專利名稱：新城疫病毒抗體診斷試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種雞新城疫病毒抗體的診斷試劑盒，屬于動(dòng)物傳染病的診斷技術(shù)領(lǐng) 域。
背景技術(shù)：
雞新城疫(Newcastle Disease, ND)是由副粘病毒科(paramyxovirus)副粘病毒 屬雞新城疫病毒引起的雞的一種急性、高度接觸性傳染病，常呈敗血性經(jīng)過(guò)。主要特征是呼 吸困難、下痢、神經(jīng)紊亂、粘膜和漿膜出血。本病傳播快、死亡率高，被列為第一類嚴(yán)重的傳 染病?；仡櫄v史，新城疫在世界上曾造成過(guò)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。一般認(rèn)為雞新城疫于1926 年首次暴發(fā)于印度尼西亞的爪哇和英國(guó)的紐卡斯?fàn)柊痤D1935年我國(guó)河南首次報(bào)道雞新 城疫，20世紀(jì)50年代本病在全國(guó)各地廣泛流行，本病為高度接觸性傳染性疫病，發(fā)病急，感 染率和死亡率均高，有時(shí)可高達(dá)100%，給養(yǎng)禽業(yè)特別是養(yǎng)雞業(yè)造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失， 因此被國(guó)際獸醫(yī)局定為A類烈性傳染病。新城疫實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)包括常規(guī)的分離鑒定是目前診斷新城疫最確切的方法， 并且可以給感染的毒株定性。血清學(xué)方法有血凝(HA)和血凝抑制實(shí)驗(yàn)(HI)、瓊脂擴(kuò)散實(shí) 驗(yàn)(AGP)、熒光抗體技術(shù)(FA)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、中和試驗(yàn)(NT)、乳膠凝集試驗(yàn) (LAT)、神經(jīng)氨酸酶試驗(yàn)(NIT)、放射免疫試驗(yàn)(RIA)等。其中HA和HI是目前最常用的方 法。分子生物學(xué)方法RNA指紋圖譜巷國(guó)、核酸探針技術(shù)、RT-PCR技術(shù)以及抗多膚抗體技術(shù) 等大量報(bào)道用于NDV檢測(cè)，分子生物學(xué)方法因?yàn)殪`敏度高、性好、能夠區(qū)分強(qiáng)弱毒株，在NDv 的診斷和流行病學(xué)的普查方面頗具潛力。而HI效價(jià)水平的監(jiān)測(cè)對(duì)認(rèn)識(shí)雞群新城疫的免疫水平和確定免疫時(shí)機(jī)有重要的指 導(dǎo)作用，但還必須正確對(duì)待抗體效價(jià)監(jiān)測(cè)的診斷學(xué)意義。趙虎等研究發(fā)現(xiàn)HI效價(jià)在6以 上的個(gè)體仍能感染并排出強(qiáng)毒，究其原因可能是HI抗體水平與ND保護(hù)力兩者之間的不一 致，應(yīng)該看到，HI抗體滴度只是衡量雞抵抗力強(qiáng)弱的一個(gè)比較容易檢測(cè)到的、具有參考價(jià)值 的指標(biāo)，但它只能檢測(cè)到循環(huán)抗體水平(IgG)，而不能檢測(cè)到呼吸道的抗體水平(IgA)，所 以它不是一個(gè)絕對(duì)安全的指標(biāo)。在生產(chǎn)中，HI抗體水平的監(jiān)測(cè)結(jié)果只能是作為參考，千萬(wàn) 不能認(rèn)為HI抗體水平高，ND就不會(huì)發(fā)生。選用ND抗體檢測(cè)的常規(guī)血清技術(shù)對(duì)于了解免疫 效果，制定免疫程序和診斷，防治該病具有十分重要的意義。雖然HI法用于檢測(cè)ND抗體至 今仍被廣泛使用，但是由于ELISA具有快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)，加之酶標(biāo)讀數(shù)儀一體化技 術(shù)在ELISA中的應(yīng)用，使其更加完善，ELISA已越來(lái)越多的被實(shí)驗(yàn)室采用。鑒于新城疫對(duì) 養(yǎng)禽業(yè)的危害，控制新城疫具有重大的經(jīng)濟(jì)意義。免疫接種已成為控制新城疫最主要的手 段，但免疫雞群卻依然經(jīng)常發(fā)生新城疫，其中最主要原因是免疫程序不合理、缺乏免疫抗體 監(jiān)測(cè)條件，不能根據(jù)疫情和疫區(qū)發(fā)病特點(diǎn)適時(shí)調(diào)整免疫程序。合理的免疫程序的制定、良好 的抗體監(jiān)測(cè)是目前預(yù)防和控制雞新城疫最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)，這有賴于敏感、特異、快速的抗體檢 測(cè)技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種新城疫病毒抗體診斷試劑盒。為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案采用了 一種雞新城疫病毒抗體診斷試劑 盒，包括10倍濃縮洗滌液，血清稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)血清，抗雞IgG酶標(biāo)抗體，酶標(biāo)抗體稀釋液，顯 色劑A，顯色劑B和終止液。所述的濃縮洗滌液為PBST，其含0. 05%Tween-20的PBS溶液。所述的血清稀釋液為1 %的BSA溶液。所述的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為用LaSota疫苗株免疫后得到完全保護(hù)的雞血清，標(biāo)準(zhǔn)陰 性血清為從未用過(guò)疫苗且抗體水平接近陰性血清平均值的雞血清。所述的酶標(biāo)抗體稀釋液為PBS緩沖液。所述的顯色劑A組成為底物0PD —片、底物緩沖液。所述的顯色劑B為H202。所述的終止液2M的H2S04。本發(fā)明的試劑盒是將檢測(cè)血清樣品進(jìn)行預(yù)處理后，與包被好的抗原相結(jié)合，利用 酶標(biāo)記的抗體與待檢血清樣品中的抗原或抗體特異性結(jié)合后，在底物溶液參與下顯色進(jìn)行 檢測(cè)，其中，抗原包被液為純化的雞新城疫病毒。本發(fā)明在于提供一種靈敏的、特異的用于雞新城疫病毒抗體臨床診斷及疫苗免疫 后的監(jiān)測(cè)工作服務(wù)的試劑盒。本發(fā)明的試劑盒設(shè)計(jì)的方法由包被抗原酶標(biāo)板和ELISA工 作條件的確定組成，包括運(yùn)用醛化的雞紅細(xì)胞經(jīng)吸附釋放方法純化病毒和方陣法滴定選擇 包被抗原、酶標(biāo)抗體等反應(yīng)物的最佳工作濃度。采用本發(fā)明可以對(duì)雞新城疫病毒抗體檢測(cè) 的ELISA方法試劑盒，所建立的方法具有特異性、靈敏度及可操作性。在敏感度試驗(yàn)方面， 與免疫熒光技術(shù)方法符合率為86%，且比免疫熒光技術(shù)方法更敏感，在其他病原的檢出率為 零，該方法較HI更具有快速、成本低廉，結(jié)果易于判定的優(yōu)點(diǎn)，可用于雞新城疫病毒的診斷 和監(jiān)測(cè)。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明的試劑盒具體組成如下 1材料
1. 1參考血清標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清為用LaSota疫苗株免疫6周齡的小雞，2周后采血分離血 清，用HI實(shí)驗(yàn)測(cè)定HI效價(jià)為1:1024 1:2048，分裝后_80°C保存。陰性血清為從未用過(guò) 疫苗且抗體水平接近陰性血清平均值的雞血清。1.2 ELISA反應(yīng)板為丹麥Nunc公司產(chǎn)品，兔抗雞的酶標(biāo)抗體、底物0PD為Sigma公
司廣品。1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF雞及雞胚，均為梅里亞公司產(chǎn)品。2抗原的制備
2.1病毒的復(fù)壯與增殖將Lasota疫苗株進(jìn)行100倍稀釋，接種于9-11日齡SPF雞胚 復(fù)壯，每胚0. 1ml，38°C孵育，每日照蛋兩次連續(xù)5日，棄去24小時(shí)內(nèi)死亡的雞胚，收獲死亡 的雞胚，無(wú)菌收獲尿囊液，連續(xù)傳代3代測(cè)定HA值，-20°C保存作為提純病毒用。
2. 2病毒純化應(yīng)用醛化的雞紅細(xì)胞經(jīng)吸附釋放方法獲得純化的病毒將SPF雞 新鮮抗凝紅細(xì)胞用PBS液洗滌3次，配制成25%的紅細(xì)胞懸液200 mL,置于錐形瓶中 ，然后將含有50mL 38%甲醛溶液(pH 5. 5 6. 0)的透析袋放入錐形瓶，室溫下緩慢攪 拌2 h;刺穿透析袋使甲醛溶液混入細(xì)胞懸液，繼續(xù)攪拌12 h;細(xì)胞懸液用100目銅網(wǎng) 過(guò)濾，濾液用PBS洗滌3次，加入0.2 mol /L的Tris -甘氨酸緩沖液懸浮沉淀細(xì)胞 ，再加入硼氫化鈉溶液至1 mmol /L;用PBS洗滌3次，配成25%的細(xì)胞懸液，加入0 .01%硫柳汞防腐，并與8 000 Xg離心10 min,病毒上清液配成終濃度5%，4 °C磁 力攪拌1 h，l 000 Xg離心10 min后，分別收集上清和沉淀①沉淀中加入5%NaCl 溶液(pH 6. 8)作用30 min,離心后收集上清；②上清用HA檢測(cè)血凝價(jià)，如果病毒吸 附量低于90%，可進(jìn)行再次吸附，按步驟①重復(fù)1次。將兩次所得上清合并，加入1% Triton X 100作用30min，透析除鹽即為ELISA抗原。測(cè)定蛋白含量為3. 01mg/ml。3 ELISA工作條件的確定
3. 1抗原最佳稀釋度的測(cè)定將不同稀釋倍數(shù)的抗原包被酶標(biāo)板，將標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血 清各一份梯度稀釋后進(jìn)行ELISA實(shí)驗(yàn)，測(cè)得不同條件下的P / N值。結(jié)果表明，當(dāng)抗原做40 倍稀釋，血清作1倍、5倍、10倍稀釋時(shí)P / N值均較大(P / N值分別為5. 1、5.32、5.53)， 因此選擇40倍稀釋做為抗原的最佳稀釋度。3.2血清與酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)的選擇將標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清分別作1倍、5倍、10倍 及20倍梯度稀釋，將酶標(biāo)二抗從2500倍開始做倍比稀釋進(jìn)行方陣實(shí)驗(yàn)，當(dāng)酶標(biāo)二抗稀釋倍 數(shù)為1 :2500 1 :5000時(shí)。陽(yáng)性血清的0D值為1. 0左右，陰性血清的0D值在0. 2左右，因 此選擇酶標(biāo)二抗的工作濃度定為1 :2500，血清做5倍稀釋。3.. 3封閉劑的選擇用不同濃度的明膠、BSA及脫脂奶粉的PBS溶液作為封閉液 的檢測(cè)結(jié)果表明BSA溶液的封閉效果好于不同濃度的脫脂奶粉溶液和明膠溶液。隨著所 試BSA溶液濃度的提高，陰陽(yáng)性血清的0D值均下降，但P / N值不斷升高。當(dāng)以1%BSA溶 液封閉時(shí)P / N最高(P / N*7.76)；明膠溶液作為封閉劑時(shí)陰陽(yáng)性血清0D值均較高，存 在非特異性反，故確定BSA溶液作為封閉劑。3.4血清稀釋液的選擇實(shí)驗(yàn)比較了 5%脫脂奶粉溶液、10%脫脂奶粉溶液以及 濃度分別為0. 5% BSA溶液、BSA溶液作為血清稀釋液的作用效果，結(jié)果表明.BSA溶液 做為血清稀釋液效果好于脫脂奶粉溶液，隨脫BSA液濃度的提高P / N值升高.當(dāng)BSA溶 液濃度為時(shí)P / N值為8. 27，實(shí)驗(yàn)確定以1%BSA溶液作為血清稀釋液。3. 5陰陽(yáng)性血清臨界值的確定用間接ELISA對(duì)120份陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，用 SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析，陰性血清的0D490值呈正態(tài)分布，平均值(X)為0. 126，標(biāo)準(zhǔn)差(SD)為 0. 037，最小值為0. 057，最大值為0. 19。X+3XSD=0. 237即為陰陽(yáng)性血清的臨界值，為了降低假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，在此基 礎(chǔ)上再加上和減去一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差作為可疑值區(qū)間，得到ELISA的可疑值范圍為0. 2 0. 274。3.6抗原包被板的保存期確定將抗原包被板分別在4°C保存0月、1個(gè)月、2個(gè) 月、3個(gè)月、4個(gè)月、5個(gè)月，取不同保存時(shí)間的抗原板，對(duì)16份不同0D值的血清樣品進(jìn)行 ELISA檢測(cè)，比較判定結(jié)果的變化來(lái)確定保存時(shí)間對(duì)試劑盒穩(wěn)定性的影響。結(jié)果顯示，陰陽(yáng) 性血清的0D值雖略有變化，但樣本血清的陰陽(yáng)性判定結(jié)果變化不明顯。4試劑盒的組成的制備4. 1 10倍濃縮洗滌液PBST (含0. 05%Tween-20的PBS溶液) 4.2 血清稀釋液BSA溶液 4. 3 標(biāo)準(zhǔn)血清自制的標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清 4. 4 抗雞IgG酶標(biāo)抗體購(gòu)置Sigma公司產(chǎn)品 4. 5 酶標(biāo)抗體稀釋液PBS緩沖液 4.6 顯色劑A 底物0PD—片、底物緩沖液 4. 7 顯色劑B :H202 4. 8 終止液2M的H2S04 5操作步驟 從冰箱取出試劑盒，室溫復(fù)溫平衡30分鐘。
加標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣本分別設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、待測(cè)樣本孔和空白對(duì)照孔，記錄各孔位 置，在標(biāo)準(zhǔn)品孔中加入標(biāo)準(zhǔn)陰陽(yáng)性血清各50 y L ；待測(cè)樣本孔中先加入待測(cè)血清lOy L，再 加血清稀釋液40yL (即稀釋5倍)；空白對(duì)照孔不加。
溫育37 °C水浴鍋或恒溫箱溫育60min。洗板將孔中的液體用力甩凈，在吸水紙上拍干，每孔加洗滌液200 Ul，靜置 lmin，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)按說(shuō)明書操作洗板)。加酶標(biāo)工作液每孔加入酶標(biāo)工作液50 U L，空白對(duì)照孔不加。溫育37 °C水浴鍋或恒溫箱溫育30min。洗板同上洗板步驟。顯色每孔先加入顯色劑A液50 u L，再加入顯色劑B液50 u L，平板混勻器混勻 30s (或用手輕輕震蕩混勻30s)，37°C避光顯色15min。終止取出酶標(biāo)板，每孔加終止液50 u L，終止反應(yīng)(顏色由藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)。測(cè)定以空白孔調(diào)零，在終止后15分鐘內(nèi)，用450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光值(0D 值)。6結(jié)果判定
根據(jù)0D49(I值計(jì)算P/N值。P/N = (P為陽(yáng)性對(duì)照血清及待檢血清的0D值，N為陰性對(duì) 照血清的0D值)當(dāng)P/N值≥4時(shí)實(shí)驗(yàn)成立。然后，根據(jù)S/N值對(duì)待檢血清進(jìn)行判定(S為待 檢血清的0D49Q值)。結(jié)果陰性S/N≤ 1.3 ；可疑1.3 < S/N ≤ 1.9 ；陽(yáng)性S/N> 1.9。
權(quán)利要求
一種雞新城疫病毒抗體診斷試劑盒，其特征在于包括10倍濃縮洗滌液，血清稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)血清，抗雞IgG酶標(biāo)抗體，酶標(biāo)抗體稀釋液，顯色劑A ，顯色劑B和終止液。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞新城疫病毒抗體診斷試劑盒，其特征在于所述的濃縮洗 滌液為PBST，其含0. 05%Tween-20的PBS溶液。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞新城疫病毒抗體診斷試劑盒，其特征在于所述的血清稀 釋液為的BSA溶液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞新城疫病毒抗體診斷試劑盒，其特征在于所述的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng) 性血清為用LaSota疫苗株免疫后得到完全保護(hù)的雞血清，標(biāo)準(zhǔn)陰性血清為從未用過(guò)疫苗 且抗體水平接近陰性血清平均值的雞血清。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞新城疫病毒抗體診斷試劑盒，其特征在于所述的酶標(biāo)抗 體稀釋液為PBS緩沖液。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞新城疫病毒抗體診斷試劑盒，其特征在于所述的顯色劑A 組成為底物OPD —片、底物緩沖液。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞新城疫病毒抗體診斷試劑盒，其特征在于所述的顯色劑B 為 H2O2O
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞新城疫病毒抗體診斷試劑盒，其特征在于所述的終止液 2M 的 H2S04。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雞新城疫病毒抗體診斷試劑盒，其特征在于試劑盒為將檢 測(cè)血清樣品進(jìn)行預(yù)處理后，與包被好的抗原相結(jié)合，利用酶標(biāo)記的抗體與待檢血清樣品中 的抗原或抗體特異性結(jié)合后，在底物溶液參與下顯色進(jìn)行檢測(cè)，其中，抗原包被液為純化的 雞新城疫病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種雞新城疫病毒抗體診斷試劑盒，包括10倍濃縮洗滌液，血清稀釋液，標(biāo)準(zhǔn)血清，抗雞IgG酶標(biāo)抗體，酶標(biāo)抗體稀釋液，顯色劑A，顯色劑B和終止液。采用本發(fā)明可以對(duì)雞新城疫病毒抗體檢測(cè)的ELISA方法試劑盒，所建立的方法具有特異性、靈敏度及可操作性。在敏感度試驗(yàn)方面，與免疫熒光技術(shù)方法符合率為86%，且比免疫熒光技術(shù)方法更敏感，在其他病原的檢出率為零，該方法較HI更具有快速、成本低廉，結(jié)果易于判定的優(yōu)點(diǎn)，可用于雞新城疫病毒的診斷和監(jiān)測(cè)。
文檔編號(hào)G01N33/558GK101995466SQ20101051342
公開日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2010年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月21日
發(fā)明者吳紅云, 李建正, 范金紅 申請(qǐng)人:鄭州后羿制藥有限公司