專利名稱：一種檢測貝肉中鎘-金屬硫蛋白的酶聯(lián)免疫吸附測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于一種檢測貝肉中金屬硫蛋白的酶聯(lián)免疫吸附測定方法。
背景技術(shù)：
由于人類對重金屬的開采、冶煉、加工及商業(yè)制造活動日益增多，造成不少重金屬 如鉛、汞、鎘、鈷等進(jìn)入大氣、水、土壤中，引起嚴(yán)重的環(huán)境污染。在工業(yè)“三廢”污染中，尤其 以重金屬如鎘，汞，鉛等環(huán)境污染最為突出。水生生物對鎘的富集能力極強(qiáng)，水中的鎘通過 食物鏈富集后可在其體內(nèi)達(dá)到相當(dāng)高的濃度，如魚類可富集IO3 IO5倍，貝類富集IO5 IO6倍。鎘被人體吸收后，在體內(nèi)形成鎘蛋白，選擇性地蓄積于腎、肝，其中腎臟可吸收進(jìn)入 體內(nèi)近1/3的鎘，是鎘中毒“靶器官”。鎘損傷腎小管，患者出現(xiàn)糖尿、蛋白尿和氨基酸尿，特 別是使骨骼的代謝受阻，造成骨質(zhì)疏松、萎縮、變形等一系列癥狀。目前貝類鎘含量的測定方法主要有原子吸收法、比色法和原子熒光法，這些檢測 方法的共同特點(diǎn)是要使用大型儀器，要對樣品進(jìn)行消化，消化過程中要使用大量的硝酸、高 氯酸等帶來環(huán)境污染，耗時長。另外由于貝類樣品中鎘的測定基體干擾較嚴(yán)重，測定結(jié)果的 準(zhǔn)確度和精密度存在較大的不確定性。金屬硫蛋白是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的低分子量、富含半胱氨酸、可被重金屬、 激素及各種細(xì)胞因子誘導(dǎo)的金屬結(jié)合蛋白，它的一個顯著特點(diǎn)是分子中的大量巰基與金屬 離子尤其是重金屬離子具有很強(qiáng)的結(jié)合力，且可在轉(zhuǎn)錄水平上被環(huán)境中的金屬所誘導(dǎo)合 成，這種誘導(dǎo)可以反映出環(huán)境受金屬污染的水平，故金屬硫蛋白可以作為重金屬污染的生 物標(biāo)志物，其研究成為環(huán)境與生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。酶聯(lián)免疫吸附測定法是把抗原抗體免疫反應(yīng)的高度特異性和酶促反應(yīng)的高度敏 感性有機(jī)地結(jié)合起來的一種檢測技術(shù)。由于酶的催化效率很高，使測定方法具有高敏感度。 故本發(fā)明通過建立酶聯(lián)免疫吸附測定法檢測貝肉中金屬硫蛋白的含量從而間接得出貝肉 中鎘含量。鄭軍恒等(1999)從人胎肝中分離提純了金屬硫蛋白的兩個亞型，并用亞型1為 抗原免疫青紫蘭兔制備了抗血清，以純化的抗體建立了人金屬硫蛋白的酶聯(lián)免疫吸附檢測 方法。Margarita Apostolova等利用從小鼠肝臟中提取的鎘-金屬硫蛋白誘導(dǎo)新西蘭兔合 成鎘-金屬硫蛋白抗體，并用此抗體建立了一種靈敏的酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清和組織中 的金屬硫蛋白。吳力專建立的競爭型酶聯(lián)免疫吸附法靈敏度約為4. lng/ml。國內(nèi)外對金屬硫蛋白提取制備及酶聯(lián)免疫吸附法都有研究，而誘導(dǎo)家兔合成 鎘-金屬硫蛋白抗體，再提純抗體建立酶聯(lián)免疫吸附法檢測貝肉中的鎘金屬硫蛋白，從而 間接檢測貝肉中鎘含量的研究還處于空白。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種檢測貝肉中鎘_金屬硫蛋白的技術(shù)，它能有效的反應(yīng)貝 肉中鎘的污染情況，為貝肉中重金屬鎘的檢測提供了一種有效手段。本發(fā)明包括如下步驟
1.鎘金屬硫蛋白的誘導(dǎo)將100 μ 1 0. 2mg/L 0. 6mg/L的氯化鎘注射到0. 5 2年的企鵝珍珠貝中，每天 注射1次，共注射6 8次，誘導(dǎo)貝體內(nèi)大量合成鎘_金屬硫蛋白；2.鎘-金屬硫蛋白的分離提純?nèi)〕鲐惾馊K器，用超純水清洗，冰上剪碎，稱量，加入2倍體積預(yù)冷的 pH8. 60. 01mol/L的Tris-HCl緩沖液勻漿，勻漿后加入一倍體積的V(0. Olmol/lTris-HCl, pH8. 6) V(CH3CH2OH) V(CH3Cl) = 1 1. 05 0. 08 混合液，混勻，4°C靜置過夜。10000 12000r/min離心20 30min，上清液置80°C水浴加熱3 5min，同上離心。上清中加入 3倍體積_20°C預(yù)冷的無水乙醇，攪拌，-20°C放置過夜，4°C下，10000 12000r/min，離心 20 30min，沉淀用Tris-HCl溶解，同上離心，上清即為鎘-金屬硫蛋白粗提液。粗提液先 后經(jīng)S印hadex G-50、DEAE-52柱層析后得到鎘-金屬硫蛋白亞型，再經(jīng)S印hadex G-25脫 鹽，冷凍干燥；3.鎘_金屬硫蛋白抗體的制備將100 150mg金屬硫蛋白、200 300mg牛血清蛋白溶解于20 30mlpH7. 00. lmol/L的磷酸緩沖液中，振蕩下滴加1 %戊二醛10 15ml，25 30°C反應(yīng)2 3h形成偶聯(lián)物，4°C保存。把偶聯(lián)物注射到家兔中誘導(dǎo)鎘-金屬硫蛋白抗體的合成，每隔7 10天加強(qiáng)免疫一次，約2 3次后試血。用瓊脂雙向擴(kuò)散實(shí)驗測定抗體效價達(dá)1 16以上 時通過心臟采血法采血；4.鎘-金屬硫蛋白抗體的提純將全血靜置，等血清析出后，4000rpm離心取上清。用飽和硫酸銨沉淀法對血清中 鎘-金屬硫蛋白抗體進(jìn)行粗提，粗提液用透析袋透析脫鹽，DEAE-Sephadex A50柱層析分 離，測定280nm和260nm處的OD值，OD260nm OD280nm的光吸收比率應(yīng)低于0. 6，比率高則應(yīng) 重新提純；5. ELISA 的建立包被，封閉，加兔抗體貝鎘_金屬硫蛋白抗體與樣品，加酶標(biāo)羊抗兔抗體，加底物， 加H2SO4終止反應(yīng)，在酶標(biāo)儀上450nm波長讀數(shù)。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)1.本發(fā)明的原理科學(xué)合理，技術(shù)步驟比較成熟，是一種有效可靠而且快速靈敏的 檢測方法。2.本發(fā)明用于檢測貝肉中的鎘-金屬硫蛋白含量從而間接反應(yīng)貝肉重金屬鎘的 污染情況，這為貝肉中重金屬鎘的檢測提供了一種快速靈敏的檢測方法。3.本發(fā)明的靈敏度較高，檢出限可達(dá)到2 lOng/ml。
具體實(shí)施例方式上述的S印hadex G-50 層析用 pH8. 60. 01mol/L Tris-HCl 緩沖液以 lml/min 的洗 脫速度進(jìn)行洗脫，DEAE-52柱層析用pH8. 60. 01mol/L Tris-HCl作為緩沖液以0 0. 5mol/ L的NaCl進(jìn)行梯度洗脫，流速lml/min。在抗體的誘導(dǎo)過程中每次多點(diǎn)注射100 200 μ g 的鎘_金屬硫蛋白，共注射六次，前三次用一倍體積的弗氏完全佐劑乳化，后三次用一倍體 積的弗氏不完全佐劑乳化。以PH7. 40. 01mol/L的PBS溶液洗脫DEAE-S印hadex A50柱純化粗提后的鎘_金屬硫蛋白抗體。 ELISA的建立過程中，加待測樣品的包被液80 120 μ 1，2 5°C包被過夜，用 250 μ 1洗滌液洗滌3 5次；加100 300 μ 1封閉液，35 39°C封閉2h，同上洗滌；加 30 60 μ g/ml的兔抗貝鎘-金屬硫蛋白抗體40 60 μ 135 39°C封閉2h，同上洗滌；加 稀釋好的辣根過氧化酶標(biāo)記的羊抗兔二抗90 110 μ 1，35 39°C封閉2h，同上洗滌；加 TMB底物100 300 μ 1，35 39°C反應(yīng)20 30min ；加2mol/L的H2S0450 μ 1終止反應(yīng)，酶 標(biāo)儀上450nm處讀數(shù)。
權(quán)利要求
一種檢測貝肉中鎘 金屬硫蛋白的酶聯(lián)免疫吸附測定方法，其特征包括如下步驟(1)誘導(dǎo)選擇0.5～2年的珍珠貝，對其注射100μl 0.2～0.6mg/L的氯化鎘，注射6～8次；(2)粗提將貝肉加Tris HCl勻漿，4℃過夜，冷凍離心，取上清于70～90℃水浴3～5min，冷凍離心，上清液中加3倍體積乙醇， 20℃過夜，同上離心，沉淀用Tris HCl溶解，再同上離心，上清即為鎘 金屬硫蛋白粗提液；(3)純化粗提液先后經(jīng)Sephadex G 50、DEAE 52柱層析后得到鎘 金屬硫蛋白亞型。再用Sephadex G 25脫鹽。冷凍干燥后即為成品；(4)抗原的制備用戊二醛將鎘 金屬硫蛋白與牛血清蛋白相偶聯(lián)，再用弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑乳化得可注射抗原；(5)抗體的誘導(dǎo)將處理好的抗原注射到家兔體內(nèi)誘導(dǎo)抗體的合成，當(dāng)抗體效價達(dá)到1∶16以上時心臟取血；(6)抗體的提純先用飽和硫酸銨法對抗體進(jìn)行粗提，在用DEAE Sephadex A50進(jìn)行純化；(7)酶聯(lián)免疫吸附測定法的建立包被；封閉；加一抗與樣品；加酶標(biāo)二抗；加底物；加終止液；在酶標(biāo)儀上450nm波長讀數(shù)。
全文摘要
一種檢測貝肉中鎘-金屬硫蛋白的酶聯(lián)免疫吸附測定方法，采用氯化鎘誘導(dǎo)貝合成鎘-金屬硫蛋白，再用提純的金屬硫蛋白誘導(dǎo)兔合成抗體，再對抗體進(jìn)行分離提純，用達(dá)到電泳純的兔抗貝金屬硫蛋白抗體作一抗，用山羊抗兔酶標(biāo)抗體作二抗，采用間接競爭型酶聯(lián)免疫吸附法測定貝金屬硫蛋白的含量。本發(fā)明的原理科學(xué)合理，技術(shù)步驟比較成熟，用于檢測貝肉中的鎘-金屬硫蛋白含量，從而間接反應(yīng)貝肉中鎘的污染情況，這為貝肉中重金屬鎘的測定提供了一種快速靈敏的檢測方法。
文檔編號G01N33/543GK101900726SQ201010227649
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者吳曉萍, 吳育廉, 廖愛琳, 廖艷, 楊捷, 梁鵬, 鄧楚津 申請人:廣東海洋大學(xué)