶試劑用不同大 小、不同顏色的塑料瓶和玻璃瓶盛裝并固定在下凹瓶位中與酶標(biāo)板、蓋板膜、自封袋、說明 書、質(zhì)控報(bào)告一同封裝在硬紙盒內(nèi)，以便攜帶和運(yùn)輸。15瓶試劑分別為7瓶Iml梯度濃度的 標(biāo)準(zhǔn)品溶液、12ml酶標(biāo)二抗、Iml抗體濃縮液、7ml顯色液A液、7ml顯色液B液、7ml終止液、 40ml濃縮洗滌液、50ml濃縮復(fù)溶液、15. Img2_硝基苯甲醛。每一個(gè)試劑盒中的試劑足夠進(jìn) 行96次測(cè)定(包括標(biāo)準(zhǔn)分析孔)，既可進(jìn)行一次連續(xù)多個(gè)樣品的檢測(cè)，也可以將板孔拆開 多次檢測(cè)。將剩下的放回鋁箔袋中用自封袋密封，這樣可以保證試劑盒檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。 檢測(cè)時(shí)，樣本中的呋喃妥因代謝物將和酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被的呋喃妥因代謝物偶聯(lián)抗原 競(jìng)爭(zhēng)抗呋喃妥因代謝物抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與樣本中所含呋喃妥因代謝物的殘留量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得 出樣品中呋喃妥因代謝物殘留量，其操作簡(jiǎn)便易行。經(jīng)實(shí)驗(yàn)表明本試劑盒具有很高的靈敏度，為0. 1 μ g/kg 組織、蜂蜜、牛奶樣本檢 測(cè)下限為0. 2μ g/kg、蝦、魚等水產(chǎn)組織樣本檢測(cè)限為0. 3μ g/kg ；水產(chǎn)、肌肉、肝臟組織 樣本的回收率為75% 士 15% ；蜂蜜樣本的回收率為90% 士 15% ；奶樣的回收率為90% 士 10%。相對(duì)于其他呋喃妥因代謝物檢測(cè)方法，本試劑盒所需儀器較少，只需要酶標(biāo)儀、氮 氣吹干裝置、渦旋儀、離心機(jī)、振蕩機(jī)和微量加樣器等，同類實(shí)驗(yàn)室一般均有配備，所需成本 較低。本實(shí)用新型的有益效果是能快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確地用于呋喃妥因代謝物殘留量的檢測(cè)。


圖1為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的側(cè)面縱剖面圖(長(zhǎng)為8. 55cm)；圖2為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的側(cè)面橫剖面圖(長(zhǎng)為12. 8cm)；圖3為本實(shí)用新型酶聯(lián)板的俯視圖；圖4為本實(shí)用新型蓋板膜平面圖；圖5為本實(shí)用新型試劑瓶縱剖面平面圖；圖6為本實(shí)用新型固定泡沫模具的俯視圖；圖7為本實(shí)用新型盒體與固定泡沫模具的側(cè)視圖。參見附圖酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)預(yù)包被呋喃妥因代謝物偶聯(lián)抗原(3)固定于酶標(biāo) 板的外框支撐架(1)上，酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)可隨要求拆卸；蓋板膜(4)用于酶標(biāo)板置水浴 或恒溫箱內(nèi)反應(yīng)時(shí)封蓋酶標(biāo)反應(yīng)微孔條(2)，蓋板膜大小與酶標(biāo)板橫切面大小一致；透明 帽的半透明PE塑料瓶(5)用于封裝40ml濃縮洗滌液；藍(lán)色帽的半透明PE塑料瓶(5)用 于封裝50ml濃縮復(fù)溶液；白色帽(6)的白色PE塑料瓶(7)用于封裝7ml顯色液A液，紅色 帽(6)的黑色PE塑料瓶(7)用于封裝7ml顯色液B液，黃色帽(6)的白色PE塑料瓶(7) 用于封裝7ml終止液，紅色帽的白色PE塑料瓶(8)用于封裝12ml酶標(biāo)二抗，綠色帽的白色 PE塑料瓶(8)用于封裝7ml呋喃妥因代謝物抗體工作液，白色帽的棕色玻璃試劑瓶(9)用 于封裝Iml/瓶的標(biāo)準(zhǔn)品溶液；泡沫塑料模具(10)有15個(gè)瓶位，放置位置依次為40ml濃 縮洗滌液瓶位(18)，50ml濃縮復(fù)溶液(11)，7ml顯色液A液瓶位(14)，7ml顯色液B液瓶位 (13)，7ml終止液瓶位(12)，Iml呋喃妥因代謝物抗體濃縮液瓶位(16)，12ml酶標(biāo)二抗瓶位 (15)，7個(gè)Iml/瓶各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液和；15. Img 2-硝基苯甲醛瓶位(17)，盒體為(19) 是硬紙盒。
具體實(shí)施方式
樣本的前處理1.配液配液1 衍生化試劑向裝有2-硝基苯甲醛的試劑瓶中加甲醇溶解定容至IOml (濃度為IOmM)。配液2 :C液0. 36M亞硝基鐵氰化鈉(Na2Fe (CN) 5 · NO · 2H20)溶液稱取12. 5g水合亞硝基鐵氰化鈉加去離子水定容至100ml。D液(供奶樣專用)IM硫酸鋅(ZnSO4 · 7H20)溶液稱取29. 8g硫酸鋅用去離子水定容至100ml。配液3 :0. IM磷酸氫二鉀溶液稱取22. 8g三水合磷酸氫二鉀加去離子水定容至1L。配液4: IM鹽酸溶液量取8. 3ml濃鹽酸加去離子水定容至IOOml。配液5: IM氫氧化鈉稱取4. Og氫氧化鈉加去離子水定容至IOOml。配液6:甲醇-水溶液量取甲醇90ml加去離子水IOml混勻。配液7:復(fù)溶工作液用去離子水將2X濃縮復(fù)溶液按1 1體積比進(jìn)行稀釋(1份2X濃縮復(fù)溶液+1 份去離子水)用于提取樣本的復(fù)溶，復(fù)溶工作液在4°C環(huán)境可保存一個(gè)月。配液8 洗滌工作液用去離子水將20X濃縮洗滌液按1 19體積比進(jìn)行稀釋(1份20X濃縮洗滌液 +19份去離子水)用于酶標(biāo)板的洗滌，洗滌工作液在4°C環(huán)境可保存一個(gè)月。2、肌肉、肝臟、水產(chǎn)(魚蝦等)組織前處理方法用均質(zhì)器均質(zhì)樣本，取1. 0士0. 05g的均質(zhì)物至50ml聚苯乙烯離心管中；加入5ml 甲醇-水溶液，用振蕩器振蕩5min，3000g以上離心lOmin，去除全部上清液；(本步驟可 降低樣本基質(zhì)干擾)加入細(xì)1的去離子水，用渦旋儀渦動(dòng)溶解，加入0. 5ml IM鹽酸溶液和 100 μ 1衍生化試劑，用振蕩器充分振蕩；接( 描述方法(標(biāo)*處)。注樣本應(yīng)當(dāng)保存在 陰涼避光之處及冷藏保存。3、牛奶前處理方法取牛奶樣本，3000g以上，10°C離心lOmin，吸除上層脂肪；取出5ml去除脂肪牛奶 樣本至IOml玻璃離心管中；分別加入250 μ 1 C液和250μ1 D液；用振蕩器充分振蕩混合， 3000g以上，4-12°C (39- ° F)離心lOmin。如果沒有恒溫離心機(jī)，則先將樣本降溫至大約 8°C (46° F)，然后離心；取牛奶的離心上清液l.lml(相當(dāng)于Iml奶樣)，分別加入細(xì)1的 去離子水用振蕩器振蕩溶解，0. 5ml IM鹽酸和100 μ 1衍生化試劑，充分振蕩aiiin ；接(5) 描述方法(標(biāo)*處)。4、蜂蜜前處理方法稱取1.0士0.05g蜂蜜至50ml聚苯乙烯離心管中；加入細(xì)1的去離子水，用振蕩 器振蕩至蜂蜜全部溶解；0. 5ml IM鹽酸溶液和100 μ 1衍生化試劑，用振蕩器充分振蕩；接 (5)描述方法(標(biāo)*處)。5、接上面的方法*在37 °C過夜孵育(大約16h)；分別加入5ml 0. IM磷酸氫二鉀溶液、 0. ^illM氫氧化鈉溶液和5ml的乙酸乙酯，用振蕩器劇烈振蕩30s ；3000g以上，室溫 (20-250C/68-77° F)離心IOmin ；取2. 5ml乙酸乙酯相至IOml干燥的玻璃試管中，于50 60°C氮?dú)饬飨麓蹈?；用Iml的正己烷(或正庚烷)用渦旋儀渦動(dòng)30s，再加入Iml復(fù)溶工作液，用渦旋儀渦動(dòng)Imin充分混勻；3000g以上，室溫O0_25°C /68-77° F)離心IOmin ；除去 上層有機(jī)相，取下層水相50 μ 1用于分析。二、使用試劑盒的操作步驟1、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫Q0-25°C )平衡30min以上，注意每種 液體試劑使用前均須搖勻。2、取出需要數(shù)量的微孔板，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2_8°C。3、洗滌工作液在使用前也需回溫。4、編號(hào)將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)應(yīng)微孔按序編號(hào)，每個(gè)樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記 錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。5、加標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣本溶液加標(biāo)準(zhǔn)品工作液/樣本溶液50 μ 1到對(duì)應(yīng)的微孔 中，再加入抗體工作液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置于25°C避光環(huán)境中反 應(yīng) 30min。6、洗板小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用洗滌工作液250 μ 1/孔，充分洗滌 4-5次，每次間隔10s，用吸水紙拍干(拍干后未被清除的氣泡可用未使用過的槍頭戳破)。7、加酶標(biāo)二抗加入酶標(biāo)二抗100 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25°C 避光環(huán)境中反應(yīng)30min，取出重復(fù)洗板步驟6。8、顯色加入底物液A液50 μ 1/孔，再加底物液B液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻， 用蓋板膜蓋板后置25°C避光環(huán)境中反應(yīng)15min。9、測(cè)定加入終止液50 μ 1/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處(建議用雙 波長(zhǎng)450/630nm檢測(cè)，請(qǐng)?jiān)?min內(nèi)讀完數(shù)據(jù))，測(cè)定每孔OD值。(若無酶標(biāo)儀，則不加終止 液用目測(cè)法可進(jìn)行判定)。三、結(jié)果判定結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第1種方法，定量判定用第2種方法。注意樣 本吸光值與呋喃妥因代謝物含量成負(fù)相關(guān)。1、用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出其濃度范圍(yg/L)。例如樣 本1的吸光度值為0. 236，樣本2的吸光度值為0. 666，標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值分別是0 μ g/L 為 1. 949 ；0. 1 μ g/L 為 1. 434 ；0. 3 μ g/L 為· 939 ；0. 9 μ g/L 為 0. 487 ；2. 7 μ g/L 為 0. 157 ； 8. 1 μ g/L為0. 060。則樣本1的濃度范圍是0. 9 μ g/L-2. 7 μ g/L再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù) 即可得出樣本中呋喃妥因代謝物殘留的濃度范圍#本2的濃度范圍是0. 3 μ g/L-0. 9 μ g/ L再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即可得出樣本中呋喃妥因代謝物殘留的濃度范圍。2、定量分析(1)百分吸光率的計(jì)算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸 光度值的平均值(雙孔)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值，再乘以100%，即
B
百分吸光度值(％) = - X 100%
B0B-標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值BO-O μ g/L標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計(jì)算[0064]以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以呋喃妥因代謝物標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μ g/L)的半對(duì)數(shù) 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本 所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中呋喃妥因代謝物實(shí)際含量。四、測(cè)定前的注意事項(xiàng)1、室溫低于20°C或試劑及樣本沒有回到室溫(20-25°C )會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD 值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性 不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。3、每加一種試劑前需將其搖勻。4、反應(yīng)終止液為2M硫酸，避免接觸皮膚。5、不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試 齊U，摻雜使用過了有效期的試劑盒會(huì)引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號(hào)試劑盒中 的試劑。6、儲(chǔ)存條件保存試劑盒于2_8°C，不要冷凍，將不用的酶標(biāo)板微孔板放進(jìn)自封袋重新密封。標(biāo) 準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。7、試劑變質(zhì)的跡象發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度(450/630nm)值 小于0. 5(A450nm < 0. 5)時(shí)，表示試劑可能變質(zhì)。8、在加入底物液A液和底物液B液后，一般顯色10-15min即可。若顏色較淺，可 延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到20min(或更長(zhǎng))，但不得超過30min。反之，則減短反應(yīng)時(shí)間。9、該試劑盒最佳反應(yīng)溫度為25°C，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測(cè)吸光度值和靈敏度 發(fā)生變化。
權(quán)利要求1.一種呋喃妥因代謝物ELISA檢測(cè)試劑盒，包括盒體和盒內(nèi)的一塊96孔的酶標(biāo)板、一 張蓋板膜、15瓶試劑和放試劑的下凹瓶位、一個(gè)自封袋、一份說明書和一份質(zhì)檢報(bào)告，其特 征在于酶標(biāo)板是采用96孔試劑板作為固相載體，在試劑盒微孔條上預(yù)包被呋喃妥因代謝 物偶聯(lián)抗原制成的檢測(cè)板，15瓶試劑分別為-J瓶標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)二抗、抗體濃縮液、顯色 液A液、顯色液B液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液，下凹瓶位共15個(gè)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于盒體是硬紙盒；96孔的聚苯乙烯酶標(biāo) 板，放于真空鋁箔袋內(nèi)；蓋板膜是塑料硬膜；標(biāo)準(zhǔn)品溶液用白色帽的棕色玻璃瓶，酶標(biāo)二抗 用紅色帽的白色PE塑料瓶，抗體工作液用綠色帽的白色PE塑料瓶，顯色液A液用白色帽的 白色PE塑料瓶，顯色液B液用紅色帽的黑色PE塑料瓶，終止液用黃色帽的白色PE塑料瓶， 濃縮洗滌液用透明帽的半透明PE塑料瓶，濃縮復(fù)溶液用藍(lán)色帽的半透明PE塑料瓶，下凹瓶 位由塑料泡沫制成。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于酶標(biāo)板是由外框支撐架及放置其上的 可拆的12條酶標(biāo)反應(yīng)微孔條組成，每個(gè)可拆裝酶標(biāo)反應(yīng)微孔條有8個(gè)反應(yīng)孔；蓋板膜大小 與酶標(biāo)板橫切面大小一致；標(biāo)準(zhǔn)品溶液7瓶，Iml/瓶；酶標(biāo)二抗1瓶，12ml ；抗體濃縮液1 瓶，Iml ；顯色液A液1瓶，7ml ；顯色液B液1瓶，7ml ；終止液1瓶，7ml ；濃縮洗滌液1瓶， 40ml ；濃縮復(fù)溶液1瓶，50ml ；2-硝基苯甲醛1瓶，15. Imgo
專利摘要本實(shí)用新型涉及一種檢測(cè)動(dòng)物源性食品中呋喃妥因代謝物殘留量的酶聯(lián)免疫試劑盒。該試劑盒組成包括96孔酶標(biāo)板、酶標(biāo)二抗、呋喃妥因代謝物抗體濃縮液、7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液、底物顯色液、終止液、濃縮洗滌液、濃縮復(fù)溶液、蓋板膜、自封袋、說明書和質(zhì)檢報(bào)告。采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中含有的呋喃妥因代謝物將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)抗呋喃妥因代謝物抗體，加入酶標(biāo)二抗后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中呋喃妥因代謝物的殘留量。與儀器分析技術(shù)相比具有使用方便、高靈敏度等特點(diǎn)，可在動(dòng)物源性食品中呋喃妥因代謝物的殘留量檢測(cè)中發(fā)揮重要作用。
文檔編號(hào)G01J3/42GK201852833SQ201020586580
公開日2011年6月1日 申請(qǐng)日期2010年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月27日
發(fā)明者何麗霞, 何方洋, 余厚美, 劉福林, 段盈盈, 王建霞, 蒲小容 申請(qǐng)人:北京勤邦生物技術(shù)有限公司