專利名稱：控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明大致涉及用于控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的方法。某些 實(shí)施例涉及包括基于參數(shù)監(jiān)視而實(shí)時地改變流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的 方法。
背景技術(shù)：
以下的說明和范例并不因其包含于該部分之內(nèi)而被認(rèn)為是現(xiàn)有技術(shù)。通常，流式細(xì)胞計在激光激發(fā)的聚苯乙烯小珠或者細(xì)胞線性地通過流動室的時候 提供對其熒光強(qiáng)度的測量。不過，流式細(xì)胞計同樣可以被用于提供對其它粒子的一個或多 個特性的測量。某些系統(tǒng)被配置為用于測量由粒子所散射的與激發(fā)源成90°或者180° 的光的級別，兩個或更多個熒光測量被用于確定分類，也就是粒子的“身份”，被稱為“指示 器”(importer)的另外的熒光測量往往被用于量化所關(guān)注的化學(xué)反應(yīng)。各熒光測量是在不 同的波長下作出的。由于流式細(xì)胞計型測量儀器的測量能力已有所改進(jìn)，流式細(xì)胞計可以提供有用的 測量的應(yīng)用領(lǐng)域大大地增加了。例如，對于諸如生物化驗(yàn)(例如，置換或競爭化驗(yàn)、非競爭 化驗(yàn)、酶化驗(yàn))、核酸分析、以及組合化學(xué)等應(yīng)用，流式細(xì)胞計已經(jīng)變得越來越有助于提供數(shù) 據(jù)。特別是，由于進(jìn)行化驗(yàn)的速度(特別是與其他化驗(yàn)方法(例如常規(guī)的酶聯(lián)免疫吸附分 析“ELISA”形式)相比較)的原因，流式細(xì)胞計越來越普及。在通常環(huán)境下，為了確保精確可靠的化驗(yàn)結(jié)果，作為準(zhǔn)備儀器以用于適當(dāng)?shù)挠猛?和測量的一個或多個初始步驟，進(jìn)行流式細(xì)胞計的校準(zhǔn)。此外，除非每個流式細(xì)胞計的熒光 通道都被校準(zhǔn)為進(jìn)行相同的讀取，否則對于樣本間的變化源，就沒有保證。如果沒有采用 完整而穩(wěn)固的校準(zhǔn)方法的話，很有可能同一個儀器在不同的幾天里對同一個樣本給出不同 的讀取結(jié)果。類似地，如果任意兩個儀器即使在被正確地設(shè)置的前提下仍然不能保證給出 相同的結(jié)果，盡管流式細(xì)胞計可能對樣本中的細(xì)胞進(jìn)行識別和區(qū)分的測量效果要好一些， 但其作為醫(yī)療儀器的用途可能是不大的。因此，已經(jīng)開發(fā)了許多不同的用于校準(zhǔn)流式細(xì)胞計的方法。起先，進(jìn)行了有效的研 究，開發(fā)出降低在校準(zhǔn)時操作者的涉及程度的方法，從而提高了校準(zhǔn)的精度。這一成果很大 程度上使得流式細(xì)胞計的校準(zhǔn)中的很多步驟實(shí)現(xiàn)了自動化。此外，進(jìn)行了有效的研究以在 其它方面提高校準(zhǔn)的精度。例如，該成果已導(dǎo)致校準(zhǔn)中的進(jìn)步，諸如使用具有統(tǒng)一而恒定的 特性的校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)。特別是，由于生物樣本的特性會隨時間而變化，用于流式細(xì)胞計的生物校 準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)基本上被具有更加穩(wěn)定的特性的綜合校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)(例如，聚合微球體或粒子)所取代。 此外，通常情況下，校準(zhǔn)微球體具有與測試微球體的特性基本相似(即，盡可能地相近)的
3特性(例如，尺度、體積、表面特性、粒度特性、折射率、熒光性等)。人們確信，通過將對與在 測試中預(yù)期的值盡可能接近的值進(jìn)行校準(zhǔn)，此類校準(zhǔn)微球體提高了流式細(xì)胞計的精度。改進(jìn)流式細(xì)胞計的校準(zhǔn)的努力同時也導(dǎo)致了與校準(zhǔn)有關(guān)的流式細(xì)胞計的參數(shù)的 數(shù)量的增加。例如，流式細(xì)胞計測量系統(tǒng)的激光激發(fā)、探測器、以及電子會隨時間變化，從而 影響最終測量結(jié)果。因此，流式細(xì)胞計的這些參數(shù)，以及在某些場合下的其它參數(shù)，往往與 校準(zhǔn)方法有關(guān)。其它的一些更加難以控制的參數(shù)同樣影響流式細(xì)胞計的測量。樣本速度就是一個 這樣的參數(shù)。Ortyn等人的編號為6，532，061美國專利就描述了一個用于測量樣本速度的 方法的例子，該專利通過被引用而結(jié)合于此，如同在這里完整提出那樣。在該方法中，對象 夾帶在流過感應(yīng)或者測量空間的液體流中。在這些實(shí)施例的每一個中，具有大致統(tǒng)一的節(jié) 距的光柵被用于調(diào)制從移動的對象接收到的光。該調(diào)制光被轉(zhuǎn)換為電信號，電信號被數(shù)字 化，然后進(jìn)行快速傅利葉變換(FFT)以確定對象的速度。然而，Ortyn等人的用于測量樣本 速度的方法和系統(tǒng)有一些缺陷。例如，這些方法需要相當(dāng)復(fù)雜的光柵和軟件。此外，由于光 柵所要求的精密度以及其制造的復(fù)雜性，光柵可能相當(dāng)昂貴。而且，由于諸如移動的對象造 成所檢測的光的光學(xué)畸變，可能會導(dǎo)致樣本速度測量不那么精確。然而，流式細(xì)胞計測量的最大誤差通常是由溫度變化造成的。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，現(xiàn) 有的可行的校準(zhǔn)方法不能夠充分地說明溫度變化對流式細(xì)胞計進(jìn)行的測量的影響。例如， Ortyn等人所描述的方法和系統(tǒng)盡管其試圖校準(zhǔn)一些參數(shù)，但并未考慮溫度變化，以及這 些變化將如何影響流式細(xì)胞計的測量。因此，盡管已經(jīng)有很多不同的可行的校準(zhǔn)方法，但還 是可以通過更加精確地考慮在不同的流式細(xì)胞計測量中或是在單個的流式細(xì)胞計測量中 的溫度變化來對這些方法作出進(jìn)一步的改進(jìn)。因此，發(fā)展用于對流式細(xì)胞計測量系統(tǒng)的至少主要的誤差因素進(jìn)行控制的方法應(yīng) 該是有益的，這些方法可以被整合從而產(chǎn)生實(shí)時的校準(zhǔn)方案。

發(fā)明內(nèi)容
如前所細(xì)述的那樣，通常最流式細(xì)胞計的最顯著的誤差因素是溫度變化。由于溫 度可以是一個可測量的量，而且其效應(yīng)背后的物理機(jī)理是已知的，因此有可能降低甚至是 完全消除這些誤差源中最關(guān)鍵的一環(huán)。已經(jīng)識別了一些測量誤差的原因和對于這些測量誤差原因的實(shí)時校正技術(shù)。此 外，已經(jīng)創(chuàng)建了一種使用校準(zhǔn)微球體進(jìn)行實(shí)時微調(diào)節(jié)的方法，其中校準(zhǔn)微球體因直徑與可 能包含于微球體樣本混合物中的待測物略有不同而可被識別。微調(diào)節(jié)過程的額外特征包括 系統(tǒng)健康狀態(tài)的實(shí)時識別、一個或多個通道中的非線性性的校正、和/或流式細(xì)胞計測量 系統(tǒng)的有用的指示器動態(tài)范圍的顯著擴(kuò)展。所描述的實(shí)施例可用于補(bǔ)償主要由溫度導(dǎo)致的 系統(tǒng)變化，從而擴(kuò)展了操作的校準(zhǔn)范圍。此外，需要指出的是，此處描述了用于控制流式細(xì)胞計測量系統(tǒng)的一個或多個參 數(shù)的方法的若干不同的實(shí)施例。要理解，每個方法都可單獨(dú)被使用和執(zhí)行。另外，兩個或更 多的方法可以被結(jié)合使用，這取決于例如測量系統(tǒng)的各種組件的可變性和/或測量系統(tǒng)的 期望精度。本發(fā)明的一個實(shí)施例涉及一種控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的方法。該方法包括在測量系統(tǒng)進(jìn)行樣本微球體的測量時，監(jiān)測流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一 個或多個參數(shù)。該方法還包括基于監(jiān)測實(shí)時地改變所述一個或多個參數(shù)。在一個實(shí)施例中，監(jiān)測一個或多個參數(shù)可包括使用校準(zhǔn)微球體的測量來監(jiān)測一個 或多個參數(shù)。校準(zhǔn)微球體的直徑與樣本微球體的直徑不同(例如，稍小)。在某些實(shí)施例 中，該一個或多個參數(shù)可包括由測量系統(tǒng)的探測器所產(chǎn)生的輸出信號。輸出信號響應(yīng)于由 樣本微球體所散射的光。在另一個實(shí)施例中，監(jiān)測一個或多個參數(shù)可包括使用校準(zhǔn)微球體的測量來監(jiān)測一 個或多個參數(shù)。校準(zhǔn)微球體的直徑與樣本微球體的直徑不同(例如，稍小)，并且至少部分 校準(zhǔn)微球體具有不同的光譜地址(spectral address)。在一個此類實(shí)施例中，所述一個或 多個參數(shù)包括測量系統(tǒng)的動態(tài)范圍。在另一個實(shí)施例中，對參數(shù)的改變可包括擴(kuò)展測量系 統(tǒng)的一個或多個通道的動態(tài)范圍。在又一個實(shí)施例中，所述一個或多個參數(shù)可包括對系統(tǒng) 健康狀態(tài)的測量。系統(tǒng)健康狀態(tài)的測量可包括分類通道的健康狀態(tài)、指示器通道的健康狀 態(tài)、或者其結(jié)合。在某些實(shí)施例中，所述一個或多個參數(shù)可包括樣本微球體的測量中的線性 性。在這樣一個實(shí)施例中，測量可包括對分類通道的測量、對指示器通道的測量、或其組合。 在另一個此類實(shí)施例中，對參數(shù)的改變包括在測量中大致地對任何非線性性進(jìn)行校正。在某些實(shí)施例中，參數(shù)可包括測量系統(tǒng)的雪崩光電二極管的參數(shù)。在一個此類實(shí) 施例中，其方法還可包括使用經(jīng)驗(yàn)獲得數(shù)據(jù)來確定在改變參數(shù)時所要使用的校正因子。在 另一個實(shí)施例中，參數(shù)可包括測量系統(tǒng)的光電倍增管的參數(shù)。在還有一個實(shí)施例中，參數(shù)可包括樣本微球體的速度。在一個此類實(shí)施例中，對參 數(shù)的監(jiān)測可包括監(jiān)測樣本微球體被置于其中的液體的溫度，并根據(jù)該溫度來確定樣本微球 體的速度。在某些實(shí)施例中，該方法還可包括在對樣本微球體進(jìn)行測量之前對一個或多個 參數(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)。前述方法的每一個實(shí)施例都可包括此處所述的任何其它步驟。另一個實(shí)施例涉及控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的一種不同的 方法。該方法包括監(jiān)測最接近于流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的溫度。該方法還包括使用經(jīng)驗(yàn)數(shù) 據(jù)來響應(yīng)于溫度而改變測量系統(tǒng)的雪崩光電二極管的偏置電壓，從而大致上校正由于溫度 所致的雪崩光電二極管的增益的變化。在一個實(shí)施例中，其方法還包括通過在一個或多個溫度下將一基本恒定的光級別 施加到雪崩光電二極管上，并且記錄在所述一個或多個溫度下對于多個偏置電壓的雪崩光 電二極管的電流輸出，從而產(chǎn)生經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)。在另一個實(shí)施例中，對參數(shù)的改變是在測量系統(tǒng) 進(jìn)行樣本測量之前進(jìn)行的。在一個此類實(shí)施例中，偏置電壓在樣本測量過程中可基本保持 恒定。在一個不同的實(shí)施例中，對參數(shù)的監(jiān)測和改變是實(shí)時進(jìn)行的。在某些實(shí)施例中，其方法還可包括在發(fā)射出已知強(qiáng)度的光的校準(zhǔn)微球體被測量系 統(tǒng)測量的同時，改變雪崩光電二極管的偏置電壓，直至從雪崩光電二極管獲得一個預(yù)定的 信號級別為止。在一個此類實(shí)施例中，其方法還可包括確定雪崩光電二極管在反向偏置電 壓下相應(yīng)的相對電流、在預(yù)定信號級別下的偏置電壓、以及溫度。該方法的實(shí)施例還可包括 使用相應(yīng)的相對電流、溫度、反向偏置電壓、以及經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)來確定偏置電壓。前述的方法的 每個實(shí)施例均可包括此處所述的任何其它步驟。另一個實(shí)施例涉及控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的又一個方 法。該方法包括監(jiān)測最接近于流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的溫度。該方法還包括使用光電倍增管的特征曲線響應(yīng)于溫度而改變測量系統(tǒng)的光電倍增管的輸出信號，從而基本上校正光電 倍增管輸出信號的增益變化。光電倍增管的增益響應(yīng)于溫度作近似線性變化。在某些實(shí)施 例中，所述光電倍增管是測量系統(tǒng)的指示器通道的一部分。在另一實(shí)施例中，光電倍增管的 特征曲線隨探測波長以及光電倍增管的陰極結(jié)構(gòu)而變化。此處前述方法的每個實(shí)施例可包 括此處所述的任何其它步驟。另一個實(shí)施例涉及控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的一種方法的 另一實(shí)施例。該方法包括將測量系統(tǒng)的光電倍增管電壓設(shè)置為第一值和第二值。該方法還 包括在第一值和第二值測量光電倍增管的輸出電流。此外，該方法包括根據(jù)第一值和第二 值的對數(shù)與第一值和第二值下輸出電流的對數(shù)的相對關(guān)系來確定光電倍增管的校準(zhǔn)電壓。 該方法還包括將該校準(zhǔn)電壓施加到光電倍增管上。該方法還包括測試該光電倍增管從而確 定該光電倍增管的一個或多個參數(shù)是否在預(yù)定的容差內(nèi)。前述方法的每個實(shí)施例均可包括 此處所述的任何其它步驟。還有一個實(shí)施例涉及控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的另一種方 法。該方法包括使用逐次逼近來確定測量系統(tǒng)的探測器的校準(zhǔn)電壓。該方法還包括將該校 準(zhǔn)電壓施加到探測器上。在一個實(shí)施例中，探測器可包括雪崩光電二極管。在一個不同的 實(shí)施例中，探測器可包括光電倍增管。在一個實(shí)施例中，其方法包括將校準(zhǔn)電壓與探測器的擊穿電壓相比較，如果校準(zhǔn) 電壓超過了擊穿電壓則重復(fù)對校準(zhǔn)電壓的確定過程。該方法的一個不同的實(shí)施例包括收集 和處理探測器樣本以確定探測器信號級別。在一個此類實(shí)施例中，其方法可包括將探測器 信號級別與校準(zhǔn)目標(biāo)信號級別相比較，如果探測器信號級別高于校準(zhǔn)目標(biāo)信號級別，則減 低探測器的偏置電壓，并且重復(fù)對校準(zhǔn)電壓的確定過程。在另一個此類實(shí)施例中，其方法可 包括將探測器信號級別與校準(zhǔn)目標(biāo)信號級別進(jìn)行比較，如果探測器信號級別不在校準(zhǔn)目標(biāo) 信號級別的預(yù)定范圍之內(nèi)，則重復(fù)對校準(zhǔn)電壓的確定直至所有的期望的探測器電壓級別都 被嘗試過為止。前述方法的每個實(shí)施例均可包括此處所述的任何其它步驟。再一個實(shí)施例涉及控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的一種不同的 方法。該方法包括對將會流經(jīng)流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的液體的溫度進(jìn)行監(jiān)測。樣本微球體 被置于該液體中。該方法還包括根據(jù)液體在該溫度下的粘度來確定測量系統(tǒng)中的樣本微球 體的速度。在一個實(shí)施例中，其方法還包括基于速度來確定樣本微球體之一將存在于測量 系統(tǒng)的探測窗口中的時間長度。在某些實(shí)施例中，其方法可包括基于速度來確定樣本微球 體之一從測量系統(tǒng)的一個探測窗口移動到另一個探測窗口的時間長度。在另一個實(shí)施例 中，其方法可包括基于速度來確定樣本微球體之一何時會出現(xiàn)在測量系統(tǒng)的探測窗口中。 在又一個實(shí)施例中，其方法包括控制測量系統(tǒng)的一個或多個探測窗口的采樣間隔從而對速 度進(jìn)行補(bǔ)償。在還有一個實(shí)施例中，監(jiān)測參數(shù)和確定速度是在測量系統(tǒng)對樣本微球體進(jìn)行測量 之前進(jìn)行的。在某些實(shí)施例中，其方法可包括根據(jù)速度來確定測量系統(tǒng)的輸出信號的一個 或多個特性。在一個此類實(shí)施例中，其方法包括利用校正因子來校正由于速度所致的輸出 信號的誤差。所述的校正因子是采用經(jīng)驗(yàn)測量值來確定的。在另一個實(shí)施例中，測量系統(tǒng) 被配置為在樣本微球體的測量過程中維持液體的壓力基本恒定。
在一個實(shí)施例中，確定速度包括從表、泊肅葉(Poiseuille)等式、或者從對應(yīng)于 溫度的速度的預(yù)定值來確定速度。在詞類的一些實(shí)施例中，該方法還可包括根據(jù)速度在樣 本微球體的測量過程中控制液體的壓力。前述方法的每個實(shí)施例均可包括此處所述的任何 其它步驟。一種不同的實(shí)施例涉及控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的另一種 方法。該方法包括測量微球體從流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的第一探測窗口移動到測量系統(tǒng)的 第二探測窗口的時間。該方法還包括改變測量系統(tǒng)的施加壓力從而使得時間大致恒定。在 一個實(shí)施例中，該時間是平均時間。微球體可以是樣本微球體或者校準(zhǔn)微球體。測量時間可 包括在第一和第二探測窗口中測量被微球體所散射的光。在另一個實(shí)施例中，測量時間可 包括用一個探測器測量在第一和第二探測窗口被微球體所散射的光。在第一和第二探測窗 口中被微球體所散射的光可被一個分光器導(dǎo)向所述的一個探測器。該方法可以實(shí)時操作， 也可以非實(shí)時地操作。前述方法的每個實(shí)施例均可包括此處所述的任何其它步驟。還有一個實(shí)施例涉及控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的一種不同 的方法。該方法包括測量微球體從流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的第一探測窗口移動到測量系統(tǒng) 的第二探測窗口的平均時間。微球體可包括樣本微球體、校準(zhǔn)微球體、或者二者兼而有之。 該方法還包括將平均時間和參考微球體從第一探測窗口移動到第二探測窗口所用的參考 時間進(jìn)行比較。此外，該方法包括，如果平均時間和參考時間之間的差大于預(yù)定值，則改變 測量系統(tǒng)的施加壓力。在一個實(shí)施例中，改變施加壓力包括如果平均時間大于參考時間則增加施加壓 力?；蛘?，如果平均時間小于參考時間則減小施加壓力。在某些實(shí)施例中，預(yù)定值被選擇為 對測量系統(tǒng)的已知的時間變化機(jī)制進(jìn)行補(bǔ)償。該方法可以實(shí)時地操作，也可以非實(shí)時地操 作。前述方法的每個實(shí)施例均可包括此處所述的任何其它步驟。


通過閱讀以下的詳細(xì)描述并參考附圖，可以明顯地獲知本發(fā)明的其它目的和優(yōu)
；^^，I .圖1是一示意圖，舉例描述可用于執(zhí)行此處所述的方法的測量系統(tǒng)。圖2是舉例描述示出作為溫度的函數(shù)的具有130伏的反向偏置電壓(V60)的APD 的響應(yīng)的多條偏置曲線的示圖。圖3是描述作為溫度的函數(shù)的各種PMT的響應(yīng)的示圖。圖4是舉例描述作為PMT偏置電壓的對數(shù)的函數(shù)的PMT增益的對數(shù)。圖5是一流程圖，描述用于控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的方法 的一個實(shí)施例。圖6是一示意圖，描述可被用于執(zhí)行此處所述的至少一個方法的測量系統(tǒng)的一部 分的一個實(shí)施例的截面圖。圖7描述可在此處所述的方法中的一個實(shí)施例中測量的脈沖群(即，在不同時間 所測得的散射光)。雖然本發(fā)明可采用各種修改和變化形式，其具體的實(shí)施例在圖中以示例形式給出 并且將詳細(xì)進(jìn)行描述。但應(yīng)該理解的是，此處的附圖和對其的詳細(xì)描述并不是為了將本發(fā)明局限于此處所揭示的細(xì)節(jié)，相反，其應(yīng)該覆蓋所有落入如所附的權(quán)利要求中所定義的本 發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的修改、等效方法和變化。
具體實(shí)施例方式此處將描述用于控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的方法的若干不 同的實(shí)施例。如上所提及的，可以單獨(dú)使用和進(jìn)行每個方法。此外，可以組合地使用或進(jìn)行 兩個或更多的方法，這取決于例如，測量系統(tǒng)中的各種組件的可變性和/或測量系統(tǒng)的期 望精度。盡管此處對實(shí)施例的描述涉及的是微球體或者聚苯乙烯小珠，但應(yīng)該理解的是， 所述測量系統(tǒng)和方法也可以用于微粒子、金納米粒子、小珠(bead)、微珠(microbead)、膠 乳粒子、膠乳小珠、熒光小珠、熒光粒子、有色粒子、有色小珠、以及細(xì)胞(cell)。微球體可以 作為分子反應(yīng)的載體。合適的微球體、小珠、以及粒子的例子被描述于Fulton的美國專利 號5，736，330、Chandler等人的美國專利號5，981，180、Fulton的美國專利號6，057，107、 Chandler等人的美國專利號6，268，222,Chandler等人的美國專利號6，449，562,Chandler 等人的美國專利號6，514，295,Chandler等人的美國專利號6，524，793,Chandler等人的美 國專利號6，528，165，這些專利都通過被引用而完全結(jié)合于此。此處所述的測量系統(tǒng)和方法 可以用于這些專利中所述的任何微球體、小珠、以及粒子。此外，用于流式細(xì)胞計的微球體 可以從諸如得克薩斯州奧斯丁市的盧米尼克斯股份有限公司(LuminexCorp.)等的制造商 處獲得。術(shù)語“小珠(bead)”和“微球體(microsphere)”在此是可互換使用的。圖1舉例描述可用于實(shí)現(xiàn)此處所述的方法的測量系統(tǒng)的一個示例。特別是，可以 根據(jù)此處所述的方法來確定、監(jiān)測、改變、和/或控制描述于圖1中的測量系統(tǒng)的一個或多 個參數(shù)。需要指出的是，此處所描述的圖并不是按實(shí)際的尺度比例繪制的。特別地，圖中某 些元件的尺度被夸大以用于強(qiáng)調(diào)這些元件的特征。出于闡述清楚的考慮，測量系統(tǒng)的某些 元件沒有被包括在圖中。在圖1中，沿著過微球體所流經(jīng)的試管12的橫截面的平面示出了測量系統(tǒng)。在一 個例子中，試管可以是標(biāo)準(zhǔn)石英試管，比如用于標(biāo)準(zhǔn)流式細(xì)胞計中的那種。不過，任何其它 適當(dāng)類型的觀察或輸送室都可以被用于輸送要分析的樣本。測量系統(tǒng)包括光源14。光源 14可包括本領(lǐng)域已知的任何適當(dāng)光源，比如激光器。光源可被配置為發(fā)射具有一個或多個 波長的光，比如藍(lán)光或綠光。光源14可被配置為在微球體流經(jīng)試管的時候?qū)ζ溥M(jìn)行照射。 照射會導(dǎo)致微球體發(fā)出具有一個或多個波長或波段的熒光。在某些實(shí)施例中，系統(tǒng)可包括 一個或多個透鏡(未示出)，其被配置為將來自光源的光聚焦到微球體上或聚焦到流動路 徑上。系統(tǒng)也可包括不只一個光源。在一個實(shí)施例中，這些光源可被配置為以具有不同波 長或波段的光(例如，藍(lán)光和綠光)來照射微球體。在某些實(shí)施例中，這些光源可被配置為 以不同的方向照射微球體。從微球體前向散射的光可通過折疊式反射鏡18或者另一種適當(dāng)?shù)墓鈱?dǎo)組件引導(dǎo) 到探測系統(tǒng)16?；蛘撸綔y系統(tǒng)16可以直接放置在前向散射的光的路徑上。如此，折疊式 反射鏡或者其它的光導(dǎo)組件可以不包含在系統(tǒng)中。在一個實(shí)施例中，前向散射的光可以是 由微球體以和光源14的照射方向成大約180°的角度所散射的光，如圖1中所示。前向散 射的光可以不與照射方向正好成180°角，從而來自光源的入射光不會撞上探測系統(tǒng)的感光表面。例如，前向散射的光可以是被微球體以與照射方向成小于或大于180°的角度所散 射的光(例如，以大約170°、175°、185°、或者190°所散射的光)。被微球體散射的、與照射方向成大約90°角度的光也可以被收集(collected)。 在一個實(shí)施例中，該散射光可以被一個或多個分光器或者分色鏡分為一個以上的光束。例 如，與照射方向成大約90°角度而散射的光可以被分光器20分為兩束不同的光。這兩個不 同的光束可以由分光器22和24進(jìn)一步分成四束不同的光。每束光可以被導(dǎo)入不同的探測 系統(tǒng)，這些探測系統(tǒng)中可包括一個或多個探測器。例如，四個光束中的一個可以被導(dǎo)入探測 系統(tǒng)26。探測系統(tǒng)26可以被配置為探測由微球體所散射的光。由探測系統(tǒng)16和/或探測系統(tǒng)26所探測到的散射光通常與光源所照射的粒子 的體積成比例。因此，探測系統(tǒng)16的輸出信號和/或探測系統(tǒng)26的輸出信號可被用于確 定位于照射區(qū)域或者探測窗口中的粒子的直徑。此外，探測系統(tǒng)16和/或探測系統(tǒng)26的 輸出信號可被用于對粘在一起或者幾乎同時通過照射區(qū)域的一個以上的粒子進(jìn)行識別。因 此，這些粒子可以與其它樣本微球體以及校準(zhǔn)微球體相區(qū)別。而且，探測系統(tǒng)16和/或探 測系統(tǒng)26的輸出信號可如此處所述地被用于基于尺寸的大小來區(qū)別樣本微球體和校準(zhǔn)微 球體。其它3個光束可被導(dǎo)入探測系統(tǒng)28、30和32。探測系統(tǒng)28、30以及32可被配置 為探測由微球體所發(fā)出的熒光。每個探測系統(tǒng)可被配置為探測不同波長或者不同波長范圍 的熒光。例如，其中一個探測系統(tǒng)可被配置為探測綠色熒光。另一個探測系統(tǒng)可被配置為 探測黃_橙色的熒光，而其它探測系統(tǒng)則被配置為探測紅色熒光。在某些實(shí)施例中，濾光器34、36、以及38可以分別被耦合到探測系統(tǒng)28、30以及 32上。濾光器可被配置為阻隔除了探測系統(tǒng)配置為要探測的波長以外的其它波長的熒光。 此外，一個或多個透鏡(未示出)可以被光學(xué)地耦合到各個探測系統(tǒng)上。這些透鏡可以被 配置為將散射光或者發(fā)出的熒光會聚到探測器的感光表面上。探測器的輸出電流與碰撞到其上的熒光成比例，并且產(chǎn)生電流脈沖。電流脈沖可 以被轉(zhuǎn)換為電壓脈沖，經(jīng)過低通濾波，然后由A/D轉(zhuǎn)換器數(shù)字化。處理器40，比如DSP，對脈 沖下的區(qū)域進(jìn)行積分以提供表示熒光的大小的數(shù)。此外，處理器可以執(zhí)行此處所述的另外 的功能(例如，對流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)進(jìn)行監(jiān)測，基于所監(jiān)測的參數(shù) 來實(shí)時地改變一個或多個參數(shù)，等等)。如圖1中所示，處理器40可以通過傳輸媒介42被 耦合到探測器26。處理器40還可通過傳輸媒介42和一個或多個其它組件(如A/D轉(zhuǎn)換 器)而間接地耦合于探測器26。處理器可以類似的方式耦合到系統(tǒng)的其它探測器上。在某些實(shí)施例中，由微球體所發(fā)出的熒光所產(chǎn)生的輸出信號可以被用于確定微球 體的身份(identity)以及有關(guān)發(fā)生在微球體表面的反應(yīng)的信息。例如，探測系統(tǒng)的其中兩 個探測系統(tǒng)的輸出信號可被用于確定微球體的身份，而另一探測系統(tǒng)的輸出信號可被用于 確定發(fā)生在微球體表面上的反應(yīng)。因此，對于探測器以及濾光器的選擇是可以變化的，這取 決于結(jié)合或綁定于被測量的微球體和/或反應(yīng)的染料的類型(即，結(jié)合或綁定于反應(yīng)中所 涉及的反應(yīng)物的染料)。用于確定樣本微球體的身份的探測系統(tǒng)(例如，探測系統(tǒng)28和30)可以是APD、 PMT、或者其它光探測器。如這里所述，可以對APD實(shí)時地校正如這里所述的作為溫度的函 數(shù)的增益變化。用于識別發(fā)生于微球體的表面的反應(yīng)的探測系統(tǒng)(例如，探測系統(tǒng)32)可
9以是PMT、APD、或者其它形式的光探測器。通過采用由PMT特征曲線所得出的一個簡單乘 數(shù)，PMT可以被校正，其中所述PMT特征曲線可以如此處所述地被施加到PMT的輸出信號上。 探測器和測量系統(tǒng)還可以如此處所述地進(jìn)行配置。盡管圖1所示系統(tǒng)包括具有兩個不同探測窗口的兩個探測系統(tǒng)，用于區(qū)分具有不 同染色特性的微球體，但應(yīng)該理解的是，該系統(tǒng)可以包括超過兩個這樣的探測窗口(例如， 3個探測窗口、4個探測窗口，等等)。在這樣的實(shí)施例中，系統(tǒng)可包括額外的分光器和額外 的具有其它探測窗口的探測系統(tǒng)。此外，濾光器和/或透鏡可被連接到各個所述的額外的 探測系統(tǒng)上。在另一個實(shí)施例中，系統(tǒng)可包括兩個或更多個被配置為區(qū)分在微球體的表面上反 應(yīng)的不同材料的探測系統(tǒng)。不同的反應(yīng)物材料可具有不同于微球體的染色特性的染色特性。其它可用于執(zhí)行此處所述的方法的測量系統(tǒng)的例子被闡述于Chandler等人 的美國專利號5，981，180，Chandler等人的美國專利號6，046，807，Chandler等人的美 國專利號6，139,800, Chandler等人的美國專利號6，366，354，Chandler等人的美國專 利號6，411，904，Chandler等人的美國專利號6，449，562，Chandler等人的美國專利號 6，524，793中，所有這些專利都通過被引用而完全結(jié)合于此。此處所描述的測量系統(tǒng)也可以 按照這些專利中所述的方式來配置。在流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)中，散射光和小珠身份探測通常是采用雪崩光電二極管 (APD)作為光學(xué)傳感器來進(jìn)行的。APD相比于其它探測器的優(yōu)勢在于，通過施加反向偏置電 壓，APD的輸出電流級別或者“增益”可以在較寬的范圍內(nèi)變化。所述的增益與施加的偏置 電壓的大小成比例，其中該增益可以按照由恒定數(shù)量的入射光子所引起其流動的電子來表 示。不幸的是，從入射光子到輸出電子間的轉(zhuǎn)換對溫度的依賴性很強(qiáng)。因此，APD相當(dāng)依賴 于溫度，其程度比流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)中的任何其它元件都要高。因此，一種控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的方法的一個實(shí)施例包 括對最接近于流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的溫度進(jìn)行監(jiān)測。該方法還包括響應(yīng)該溫度而改變測 量系統(tǒng)的APD的偏置電壓。每一個APD都由制造商額定了一個反向偏置電壓(V60)，在該電壓下可以獲得的 輸出電流比在大致相同照射下的硅二極管要大60倍。取決于個體器件，V60的取值在幾十 伏到100伏以上。由于APD的輸出相對于溫度而言是非線性的，因此不能在APD的整個操作范圍內(nèi) 使用恒定的補(bǔ)償因子。電流輸出-溫度的經(jīng)驗(yàn)測量可以被用于研究一種全面的補(bǔ)償方法。 換句話說，可以采用經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)來確定被用于改變APD的參數(shù)的校正因子。特別是，可以采用 經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)來改變APD的偏置電壓，從而大致上校正由于溫度所導(dǎo)致的雪崩光電二極管的增
益變化。為了用經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)來表征APD的響應(yīng)，在一個或多個溫度下，將一個大致恒定的光 級別施加到APD上。在一個或多個給定的溫度下，記錄在多個偏置電壓下APD的電流輸出。 改變溫度(例如，增加整數(shù)的度數(shù))，然后再次重復(fù)在多個偏置電壓下的測量。所得到的數(shù) 據(jù)集合(例如，如圖2中所示)充分地描述了特定的V60器件的照明一電流隨溫度變化的 曲線。為了獲取多個不同器件的響應(yīng)，可以對具有不同V60額定值的APD重復(fù)這些測量。
在一個實(shí)施例中，偏置曲線表可被用于依下述方法校正溫度。在初始系統(tǒng)校準(zhǔn)時， 發(fā)射出已知強(qiáng)度的光的校準(zhǔn)微球體被引入系統(tǒng)。該校準(zhǔn)微球體流經(jīng)系統(tǒng)，當(dāng)校準(zhǔn)微球體被 測量系統(tǒng)測量時，偏置電壓被改變直至從APD獲得預(yù)定的信號級別。然后，使用探測器的 V60、在所述預(yù)定信號級別下的偏置電壓、以及溫度作為對APD響應(yīng)表中索引，將APD的當(dāng)前 讀數(shù)插入表中(R值)。在另一個實(shí)施例中，偏置曲線表可以依以下方式產(chǎn)生?？墒褂萌绨l(fā)光二極管(LED) 之類的恒定光輸出源經(jīng)由光纜遠(yuǎn)程地對APD的感光區(qū)域進(jìn)行照射。APD然后可以被放置在 可以改變APD暴露于其中的環(huán)境溫度的環(huán)境艙中。然后，當(dāng)溫度和施加給APD的偏置電壓 都變化時，測量系統(tǒng)將APD的電流輸出(R值)記錄下來。在正常的樣本運(yùn)行期間，可監(jiān)測最接近于流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的溫度。然后可 使用期望的相對電流、溫度、以及經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)來確定偏置電壓。例如，R值、測得的溫度、以及 V60參數(shù)可以被用作APD響應(yīng)表的輸入以找出相應(yīng)的偏置電壓。如果測得的溫度處于表格 的條目之間，則將對應(yīng)于最接近的溫度條目的讀數(shù)進(jìn)行內(nèi)插以獲得最佳偏置電壓。從表格 中所獲得的偏置電壓被施加到APD上以校正其增益隨溫度的變化。由于樣本運(yùn)行的時間通 常在兩分鐘內(nèi)，而溫度在這段時間內(nèi)變化不大，所以通常情況下在樣本運(yùn)行的開始階段進(jìn) 行單次偏置校正并且在運(yùn)行的過程中維持該偏置就足夠了。換句話說，可以在測量系統(tǒng)進(jìn) 行樣本測量之前改變偏置電壓，而在樣本測量的過程中偏置電壓可以基本恒定。然而，有可 能最接近于測量系統(tǒng)的溫度在樣本運(yùn)行的時候隨時間被監(jiān)測，而APD的偏置電壓可相應(yīng)地 被改變。在這種方式下，對溫度的監(jiān)測以及對APD的偏置電壓的改變是實(shí)時進(jìn)行的。某些流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的指示器通道包括用作感光探測器的光電倍增管 (PMT)。該指示器通道通?？杀欢x為用于識別在微球體表面發(fā)生的反應(yīng)中涉及的材料或 結(jié)合于微球體表面的材料的通道。PMT產(chǎn)生與照射光電陰極的光的量、施加的偏置電壓以及 PMT內(nèi)的內(nèi)部倍增電極(internal dynode)的數(shù)量成比例的電流。在一個流式細(xì)胞計中， PMT的偏置電壓通常被用作對給定級別的熒光的電流輸出進(jìn)行歸一化的“控制”點(diǎn)。目前所 采用的用于在校準(zhǔn)過程中獲得歸一化電壓的方法是經(jīng)驗(yàn)性的，進(jìn)行測量，然后對有可能產(chǎn) 生更接近于期望值的輸出的PMT偏置設(shè)置進(jìn)行有根據(jù)的推測。通常，在輸出誤差級別達(dá)到 一個可接受的范圍之前需要多次迭代。所以，縮短校準(zhǔn)時間，從而降低用于尋找最佳PMT電 壓的校準(zhǔn)試劑(reagent)的量是很有利的。下文中將描述若干不同的可以使得校準(zhǔn)過程比 現(xiàn)有情況更快的方法。由于對于溫度的大致線性的響應(yīng)，相比APD，PMT補(bǔ)償溫度變化要簡單得多。例 如，一種用于控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的方法的一個實(shí)施例包括對最 接近于流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的溫度進(jìn)行監(jiān)測。該溫度通常在盡量接近PMT的位置測量， 盡管由于PMT的溫度變化率相對輕微，精確的位置并不是很關(guān)鍵。該方法還包括采用PMT 的特征曲線來響應(yīng)于溫度而改變測量系統(tǒng)的PMT的輸出信號，從而大致上校正PMT的輸出 信號增益由于溫度所致的改變。PMT的增益接近線性地響應(yīng)于溫度而改變。此外，PMT的 特征曲線會隨著探測波長和陰極結(jié)構(gòu)而變化。在這種方式下，在給定的探測波長和陰極 結(jié)構(gòu)下，PMT對于溫度的響應(yīng)可以通過一個簡單的線性關(guān)系來表示，如圖3中所示，該圖來 自Hamamatsu Photonics K. K 1994年的《光電倍增管-理論到應(yīng)用》(Photomultiplier tube-Principal to Application)，在此將其完全地結(jié)合于此作為參考。
如前所述，由于PMT的增益隨溫度的變化要比APD的小得多，通常沒有必要通過 改變增益或者確定偏置電壓來對器件進(jìn)行補(bǔ)償。相反，采用從諸如圖3中所示的曲線那樣 的PMT特征曲線導(dǎo)出的簡單乘數(shù)就足夠了，其中所述曲線可以通過報告軟件應(yīng)用到最終的 PMT讀數(shù)上。為了對PMT進(jìn)行校準(zhǔn)，具有已知熒光量的校準(zhǔn)微球體被提供給儀器，并且從系統(tǒng) 中流過，就像取得正常的樣本那樣。當(dāng)測量系統(tǒng)對校準(zhǔn)微球體進(jìn)行測量時，改變偏置電壓， 直至獲得預(yù)定的信號級別。該方法是一種迭代過程，其中，一組微球體讀數(shù)的統(tǒng)計值被計算出來，并且在獲得 期望的容差時終止該過程。如果誤差不夠小，那么前兩次迭代的結(jié)果可被用于對下一個PMT 偏置設(shè)定進(jìn)行預(yù)測。在此過程中采用了一個線性等式y(tǒng) = m*x+b，其中斜率m由在前的偏 置和產(chǎn)生的熒光測量值來定義。如果PMT的偏置電壓對電流增益的傳遞函數(shù)是線性的，可 以直接獲得最終結(jié)果，并由另一個測量來測試。然而，由于PMT的電壓一電流增益?zhèn)鬟f函數(shù) 隨偏置電壓增加而呈指數(shù)增長，線性方法僅僅在曲線的相對較小的一段內(nèi)有效，因此需要 若干次迭代以滿足最終的容差要求。有趣的是，當(dāng)把PMT的電壓一增益關(guān)系繪制在log-log圖表上(參見圖4)時，其 傳遞函數(shù)呈現(xiàn)為一條直線。圖4中的數(shù)據(jù)來自Hamamatsu Photonics K. K1994年的《光電 倍增管-理論到應(yīng)用》。如早先所述的，內(nèi)部倍增電極的數(shù)量和施加的偏置電壓決定PMT的電流放大。對 于固定的光級別，如等式1中所示，輸出電流與V的N次冪成比例，其中V是施加的偏置電 壓，N是內(nèi)部倍增電極的數(shù)量，而A是包含了 PMT的若干物理性質(zhì)的比例常數(shù)。i = A*Vn (1)對等式1的兩邊取對數(shù)，得到以下等式log(i) = N^log(V)+log (A) (2)該式可以被寫成簡單和常見的一階線性等式y(tǒng) = m*x+b (3)其中y = log(i)，m = N,χ = Iog(V)，b = Iog(A)。使用對數(shù)轉(zhuǎn)換后，現(xiàn)在就有可 能僅采用三個樣本測量來執(zhí)行縮短的校準(zhǔn)操作。例如，在一個實(shí)施例中，一種用于控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù) 的方法包括將測量系統(tǒng)的PMT的電壓設(shè)置為第一值和第二值。該方法還包括測量在第一值 和第二值的PMT的輸出電流。此外，該方法包括從第一值和第二值的對數(shù)對第一值和第二 值下的輸出電流的對數(shù)來確定PMT的校準(zhǔn)電壓。該方法還包括將校準(zhǔn)電壓施加到PMT上， 并且對PMT進(jìn)行測試以確定該P(yáng)MT的一個或多個參數(shù)是否在預(yù)定的容差之內(nèi)。以下由步驟1-7概括出這種方法的一個具體的例子1.將PMT電壓設(shè)置為最接近于或位于其范圍的低端的值(V = Vl)，并且獲得一個 測量值α = iL)。2.將PMT電壓設(shè)置為最接近于或位于其范圍的高端的值(V = Vh)，并且獲得一個 測量值α = iH)。3.對所有四個值取對數(shù)。4.計算斜率m和截距b。
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5.求解目標(biāo)PMT設(shè)置(在對數(shù)空間內(nèi))xcal。6.取x。al的反對數(shù)以獲得PMT校準(zhǔn)電壓Vcal。7.施加V。al，并測試來確定是否滿足期望的容差。該方法已經(jīng)過檢驗(yàn)，每次均可成功地收斂在容差之內(nèi)。如果沒有滿足容差，可以通 過采用先前計算所得的v。al，ical和VH，iH在對數(shù)空間生成新的斜率和截距，這樣可能獲得可 接受的結(jié)果。點(diǎn)v。al，i。al可能相對接近最終的PMT電壓，只需要煙新的線進(jìn)行較短的遍歷 (traversal)即可產(chǎn)生可接受的結(jié)果。在這種情況下，四個樣本測量將被用于尋找適當(dāng)?shù)男?準(zhǔn)電壓。另一種用于校準(zhǔn)流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的探測器的方法使用逐次逼近法有利地 減少了校準(zhǔn)迭代的次數(shù)。在一個實(shí)施例中，一種用于控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或 多個參數(shù)的方法包括使用逐次逼近法來確定測量系統(tǒng)的探測器的校準(zhǔn)電壓，如圖5中步驟 50所示。當(dāng)所有的校準(zhǔn)電壓都已被施加到探測器上卻仍未獲得成功的校準(zhǔn)時，該方法將以 失敗退出校準(zhǔn)，如步驟52中所示。由于探測器可以是APD、PMT、或者任何其它適用于該測 量系統(tǒng)的探測器，每個探測器電壓可與探測器電壓限值進(jìn)行比較，如步驟54中所示。如果 校準(zhǔn)電壓超過了該電壓限值，可以通過至少重復(fù)步驟50來確定一個不同的校準(zhǔn)電壓。如步驟56、58以及60中所示的，該方法將校準(zhǔn)電壓施加給探測器，從探測器收集 數(shù)據(jù)，并可包括構(gòu)件收集到的數(shù)據(jù)的直方圖，計算直方圖的峰值，并且將直方圖峰值和校準(zhǔn) 目標(biāo)峰值進(jìn)行比較。如果直方圖峰值足夠接近于校準(zhǔn)目標(biāo)峰值，校準(zhǔn)就可終止，如步驟62 中所示。該方法還可包括確定直方圖峰值是否在校準(zhǔn)目標(biāo)峰值之上，如步驟64中所示。步 驟64的輸出可被用于修正由步驟50中的逐次逼近法所產(chǎn)生的下一個校準(zhǔn)電壓。盡管該方法在上文中相對于直方圖進(jìn)行了描述，但應(yīng)該理解的是，可以采用任何 合適的統(tǒng)計測量來進(jìn)行該方法。例如，確定探測器信號級別的任何適當(dāng)方法都可以被采用， 這些方法可(但不需要)包括從小珠樣本的集合來確定測量的統(tǒng)計方法，比如平均數(shù)，中值寸。特別是，逐次逼近法通過設(shè)置和清除命令字中的位，只嘗試多達(dá)N次來使得測得 的值等于目標(biāo)值。在一個實(shí)施例中，該方法可包括收集和處理探測器樣本來確定探測器信 號級別。在另一個此類實(shí)施例中，該方法可包括將探測器信號級別和校準(zhǔn)目標(biāo)信號級別進(jìn) 行比較，如果探測器信號級別高于校準(zhǔn)目標(biāo)信號級別，則降低探測器偏置電壓并重復(fù)對校 準(zhǔn)電壓的確定。在又一個此類的實(shí)施例中，該方法可包括將探測器信號級別和校準(zhǔn)目標(biāo)信 號級別進(jìn)行比較，如果探測器信號級別不在校準(zhǔn)目標(biāo)信號級別的預(yù)定范圍以內(nèi)，則重復(fù)對 校準(zhǔn)電壓的確定，直至所有所期望的探測器電壓級別都已被嘗試過為止。這樣一種方法的一個具體的例子包括以下步驟1.將位掩碼(bit mask)和DacCmd值初始化為2N。對于12位Dac (“數(shù)字-模擬 轉(zhuǎn)換器”)，N = 12。在此例中，位掩碼=4096，DacCmd值=4096。該Dac可包括任何適當(dāng) 的Dac，例如可從馬薩諸塞州的諾伍德市的模擬設(shè)備有限公司(Analog Devices, Inc.)購 得的Dac。2.使用當(dāng)前的掩碼位來清除DacCmd中相應(yīng)的位。我們驅(qū)動要么超出目標(biāo)，要么超 出探測器最大電壓限值。
3.將掩碼向右移一位(例如，移動到下一個最高有效位)。4.如果掩碼是0，則所有可能的位已經(jīng)被檢測而還沒有獲得充分的校準(zhǔn)。該方法 可進(jìn)行到步驟12。5.將掩碼和DacCmd相或以設(shè)置下一個最高有效位。6.確定對應(yīng)于DacCmd 二進(jìn)制值的探測器電壓。將該探測器電壓和探測器擊穿電 壓或者最大電壓相比較。如果該電壓超過了探測器擊穿電壓，則回到步驟2。7.將DacCmd值(例如，所述電壓)發(fā)送給測量系統(tǒng)。8.等待電壓變化生效。9.將新的直方圖峰值和該通道的校準(zhǔn)目標(biāo)峰值進(jìn)行比較。如果直方圖峰值大于校 準(zhǔn)目標(biāo)，則返回步驟2。10.如果直方圖峰值并不充分接近期望目標(biāo)，則返回步驟3。11.校準(zhǔn)通過。方法結(jié)束。12.校準(zhǔn)失敗。方法結(jié)束。在步驟1-12中所描述的示例性方法可包括此處所述的任何其它步驟。某些流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)在小珠流經(jīng)兩個探測窗口時使用流體靜力聚焦技術(shù) 將其分離出來進(jìn)行個別測量。測量窗口具有固定的大小和物理間隔。例如，在測量系統(tǒng)中 的光源照射點(diǎn)之間的距離定義了所述間隔。底層液體傳送體的速度的變化會改變小珠位于探測窗口內(nèi)的時間的長度，以及從 一個窗口到下一個窗口的間隔時間的長度。最終的讀數(shù)與小珠存在于每個探測窗口內(nèi)的 時間的長度是成比例的。此外，系統(tǒng)還使用窗口內(nèi)傳送時間來確定第二探測窗口何時有效 (即小珠何時位于第二探測窗口中以待測量)。如果樣本測量和實(shí)際小珠存在在時間上的 對準(zhǔn)不同于在校準(zhǔn)期間所獲得的值，或者在照明窗口中的持續(xù)(停留)時間不同，測量的精 度就會下降。如果測量系統(tǒng)被配置為在樣本微球體的測量過程中維持液體的壓力大致恒定，則 溫度的效果對于液體的速度變化造成的影響最大。粘度定義是液體的流動阻力的度量。每 單位時間內(nèi)以壓力P流經(jīng)直徑R、長度L的管子的液體的容積可以由泊肅葉(Poiseuille) 等式來表示V/T = (31 *R4*P) / (8*N*L) (4)其中V/T是單位時間的容積(與速度成比例)，而N是以泊(poise)為單位的粘 度。流動艙的毛細(xì)管，雖然其尺度為矩形而不是圓形，但可以被視為簡單的管子。所以，如 泊肅葉等式中所定義的，小珠速度與液體傳送體的粘度成反比例。用作流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的小珠傳送體的液體的主要成分是水。在15°C到 30°C的操作溫度范圍內(nèi)，粘度由1. 139厘泊變化到0. 7975厘泊，其具有43%的顯著變化。 以上的粘度值是從第61版的《物理化學(xué)手冊》(Handbook of Chemistry & Physics)中的 “水在0到100°C之間的粘度”(The Viscosity of Water 0 to 100°C )中所得的。護(hù)層 (sheath)和樣本液體的速度如小珠的速度一樣也變化了大約43%。因此，操作溫度可以被 測量，然后被用于確定液體的粘度。相應(yīng)地，可以從表、泊肅葉等式、或者速度-溫度的預(yù)定 值來確定液體的速度。在此類實(shí)施例中，該方法可包括基于速度在樣本微球體的測量期間 控制液體的壓力。
此外，液體的速度可以被用于確定小珠速度。同樣，傳送時間可以被實(shí)時地提取并 校正。如果液體的溫度在樣本測量過程中基本上沒有變化，對溫度的監(jiān)測和對速度的確定 可以在測量系統(tǒng)對樣本微球體進(jìn)行測量之前進(jìn)行。然而，該方法的這些步驟也可以實(shí)時地 進(jìn)行。相應(yīng)地，用于控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的一個方法包括對將 流經(jīng)流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的液體的溫度進(jìn)行監(jiān)測。樣本微球體被置于該液體中。該方法 還包括根據(jù)在所述溫度下的液體的粘度來確定測量系統(tǒng)中的樣本微球體的速度。在一些實(shí) 施例中，該方法還包括基于所述的速度確定樣本微球體的其中之一將出現(xiàn)在測量系統(tǒng)的探 測窗口中的時間長度。在另一個實(shí)施例中，該方法包括基于所述的速度確定其中一個樣本 微球體從測量系統(tǒng)的一個探測窗口移動到另一個探測窗口的時間長度。此外，該方法可包 括基于所述的速度確定何時其中一個樣本微球體會出現(xiàn)在測量系統(tǒng)的探測窗口中。而且， 該方法可包括控制測量系統(tǒng)的一個或數(shù)個探測窗口的采樣間隔，從而對速度進(jìn)行補(bǔ)償。窗口內(nèi)傳送時間可以被測量，并保存在系統(tǒng)的非易失性存儲器中，或者保存到在 初始校準(zhǔn)過程中對系統(tǒng)進(jìn)行控制的計算機(jī)中。所測得的傳送時間然后可以被用于后續(xù)的樣 本運(yùn)行中以適當(dāng)?shù)貙Φ诙綔y窗口的采樣間隔進(jìn)行定時。窗口內(nèi)傳送時間可以被縮短或者 延長以補(bǔ)償粘度變化。校準(zhǔn)系統(tǒng)時的溫度與當(dāng)前溫度相對可用于確定要施加的校正量。溫 度對粘度因子的簡表可以被存儲在對系統(tǒng)進(jìn)行控制的計算機(jī)或者系統(tǒng)的非易失性存儲器 中。在任一情況下，傳送時間校正因子可以從所述的表計算而得，并且在樣本運(yùn)行開始之前 施加。作為選擇，任何其它在本領(lǐng)域內(nèi)已知的適當(dāng)方法也可被用于確定校正因子。該方法還可以包括根據(jù)速度確定測量系統(tǒng)的輸出信號的一個或多個特性。例如， 小珠存在于探測窗口中的時間長度決定了探測器的輸出電脈沖的幅度和形狀。脈沖然后經(jīng) 過模擬低通濾波器，所述濾波器具有減小幅度和展寬脈沖寬度的顯著效果。經(jīng)濾波后的脈 沖被數(shù)字化，脈沖下的區(qū)域被計算以得到與光級別大致成比例的值。此外，該方法可包括使用校正因子對輸出信號由于速度所致的誤差進(jìn)行校正。所 述校正因子可以使用經(jīng)驗(yàn)測量值來確定。采用經(jīng)驗(yàn)測量值來構(gòu)建用于由流速變化所致的脈 沖寬度變化的校正因子的表是顯而易見的。這張表可以被存儲在系統(tǒng)的存儲器中，或者是 連接到系統(tǒng)的控制計算機(jī)中。另一種對由于溫度變化所致的速度變化進(jìn)行補(bǔ)償?shù)姆椒ㄊ前凑照扯鹊淖兓辣?例地改變施加的液體壓力。這會使得速度維持恒定，因此在每個測量窗口內(nèi)，或者其之間的 時間不會有明顯的變化?？梢詫?shí)時地或在樣本運(yùn)行開始時實(shí)時地使用泊肅葉等式，或者經(jīng) 由從泊肅葉等式所計算出的預(yù)定表，或者通過其它的方法來進(jìn)行該方法，從而動態(tài)地設(shè)置 合適的壓力。這些方法已經(jīng)證明對恒定壓力方案提供了很大的改進(jìn)，不過，可能希望對于溫度 變化的其它補(bǔ)償。所以，此處描述了另一種方法，其可以與上述方法分開使用，或與上述方 法結(jié)合使用，來提供一種微調(diào)機(jī)制。與上述的方法不同，該方法采用光學(xué)機(jī)制。此外，該方 法可以使用測量和控制算法。然而，如此處所述的，撇開所附加的光學(xué)機(jī)制和算法不談，該 方法相對來說是便宜和快捷的。當(dāng)流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的光學(xué)元件被裝配時，照明點(diǎn)(例如，激光點(diǎn))之間的距 離被初始地設(shè)置。隨著照明點(diǎn)(例如，或者是光束)間的距離減少，由于小珠在探測窗口間移動的距離較短，速度變化對于小珠傳送時間的影響被最小化。由每個光束的垂直光照分布(profile)(即在與微球體流經(jīng)測量系統(tǒng)的方向大致 平行的方向上的每個光束的分布)來進(jìn)一步定義最小的間隔距離。例如，如果光束強(qiáng)度自 峰到肩迅速地減小，而且沒有第二最大值，就有可能將光束彼此相對接近地放置，因?yàn)閺囊?個光源出來的光不會溢出到其它的光照點(diǎn)中。需要留意以避免交迭光束，因?yàn)檫@樣的交迭 會導(dǎo)致在分類和指示器通道之間需要采用復(fù)雜的補(bǔ)償方案，從而就造成了靈敏度降低。如前所述的，重要的是保持照明點(diǎn)之間的小珠傳送時間基本恒定，該時間又基本 上使速度以及微球體在各自的照明窗口內(nèi)所花費(fèi)的時間固定。用于使小珠傳送時間維持基本恒定的一個方法涉及實(shí)時地測量一個小珠通過兩 個探測窗口的平均時間，并且按需控制施加的壓力以保持傳送時間恒定。根據(jù)一個實(shí)施例， 一種用于控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的方法包括對微球體從流式細(xì)胞 計型測量系統(tǒng)的第一探測窗口運(yùn)動到測量系統(tǒng)的第二探測窗口的時間進(jìn)行測量。在一個實(shí) 施例中，該時間可以是平均時間。所述微球體可以是樣本微球體或者是校準(zhǔn)微球體。對時 間的測量可包括測量在第一和第二探測窗口中被微球體所散射的光。在另一個實(shí)施例中， 對時間的測量可包括用一個探測器測量在第一和第二探測窗口中被微球體所散射的光。在 一個此類實(shí)施例中，在第一和第二探測窗口中被微球體所散射的光被一個分光器導(dǎo)向一個 探測器。該方法還包括改變測量系統(tǒng)的施加壓力，從而使得時間基本恒定。該方法可以實(shí) 時地操作。如上所述的實(shí)施例可以包括此處所述的任何其它步驟。不幸的是，大多數(shù)流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的當(dāng)前的光學(xué)設(shè)計使得其不可能對通過 第二探測窗口的每個小珠進(jìn)行探測，其中在第二探測窗口通常只有指示器熒光被測量，這 是因?yàn)闊晒獍l(fā)射(它是無法預(yù)先得知的)不會對于各個小珠都恒定，而且對于某些小珠而 言非?？赡苁橇恪Ｃ黠@的解決之道是增加另一個光學(xué)探測器來測量由小珠所散射的第二光 照源的光，不過這會對系統(tǒng)增加顯著的成本，因?yàn)闉榱颂幚硇滦盘?，需要增加額外的電子和 數(shù)字處理鏈。所建議的方法則既簡單又便宜，因?yàn)槠渖婕暗氖窃趦蓚€探測窗口中采用同一個散 射光探測器來測量散射。由于當(dāng)前的光學(xué)布局防止了第二(指示器)窗口中的散射光到 達(dá)散射探測器，因此必須重新置放探測器以使得其接收由小珠發(fā)射或者反射的所有光。這 一步完成后，可由下游的電子設(shè)備分別辨認(rèn)出與來自每個光源的散射大致成比例的清晰的 峰。圖6描述了可以用于執(zhí)行此處所述的方法的測量系統(tǒng)的一個實(shí)施例。如圖6中所 示，測量系統(tǒng)包括光源70和72。光源70可以是例如發(fā)射的光波長大約為639nm的激光器。 該激光器可適用于為測量系統(tǒng)的分類通道提供光照。光源72可以是例如發(fā)射的光波長大 約為532nm的激光器。該激光器可適用于為測量系統(tǒng)的指示器通道提供光照。注意，每個 激光器的照射區(qū)域并非與小珠流動的軸(未示出)相重合。其它的光源也可被用于上述的 例子中。例如，依要被測量的樣本的不同，光源及其波長可以改變。如圖6中所示，光源70和72均照射試管74。特別地，光源70和72被配置為在小 珠76流經(jīng)試管74時對其進(jìn)行照射。如圖6中所進(jìn)一步示出的，光源70和72可以被配置 為以大致相對的角度來照射小珠。不過，應(yīng)該可以理解的是，光源可以以任何合適的角度對 小珠進(jìn)行照射。
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由于兩個光源的照射而被小珠所散射的光可以被透鏡78收集。透鏡78可以包括 本領(lǐng)域任何已知的合適的透鏡。此外，透鏡78可以由反射收集器(collector)所代替，或 者可以不包含在該系統(tǒng)中。雖然圖中顯示透鏡78以(相對于光源70和72)大約90°的收 集角來收集光，但應(yīng)該理解的是，透鏡可以被設(shè)置為與光源成任意合適的收集角度。被透鏡78所收集的光被引向分光器80。分光器80可包括本領(lǐng)域任何已知的合適 的光學(xué)組件，比如玻璃板或者是分光濾光器。分光器80被配置為將透鏡收集的光的一部分 引導(dǎo)給探測器82。探測器82可被配置為對由于兩個(或多個)光源的照射而被小珠散射 的光進(jìn)行探測。在這種方式下，相對如前所提供的光源的例子而言，探測器82可被配置為 探測由小珠所散射的、波長大約為532nm和639nm的光。該探測器可包括本領(lǐng)域任何已知 的合適的探測器，比如CXD器件。探測器82因此將探測單個小珠的兩個不同的散射信號。這些散射信號在不同的 波長下被探測，所述波長則基于光源的波長來決定。由于在小珠通過試管時，每個光源在不 同時間內(nèi)照射小珠，則不同的散射信號被探測的時間就可以被用來測量小珠或者微球體從 測量系統(tǒng)的第一探測窗口移動到測量系統(tǒng)的第二探測窗口的時間。此外，分光器80被配置為傳輸透鏡所收集的光的其它部分。被傳輸?shù)脑摬糠止饪?被光學(xué)組件84引導(dǎo)給系統(tǒng)的探測子系統(tǒng)的分類部分86。光學(xué)組件84可以包括例如折疊式 反射鏡、分光濾光器、局部透光鏡、或者本領(lǐng)域已知的其它合適的組件?；蛘?，取決于諸如探 測子系統(tǒng)的分類部分的布置等因素，光學(xué)組件84可以不被包含在系統(tǒng)中。所述探測子系統(tǒng) 的分類部分可包括本領(lǐng)域任何已知的組件。在某些實(shí)施例中，探測子系統(tǒng)的分類部分可以 如圖1所述的那樣配置。被分光器80所傳送的另一部分光可以被引導(dǎo)給探測子系統(tǒng)的指 示器通道(未示出)。盡管該系統(tǒng)使用第一照射區(qū)域用于分類，使用第二區(qū)域用于指示器信 號，不過在采用了該技術(shù)的設(shè)備中的使用方式不局限于這些實(shí)施例。熒光或者散射光可以 被用于另一種用途，例如，對熒光指示器或者在細(xì)胞、小珠及其它粒子中的其它染料進(jìn)行測 量。被分光器80引導(dǎo)給探測器82的熒光發(fā)射(如果其存在的話)將被加到散射信 號，但其作用不是很重要，因?yàn)槠浞冗h(yuǎn)小于散射光的幅度。如上所述的，圖6中所示的實(shí) 現(xiàn)方法采用分光器80，其可以是波長分光器，它將散射的光重新引導(dǎo)給位置重置的探測器 而不改變施加給分類探測器的光譜。顯然，其它的實(shí)施例也是可能的。例如，可以想像，可 以將探測器安排成使得不包含額外的部件。圖6所示的系統(tǒng)還可以進(jìn)一步依此處所述進(jìn)行 配置。一種用于控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的方法的另一個實(shí)施例 包括測量微球體從流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的第一探測窗口移動到測量系統(tǒng)的第二探測窗 口的平均時間。微球體可包括樣本微球體、校準(zhǔn)微球體、或者二者兼而有之。該方法還包 括將平均時間和參考時間進(jìn)行比較，所謂參考時間就是參考微球體從第一探測窗口移動到 第二探測窗口的時間。該方法可以包括對參考時間的測量，也可以不包括這一步。此外，該 方法包括，如果平均時間和參考時間的差異大于預(yù)定值，則改變測量系統(tǒng)的施加壓力。在一 些實(shí)施例中，可選擇該預(yù)定值來補(bǔ)償測量系統(tǒng)的已知的時間變化機(jī)制。在一個實(shí)施例中，改 變施加的壓力包括，如果平均時間大于參考時間，則提高施加的壓力。在一個不同的實(shí)施例 中，改變施加的壓力包括，如果平均時間小于參考時間，則降低施加的壓力。該方法同樣可以實(shí)時地進(jìn)行。上述的方法提供了一種直接地控制系統(tǒng)壓力從而使得連續(xù)的散射脈沖之間的時 間大致恒定的技術(shù)。利用由數(shù)字信號處理器或者其它合適的處理器所測得的采樣信號，使 用電子硬件(例如，計數(shù)器、數(shù)字比較器，等等)或軟件可實(shí)現(xiàn)該技術(shù)。在任一實(shí)施例中，該 方法是模擬的，得到相同的結(jié)果。以下在步驟1-6中提供該算法的高級描述，脈沖群的例子 示于圖7。1.當(dāng)在已知的壓力和溫度下校準(zhǔn)系統(tǒng)時，測量連續(xù)的散射脈沖峰之間的平均傳送 時間，并保存以便以后參考。2.在正常樣本獲取過程中，來自紅色激光器(或者第一個照射小珠的任何其它光 源)的第一散射脈沖啟動計時器。例如，如圖7中所示，在、時刻，對應(yīng)于具有639nm波長 的激光器照射的散射脈沖被探測到。因此，計時器開始于、。3.當(dāng)?shù)诙⑸涿}沖到達(dá)時，計時器停止。例如，如圖7中所示，當(dāng)對應(yīng)于具有532nm 波長的激光器照射的散射脈沖在t2時刻被探測到時，計時器停止。4.計時器的值隨后被用于和在校準(zhǔn)操作期間所測得的傳送時間相比較。5.如果計時器值明顯高于校準(zhǔn)時間，則壓力源(例如，泵)的一個或多個參數(shù)會被 改變以增加其壓力。壓力源的參數(shù)可以由處理器來改變?；蛘撸绻?、和、的差大于t。al， 則可增加壓力源的壓力。t。al可以是定義小珠的傳送時間的可接受變化量的預(yù)定值。6.如果計時器值明顯低于校準(zhǔn)時間，則壓力源的一個或多個參數(shù)會被改變以降低 其壓力。所述一個或多個參數(shù)可以由處理器來改變?；蛘?，如果、和、的差小于t。al，則壓 力源的壓力可以被減小。步驟5和步驟6中所用的t。al具有相同值。為了保持該“控制系統(tǒng)”相對穩(wěn)定，有以下若干情況可被加以考慮。例如，可以進(jìn) 行該方法使得系統(tǒng)不被控制為對經(jīng)過系統(tǒng)的每個小珠事件嘗試或作出正向或者反向的壓 力校正?？梢圆捎媚承┢骄椒▉硌a(bǔ)償被稱為“小珠抖動(bead jitter)”的已知時間變化 機(jī)制，該機(jī)制被認(rèn)為至少是部分地由樣本核心的速度梯度造成的。而且，應(yīng)當(dāng)謹(jǐn)慎地選擇引 起壓力校正的時間誤差的閾值。誤差的幅度最好作為決定壓力校正量的控制器的輸入。很 可能的是可使用經(jīng)典的積分一差分控制器來用于良好的操作。雖然以上列舉的校正因子可以被用于在樣本微球體的測量之前對測量誤差的主 要部分進(jìn)行校正，但在測量過程中也可以進(jìn)行精細(xì)校正以補(bǔ)償實(shí)施了上述技術(shù)之后可能存 在的殘留誤差。例如，用于控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的一個方法包括 在測量系統(tǒng)對樣本微球體進(jìn)行測量時監(jiān)測測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)。該方法還包括基于 監(jiān)測到的參數(shù)實(shí)時地改變一個或多個參數(shù)。例如，如上所述，被監(jiān)測且被改變的一個或多個 參數(shù)可包括測量系統(tǒng)的PMT的參數(shù)。此外，使用該過程也可消除那些沒有在本說明書加以 標(biāo)識的誤差源。流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)基于測得的微球體內(nèi)的兩個或多個染料的亮度 (intensity)來識別通過系統(tǒng)的微球體。這一識別技術(shù)也可以被用于在所有通道中(指示 器通道和分類通道兩者)識別含有已知量的熒光強(qiáng)度的校準(zhǔn)微球體。在校準(zhǔn)微球體的測 量結(jié)果已知之后，可以將精細(xì)校正因子施加給指示器和/或分類通道以用于樣本微球體測量。在區(qū)分校準(zhǔn)微球體和樣本微球體時可能導(dǎo)致該技術(shù)復(fù)雜化。例如，校準(zhǔn)微球體的新的光譜地址可以基于染色級別組合而創(chuàng)建，但這會使得系統(tǒng)的多路處理能力降低N-I。另 一種技術(shù)通過使得校準(zhǔn)微球體的直徑大于或者小于樣本微球體的直徑而對其進(jìn)行識別。測量系統(tǒng)可以對被微球體所散射的和照射平面成90°角的光線進(jìn)行測量。散射 光的級別被用于識別那些可能粘在一起或者可能基本同時通過照射區(qū)域的多個微球體。例 如，散射光通常與存在于照射區(qū)域內(nèi)的所有粒子的體積成比例；因此，多個微球體要比單個 微球體的散射信號更強(qiáng)。由于大多數(shù)的微球體通常作為單個對象通過照射區(qū)域，通過考慮 群體事件，就容易識別不屬于單個小珠的那些事件。通常，兩個，有時為三個，微球體集合在 一起并產(chǎn)生比單個微球體所產(chǎn)生的信號要強(qiáng)的信號。單個微球體的散射信號級別通常在化 驗(yàn)進(jìn)展期間進(jìn)行，因?yàn)榛?yàn)形式對于散射信號會產(chǎn)生影響。較佳的情況下應(yīng)該采用直徑小于而不是大于樣本微球體的直徑的校準(zhǔn)微球體， 因?yàn)榭梢愿菀椎貙⑿?zhǔn)微球體從通過照射區(qū)域的任意多的微球體組合中區(qū)分出來。因 此，對測量設(shè)備的參數(shù)監(jiān)測可以采用直徑小于樣本微球體的直徑的校準(zhǔn)微球體的測量數(shù)據(jù) 來進(jìn)行。此外，被監(jiān)測和改變的一個或多個參數(shù)可以包括由測量系統(tǒng)的探測器所產(chǎn)生的輸 出信號，這些輸出信號響應(yīng)于由樣本微球體所散射的光。例如，如果校準(zhǔn)微球體直徑對樣本 微球體直徑的比率已知，就也有可能使用校準(zhǔn)微球體來對散射測量結(jié)果進(jìn)行微調(diào)。至少部分校準(zhǔn)微球體也可具有不同的光譜地址。如此，一系列不同的校準(zhǔn)微球體 可以被用于增強(qiáng)上述的校準(zhǔn)方法。例如，通過使用直徑作為第一區(qū)別點(diǎn)，校準(zhǔn)微球體的光譜 地址可作為校準(zhǔn)空間中的第二區(qū)別點(diǎn)，正如在樣本空間里那樣。具有多個校準(zhǔn)級別可用于 下面的實(shí)現(xiàn)中，這些校準(zhǔn)級別在分類空間內(nèi)被充分地分開以對微球體的身份加以辨別。例如，可被監(jiān)測和改變的一個或多個參數(shù)可包括樣本微球體的測量中的線性性。 監(jiān)測或改變測量設(shè)備的參數(shù)的測量可包括測量系統(tǒng)的分類通道的測量。在此實(shí)施例中，對 測量設(shè)備的參數(shù)的改變較佳地校正了測量中的任何非線性性。如此，多個校正級別可被用 于探測和校正分級空間中的非線性性。當(dāng)前的測量系統(tǒng)僅使用單點(diǎn)校準(zhǔn)，因此由于系統(tǒng)非 線性性所導(dǎo)致的誤差就不能被校正。在以二維表示的雙染料小珠系統(tǒng)中，該非線性性可以 被當(dāng)作基于分類微球體的被觀測的位置的平面中分類空間的變體。對非線性性的校正改進(jìn) 了該平面中的微球體分類精度。該技術(shù)可以類似效果被擴(kuò)展到任何維數(shù)。多個校準(zhǔn)級別也可以被用于探測和校正指示器信號的非線性性。類似于如上所述 的技術(shù)，指示器通道在目前的測量系統(tǒng)中也可能經(jīng)受單個校準(zhǔn)點(diǎn)。對指示器通道中的非線 性性進(jìn)行探測和校正可如上所述進(jìn)行操作。例如，在測量系統(tǒng)的參數(shù)被監(jiān)測和改變期間所 進(jìn)行的測量可包括對于測量系統(tǒng)的指示器通道的測量。而且，在測量系統(tǒng)的參數(shù)被監(jiān)測和 改變期間所進(jìn)行的測量可包括對于測量系統(tǒng)的指示器通道和分類通道的測量。如此，在分 類和指示器通道中的非線性性可以大致同時地被監(jiān)測和校正。在另一個例子中，可被監(jiān)測和改變的測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)包括測量系統(tǒng)的 動態(tài)范圍。例如，多個校準(zhǔn)級別也可被用于對系統(tǒng)的動態(tài)范圍進(jìn)行實(shí)時的確定。測量系統(tǒng) 具有有限的線性范圍。通過在一個或多個被唯一識別的校準(zhǔn)微球體上使用不同的指示器校 準(zhǔn)級別，就有可能識別出探測器的探測下限和/或上限，在下限和上限處系統(tǒng)由于信號削 波而變得非線性。在某些實(shí)施例中，多個校準(zhǔn)級別可被用于確定系統(tǒng)健康狀態(tài)分類。如此，被監(jiān)測和 改變的一個或多個參數(shù)可包括測量系統(tǒng)健康狀態(tài)。測量系統(tǒng)健康狀態(tài)可包括分類通道的健康狀態(tài)、指示器通道的健康狀態(tài)、或者二者兼而有之。例如，如果上述的各個方法的集合不 能就溫度或者其它效應(yīng)對系統(tǒng)進(jìn)行補(bǔ)償，校準(zhǔn)微球體熒光分類級別將會比其預(yù)期值更高。 可以設(shè)置一個閾值級別，而校準(zhǔn)微球體熒光分類級別可與該閾值相比較。如果校準(zhǔn)微球體 熒光分類級別落在閾值級別的選定的一側(cè)，可向系統(tǒng)操作者提供或者向耦合于測量系統(tǒng)的 計算機(jī)發(fā)送警告，告知測量結(jié)果是可疑的。所述警告可以是可視的輸出信號和/或音頻輸 出信號。在類似的方式下，多個校準(zhǔn)級別可以被用于確定指示器系統(tǒng)健康狀態(tài)。類似于對 分類系統(tǒng)健康狀態(tài)的確定，指示器系統(tǒng)中不可校正的誤差可以被識別并報告給系統(tǒng)操作者 或者與測量系統(tǒng)相連的計算機(jī)。而且，多個校準(zhǔn)級別可以被用于擴(kuò)展指示器通道的線性動態(tài)范圍。如此，改變測量 系統(tǒng)的參數(shù)可包括對測量系統(tǒng)的指示器通道的線性動態(tài)范圍加以擴(kuò)展。通過包含存在于非 線性區(qū)域內(nèi)的若干明亮級別的校準(zhǔn)微球體，有可能將實(shí)際測得的熒光級別映射到其線性等 價量上。通過在各個校準(zhǔn)微球體值之間內(nèi)插，可以從校準(zhǔn)數(shù)據(jù)構(gòu)造出從測得的曲線到期望 曲線的平滑映射。因此，如果采用該曲線對在非線性區(qū)域內(nèi)的樣本微球體進(jìn)行調(diào)整，系統(tǒng)的 線性的、可用的測量范圍可被顯著地擴(kuò)展。在以上描述中，已經(jīng)識別出若干測量誤差因素(contributor)以及分別針對它們 的實(shí)時校正技術(shù)。此外，還創(chuàng)建了一種使用小直徑校準(zhǔn)微球體的實(shí)時微調(diào)方法，其中所述的 校準(zhǔn)微球體可以被包含于微球體樣本混合物中。微調(diào)過程的附加特征包括對系統(tǒng)健康狀態(tài) 的實(shí)時識別、對一個或多個通道中的非線性的校正、以及對于測量系統(tǒng)的可用指示器動態(tài) 范圍的顯著擴(kuò)展。執(zhí)行諸如這里所述的方法的程序指令可通過載體介質(zhì)傳送或存儲于載體介質(zhì)上。 載體介質(zhì)可以是諸如導(dǎo)線、電纜、或無線傳輸鏈路、或沿諸如導(dǎo)線、電纜或鏈路傳播的信號 之類的傳輸介質(zhì)。載體介質(zhì)可以是諸如只讀存儲器、隨機(jī)存取存儲器、磁盤或光盤、或磁帶 之類的存儲介質(zhì)。在一個實(shí)施例中，處理器可以被配置為執(zhí)行程序指令以實(shí)行根據(jù)上述實(shí)施例的由 計算機(jī)所實(shí)現(xiàn)的方法。該處理器可以采取各種形式，包括采用數(shù)字信號處理芯片或現(xiàn)場可 編程門陣列的專用處理板、個人計算機(jī)系統(tǒng)、大型計算機(jī)系統(tǒng)、工作站、網(wǎng)絡(luò)設(shè)備、因特網(wǎng)設(shè) 備、個人數(shù)字助理(PDA)、電視系統(tǒng)、或者其它設(shè)備?？傊?，術(shù)語“計算機(jī)系統(tǒng)”可以被寬泛地 定義為包括具有一個或多個數(shù)字信號處理元件或者其它處理元件的任何設(shè)備。程序指令可以以各種方式實(shí)現(xiàn)，包括基于過程的技術(shù)、基于組件的技術(shù)、和/ 或面向?qū)ο蟮募夹g(shù)，以及其它技術(shù)。例如，程序指令可以采用ActiveX控件、C++對象、 JavaBeans,Microsoft Foundation Classes (“MFC”)、或者其它的技術(shù)或方法來按需實(shí)現(xiàn)。 在采用FPGA實(shí)現(xiàn)方式時，可以使用諸如VHDL的高級語言來設(shè)計嵌入于設(shè)備內(nèi)的信號處理 電路。從本揭示中受益的那些本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解到本發(fā)明被確信可以提供對流 式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)進(jìn)行控制的方法。在參考本說明書的情況下，本發(fā) 明的各方面的進(jìn)一步的修改以及替換實(shí)施例對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，本說明書要被理解為僅僅是示例性的，其目的在于教示本領(lǐng)域技術(shù)人員實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的 總方式。應(yīng)該理解的是，此處所示和所述的本發(fā)明的一些形式是當(dāng)前的優(yōu)選實(shí)施例。在受 益于本發(fā)明的說明書的教示之后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解，此處所提及和描述的元件和材料可以被替換，部件和過程可被保留，而且本發(fā)明的某些特征可以被單獨(dú)地使用。在不背 離如所附的權(quán)利要求書中所描述的本發(fā)明的精神和范圍的前提下，此處所述的元件可以被改變。
權(quán)利要求
一種用于控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的方法，包括對將要流經(jīng)流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的液體的溫度進(jìn)行監(jiān)測，其中樣本微球體被置于所述液體中；以及根據(jù)在所述溫度下的液體的粘度來確定測量系統(tǒng)中的樣本微球體的速度。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括基于速度確定樣本微球體之一將存 在于測量系統(tǒng)的探測窗口內(nèi)的時間長度。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括基于速度確定樣本微球體之一從測 量系統(tǒng)的一個探測窗口移動到測量系統(tǒng)的另一個探測窗口的時間長度。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括基于速度確定微球體之一何時將出 現(xiàn)在測量系統(tǒng)的探測窗口中。
5.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，還包括控制測量系統(tǒng)的一個或多個探測窗 口的采樣間隔從而對速度進(jìn)行補(bǔ)償。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的監(jiān)測和確定是在測量系統(tǒng)進(jìn)行樣本 微球體的測量之前進(jìn)行的。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，還包括根據(jù)速度確定測量系統(tǒng)的輸出信號 的一個或多個特性。
8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，還包括使用校正因子對輸出信號由于速度 所致的誤差進(jìn)行校正，其中所述的校正因子采用經(jīng)驗(yàn)測量值來確定。
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述測量系統(tǒng)被配置為在樣本微球體的測 量過程中維持大致恒定的液體壓力。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的確定包括從表來確定速度，其中該 方法還包括基于該速度在樣本微球體的測量過程中控制液體的壓力。
11.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述確定包括從泊肅葉等式來確定速度， 其中該方法還包括基于該速度在樣本微球體測量過程中控制液體的壓力。
12.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述確定包括根據(jù)速度的預(yù)定值與溫度的 相對關(guān)系來確定速度，其中該方法還包括基于該速度在樣本微球體測量過程中控制液體的 壓力。
全文摘要
本發(fā)明提供用于控制流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的一個或多個參數(shù)的各種方法。一個實(shí)施例包括在對樣本微球體進(jìn)行測量時監(jiān)測測量系統(tǒng)的參數(shù)。該方法還包括基于所述的監(jiān)測實(shí)時地改變所述參數(shù)。另一種方法包括對最接近于測量系統(tǒng)的溫度進(jìn)行監(jiān)測。一個這樣的方法包括利用經(jīng)驗(yàn)數(shù)據(jù)響應(yīng)于所述溫度而改變雪崩光電二極管的偏置電壓。一種不同的此類方法包括利用特征曲線響應(yīng)于所述溫度而改變光電倍增管的輸出。某些方法包括對將流經(jīng)流式細(xì)胞計型測量系統(tǒng)的液體的溫度進(jìn)行監(jiān)測，其中樣本微球體被置于所述液體中。該方法還包括根據(jù)所述溫度下液體的粘度來確定樣本微球體的速度。
文檔編號G01N15/14GK101923039SQ201010211078
公開日2010年12月22日 申請日期2004年8月13日 優(yōu)先權(quán)日2003年8月13日
發(fā)明者D·E·穆爾, W·D·羅斯 申請人:盧米尼克斯股份有限公司