專利名稱：一種應用代謝組學技術定量評價藥效的方法
技術領域：
本發(fā)明涉及藥效定量評價的新方法，具體涉及采用氣相色譜方法定量檢測人、動 物或細胞中內(nèi)源性小分子化合物、采用多變量數(shù)據(jù)處理方法計算數(shù)學模型、計算給藥組與 對照組相對距離作為藥效定量評價的方法。
背景技術：
長期以來，在藥理研究中，許多藥物的藥效依靠定性而非定量、主觀而非客觀、粗 略而非準確、片面而非全面的標準進行評價，這些方法的具體不足主要體現(xiàn)在1.量化指標缺乏藥效評價雖然采用了一㈣方便、有效的評價指標,如體重、血壓、 血糖、轉氨酶、血小板、細胞數(shù)目等，但還有許多藥物的藥效缺乏明確量化指標，以現(xiàn)有的方 法難以實施精確檢測和評價。例如疲勞程度、疼痛程度和鎮(zhèn)痛效果、機體排斥反應的強弱和 免疫抑制劑的效果，興奮、焦慮或作用于精神、神經(jīng)類藥物的藥效，心肌收縮力或胃腸道運 動是加強還是減弱；血管或支氣管是擴張還是收縮等。2.因缺乏客觀定量指標，許多藥效的評價只能采取主觀的人為評價或定 性，對這些藥效的評價不得不依靠定性方法(如組織切片、成像技術、各種電鏡檢查等)或 經(jīng)驗判斷或主觀感覺進行分級量化，使得藥效評判存在很大的主觀性和不確定性。3.片面件許多指標存在一定的片面件，R是反映了個別牛化功能、器官/組織的 狀態(tài)，缺乏整體的、系統(tǒng)的評價標準。如轉氨酶、肌酸酐、血沉等指標。4. 性一些評價方法對機體傷害大或費用昂貴，如活檢、介入、造影、斷層掃描 等，缺少損傷性小、經(jīng)濟方便的方法?？傊?，現(xiàn)有的許多藥效評價的方法局限性較大，缺乏定量標準、缺乏客觀性、全面 性、針對性和創(chuàng)新性，不利于對藥效進行定量、客觀和準確評價，成為嚴重制約藥理學研究 的巨大障礙和困擾藥理學研究的重大難題。亟需研究和創(chuàng)立方便、合理、應用廣泛的新藥效 評價方法。機體內(nèi)源性小分子物質(zhì)組是生命活動的基礎，機體的功能狀態(tài)必然反映在體內(nèi)代 謝組(內(nèi)源性小分子化合物總稱)上。研究表明，在疾病狀態(tài)下機體代謝功能和很多小分 子化合物水平明顯異常。而在藥物治療和機體康復過程中，隨著機體的各項功能逐漸恢復， 體內(nèi)小分子和代謝水平也逐漸得到調(diào)節(jié)或糾正。而代謝組調(diào)節(jié)或轉歸的程度與藥效強弱之 間具有顯著的相關性，即藥效越強、越好，機體的各項功能狀態(tài)/體內(nèi)小分子水平也越接近 正常(遠離疾病狀態(tài))；藥效越弱、越差，機體的各項功能狀態(tài)/體內(nèi)小分子水平也越靠近 疾病狀態(tài)(遠離正常狀態(tài))。利用合適的代謝組學檢測工具，可以檢測生物樣本中數(shù)百甚至上千個分子量小 于1000的各類小分子化合物。以GC/T0FMS測定為例，對很多化合物檢測靈敏度高達 10_12mol (絕對檢測限)，相對靈敏度達10_9mol/mL。這些化合物包括幾乎所有氨基酸、糖醇 類化合物、脂肪酸類、脂類、小分子有機酸類、核苷和嘌呤化合物、氨類化合物、神經(jīng)遞質(zhì)等 等，它們既是生命活動必需的原料，也是機體代謝產(chǎn)物/中間體，還是機體生長、發(fā)育、生物信號傳導和代謝循環(huán)的重要物質(zhì)基礎。與生命活動中起著極為重要作用的糖代謝、脂代謝、 三羧酸循環(huán)、尿素循環(huán)、氨基酸循環(huán)等密切相關。因此，檢測的體內(nèi)小分子的變化既可以系 統(tǒng)綜合地體現(xiàn)藥效作用的結果，還可以根據(jù)給藥前后樣品移動距離定量評價藥效。迄今為 止，還沒有利用代謝組學數(shù)據(jù)建立數(shù)學模型、計算給藥組與對照組相對距離對藥效進行定 量評價的報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術問題是利用代謝組學方法，全面、定量測定生物樣本中內(nèi) 源性小分子，得到的數(shù)據(jù)采用多變量數(shù)據(jù)處理方法建立數(shù)學模型，計算給藥組與對照組的 相對距離，以此定量數(shù)值作為藥效評價的指標，解決許多藥效缺乏準確定量評價方法的問 題。為解決上述問題，本發(fā)明提供如下技術方案，步驟包括樣品采集和處理采集臨床病人、模型動物、組織/細胞等各類生物樣本，通常為 血液、尿、體外培養(yǎng)的細胞或培養(yǎng)液；樣品經(jīng)過有機溶劑進行液_液提取，有機溶劑包括乙 酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、二氯甲烷、乙腈；或經(jīng)過蛋白沉淀，蛋白沉淀的方法包 括加入有機溶劑(如甲醇、乙醇、丙酮、乙腈、異丙醇)、各種酸堿鹽沉淀、加熱沉淀、過濾/超 濾、固相萃取等方法單獨或者綜合的方式進行處理；樣品可不進行干燥，或先干燥再利用各 類含有機溶劑和水相(單獨或者綜合，含鹽或者不含鹽)的溶媒溶解；樣品不進行衍生化或 者利用試劑進行衍生化處理。樣品分析和數(shù)據(jù)處理采用基于質(zhì)譜測定與色譜聯(lián)用的技術方法或核磁共振技術 的測定方法對上述樣品進行檢測，這些方法可以是液相色譜_質(zhì)譜、氣相色譜_質(zhì)譜、毛細 管電泳色譜-質(zhì)譜、核磁共振等；經(jīng)過數(shù)據(jù)處理后得到色譜圖中各個峰的定量數(shù)據(jù)，這個數(shù) 據(jù)可以是峰面積或峰高，或由峰面積或峰高計算得到的定量數(shù)據(jù)。本發(fā)明的一個突出優(yōu)點是上述檢測方法能檢測體內(nèi)大量小分子化合物，并以此為 基礎全面評價藥物作用效果/或機體的健康狀態(tài)。當藥效作用強時，整個代謝譜接近正常， 而藥效較弱時，代謝譜改變不明顯。圖1給出了高血壓大鼠(SHR)和正常大鼠(WKY)(血清 樣本)的GC/T0F-MS測定總離子流色譜圖，從色譜圖中可以看出，兩種大鼠的總離子流圖存 在差異，但這種目測觀察的方法只能作一個粗略、主觀的判斷，無法實現(xiàn)定量評價。數(shù)學模型建立和相對距離值的計算上述數(shù)據(jù)采用各種多變量數(shù)據(jù)處理軟件，可 以為SPSS、Mat lab、SIMCA-P等，選擇偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)、正交偏最小二 乘法(0PLS)、正交偏最小二乘法-判別分析(0PLS-DA)、主成分分析(PCA)、非線性映射 (Nonlinemapping, NLM)、聚類分析(HCA)等方法建立數(shù)學模型，獲取模型參數(shù)和樣品在多 維數(shù)學模型中的空間坐標，計算給藥組樣品與對照組相對距離。這里的多維空間可以是1、 2、3維，也可以是4、5、6甚至更多維空間。上述對照組可以是給藥前自身對照，也可以是未 給藥的模型組平行對照，還可以是未給藥的正常組對照。上述空間相對距離可以先取各組 樣品的坐標平均值，再計算得到，也可以先計算各個樣品之間距離，再取平均值得到。采用主成分分析(PCA)、偏最小二乘法_判別分析(PLS-DA)等投影分析的方法的 突出優(yōu)點是能方便、直觀地觀察各個樣品在多維空間模型中的相對位置，圖2顯示人參總 皂苷給藥能對高血壓模型大鼠(SHR)體內(nèi)異常的代謝狀態(tài)進行調(diào)節(jié)，使之逐漸趨近于正常大鼠(WKY)，體現(xiàn)藥物對高血壓大鼠代謝組的調(diào)節(jié)和糾偏作用。與上述總離子流圖一樣，這樣目視觀察的方法雖然被大量用于藥效的定性評判， 但其主要問題是無法量化，且結果判斷帶有主觀性。本發(fā)明的有益效果由于疾病狀態(tài)下機體代謝功能和小分子水平異常，在代謝組學上的表現(xiàn)就是遠離 正常組。經(jīng)過藥物治療，機體逐漸康復，代謝組學表現(xiàn)為接近正常、遠離疾??；藥效越強，越 接近正常、遠離疾??；而藥效越弱則遠離正常、接近疾病。1.利用代謝組學研究結果可以定量反映了藥物藥效，增強了客觀性和準確性，避 免了 一些藥效指標只能采用人為和主觀判斷的問題。2.利用代謝組學研究結果可以全面綜合地反映藥物藥效，避免了一些藥效指標只 反映局部藥效的問題。3.代謝組學的量化指標適用面廣，可適用于各類疾病藥效的定量評價。4.代謝組學的藥效評價方法采用血漿、尿等樣本，成本低、對機體傷害小。


圖1GC/T0F-MS測定高血壓大鼠(SHR)和正常大鼠(WKY)的總離子流色譜圖，從色 譜圖中可以看出，兩種大鼠的總離子流圖存在差異，但這種目測觀察的方法只能作一個粗 略、主觀的判斷，無法實現(xiàn)定量評價。圖2人參總皂苷給藥組、高血壓對照組和正常對照組在0、2、4、6、8周樣品分布散 點圖。人參總皂苷對高血壓大鼠不但顯示出明顯的降壓作用，而且經(jīng)過8周給藥，能對高血 壓模型大鼠(SHR)體內(nèi)異常的代謝狀態(tài)進行調(diào)節(jié)，逐漸趨近于正常大鼠(WKY)，從直觀上可 以看出藥物對高血壓大鼠代謝組的調(diào)節(jié)和糾偏作用。與上述總離子流圖一樣，這樣目視觀 察的方法雖然被大量用于藥效的定性評判，但其主要問題是無法量化，且結果判斷帶有主 觀性。
具體實施例方式本發(fā)明通過下面的實施例進行詳細的解釋，但并不意味著本發(fā)明僅限于此。實施實例人參總皂苷對高血壓大鼠代謝組的調(diào)節(jié)作用1.實驗方案和樣品采集8周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)適應性飼養(yǎng)兩周，從第10周開始給予人參總皂苷 30mg/kg/d(i.p)，至18周停止給藥，停藥后2周內(nèi)繼續(xù)測定血壓。另外一組SHR大鼠和正 常大鼠(WKY)給予以生理鹽水作為模型對照和正常對照。每周尾套法測各組血壓，每兩周 采血一次，每次0. 3ml，血液在37°C水浴靜置lh，3500rpm離心后收集上層血清，-80°C保存， 一部分用于血清生化分析，另一部分用于代謝組學的測定，采血前大鼠禁食12小時。結果血壓測量結果顯示正常WKY大鼠在實驗期間內(nèi)血壓保持正常平穩(wěn)，高血壓 SHR大鼠血壓顯著高于正常大鼠(p < 0. 01)，并有持續(xù)緩慢升高趨勢，而人參總皂苷給藥組 血壓逐漸緩慢下降，即使停藥2周血壓仍然維持在較低水平，顯示出持久的降壓作用。人參 總皂苷給藥組、高血壓對照組與正常對照組血壓測定結果見表1。
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2.樣品處理冷凍血清在37°C水浴解凍20min，渦旋振蕩后，取50 yl加入200 u 1含有穩(wěn)定 同位素13C的內(nèi)標肉寇酸的甲醇溶液(12. g/ml)，渦旋振蕩3min，4°C冰箱靜置1小時， 19600g和4°C離心lOmin，取lOOiil上清液于GC小瓶中，減壓揮干。向GC小瓶中加入30yl 甲氧胺吡啶溶液(10mg/ml)，渦旋振蕩3min，室溫下靜置16h進行肟化。加入30 yl三甲基 硅烷基三氟乙酰MSTFA (含1 % TMCS作為催化劑)，渦旋振蕩lmin，室溫靜置lh進行衍生化 反應，最后再加入30 u 1外標甲基肉寇酸酯的庚烷溶液(30 u g/ml)，混合后進行GC-T0F/MS 檢測。3. GC/T0F-MS 測定儀器氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(GC/T0F-MS)檢測系統(tǒng)(GC :Angilent 6890N氣相 色譜儀，配備Angilent 7683B自動進樣器和G2614A型100位樣品進樣盤；TOF-MS :Pegasus III，Leco, USA)。色譜條件色譜柱是DB-5石英毛細管柱(10mX0. 18謹i. d.，J&ff Scientific, USA)，進樣量lyl，采用不分流進樣模式；載氣氦氣；恒流速度lml/min ；程序升溫模 式70°C保持2. Omin，然后以35°C /min線性勻速線性升溫至305°C，保持2. Omin。質(zhì)譜條件進樣口溫度250°C ；清洗時間和流速lmin，20ml/min ；傳輸管溫度 250°C ；離子源溫度200°C ；離子源電壓和電流_70eV，3. OmA ；MS采用全掃描方式進行數(shù)據(jù) 采集，MS采用全掃描方式進行數(shù)據(jù)采集；掃描范圍m/z 50-800 ；掃描速度20Spectra/S ； 檢測電壓為-1690v。測定結果在上述檢測條件下可獲得樣品的GC/T0F-MS總離子流色譜圖(圖1)。 利用儀器自帶的軟件(ChromaTOF 2.00)可提取各個測定樣品色譜圖中每個色譜峰峰面 積，組成一個由峰面積組成的數(shù)據(jù)矩陣，該數(shù)據(jù)矩陣包括人參總皂苷給藥組、高血壓模型組 及正常組共84個樣品(為第一列)和154個色譜峰(為第一行)，保存在excel文件中。4.數(shù)學模型建立和相對距離值的計算將上述數(shù)據(jù)調(diào)入多元數(shù)據(jù)分析軟件SIMCA P-ll(Umetrics AB，UmeS，瑞典)中，利 用數(shù)據(jù)內(nèi)在關系投影-偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)計算數(shù)學模型，確定模型的主成分 數(shù)目為2，該數(shù)學模型即為一個2維空間模型，每個樣品都是此空間中的一個點，其位置由x 和y坐標參數(shù)所決定。由上述模型可以得到各個樣品在此模型的平面坐標中的分布圖，圖 2。提取每個樣品在模型中的空間坐標參數(shù)，按照下列公式(1)計算每組樣品x和y 坐標的平均值，再按照公式(2)、(3)計算給藥組與未給藥的高血壓對照以及未給藥的正常 對照組之間距離。另外，按照公式(4)可以計算出給藥組與同期高血壓模型組及正常組距 離的相對比值，表示用藥對高血壓大鼠體內(nèi)代謝組的調(diào)節(jié)程度/即藥效強弱。公式1 Xi = (Xil+Xi2+Xi3+Xi4+Xi5+Xi6)/6Yi = (Yil+Yi2+Yi3+Yi4+Yi5+Yi6)/6Xi、Yi分別為給藥組第i周橫坐標和縱坐標平均值。其中Xil 6為1 6號樣 品橫坐標值；Yil 6為1 6號樣品縱坐標值。公式2
0131.7±1131.8士2128.3士3124.2±4123.3士5125.5±6124.6±7128.2士8120.5±9121.3土10128.3士
178.4士7.3183.3士7.7185.7士10.2189.3土7.7187.8士4.3191.5土4.4192.8士4.6193.0±5.0196.5土6.2197.3±9.4199.2士7.6
179.5土7.8186.4士9.4175.1士15.6177.7士9.4183.7士6.1*182.3士5.3**179.9士4.1**173.0士7.8**170.0土10.4 *176.6土8.0**183.9±6.0 **表2人參總皂苷給藥組(TG)與同期高血壓模型組(SHR)、正常組(C)之間相對距 離Sim = [ (Xi-Xim) 2+ (Yi-Yim)2]1/2Sim為給藥組與未給藥的高血壓模型(對照)組距離；Xim、Yim分別為第i周未給 藥的高血壓模型(對照)組X、Y坐標平均值。公式3 Sic = [(Xi-Xic)2+ (Yi-Yic)2]1/2Sic為給藥組與未給藥的正常對照組距離；Xic、Yic分別為第i周未給藥的正常對 照組X、Y坐標平均值。公式4 Rd = Sim/SicRd為給藥組與同期高血壓模型組及正常組距離的相對比值；Sim為給藥組與未給 藥的高血壓對照組距離；Sic為給藥組與未給藥的正常對照組距離。按照上述公式可以分別計算出給藥組與未給藥的高血壓對照組距離、給藥組與未 給藥的正常對照組距離以及給藥組與同期高血壓模型組及正常組距離的相對比值，結果見 表2。由表2給藥組與同期高血壓模型組或正常組距離結果可知，高血壓大鼠給藥后2、4、 6、8周，從初期靠近高血壓模型對照組、遠離正常對照組，逐漸轉變?yōu)檫h離高血壓模型對照 組、接近正常對照組。從給藥組與同期高血壓模型組及正常組距離的相對比值可更加明顯 看出給藥后高血壓大鼠逐漸遠離高血壓組、接近正常對照組，因此該相對距離方法明確定 量地表示了藥物對體內(nèi)代謝組調(diào)節(jié)的強弱，即定量反映了藥效作用。表1人參總皂苷給藥組、高血壓對照組與正常對照組血壓平均值(mmHg，n = 6)
實驗時
間正常對照組高血壓對照組 人參總皂苷給藥組
周 Mean 士 SDMean 士 SDMean 士 SD
o o 9 7 8
0.石 1.2.3 1. l,.oi C5.0 13416619116
7組別平均坐標 給藥組與同期高給藥組與同期高血壓
血壓模型組或正 模型組、正常組距離
周(n-6)XiYi .常組距離的相對比值2給藥高血壓大鼠2.35-2.094給藥高血壓大鼠-1.021.276給藥高血壓大鼠-0.804.468給藥高血壓大鼠-2.486.510正常大鼠(對照)-4.84-5.762正常大鼠(對照)-4.89-5.758.114正常大鼠(對照)-4.04-0.883.716正常大鼠(對照)-6.282.895.708正常大鼠(對照)-7.713.176.200高血壓大鼠(對照)5.74-3.8110. 76*2高血壓大鼠(對照)3.92-3.221.940. 2394高血壓大鼠(對照)3.84-1.325.511.4856高血壓大鼠(對照)5.322.186.531. 1468高血壓大鼠(對照)10.713.8713.462. 170
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權利要求
一種應用代謝組學技術進行藥效定量評價的方法所依賴的是儀器測定所得到的代謝組學數(shù)據(jù)，其特征包括以下幾個方面a)采用血清作為樣本進行檢測；b)采用甲醇沉淀蛋白的方法對血清中小分子進行提取；c)采用三甲基硅烷基三氟乙酰MSTFA的方法對樣本進行衍生化；d)采用氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(GC/TOF-MS)進行樣本分析；e)應用SIMCA P-11軟件和偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)建立數(shù)學模型；f)從多維空間數(shù)學模型中提取參數(shù)，計算用藥組和對照組之間相對距離。
2.除權利要求1中血清作為生物樣本外，生物樣本還可來源于人、動物、細胞、組織等， 具體包括全血、血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液、淚液、汗液、組織勻漿、細胞或細胞培養(yǎng)液。
3.權利要求2中上述生物樣本至少其中一組為用藥后采集生物樣本(給藥組)，一組 為對照組；對照組可以是給藥前自身對照，也可以是未給藥的模型組平行對照，還可以是未 給藥的正常組對照。
4.除權利要求1中甲醇沉淀蛋白的方法處理生物樣本外，還包括經(jīng)過其它蛋白沉淀方 法，如加入有機溶劑(如乙醇、丙酮、乙腈、異丙醇)、各種酸堿鹽沉淀、微波、加熱沉淀的方 法；或經(jīng)過有機溶劑進行液-液提取，有機溶劑包括乙酸乙酯、氯仿、乙醚、正丁醇、石油醚、 二氯甲烷、苯、正己烷、環(huán)己烷、乙腈；或過濾/超濾的方法；或固相萃取方法；或生物樣本不 經(jīng)過前處理的方法。
5.除權利要求1中采用氣相色譜-飛行時間質(zhì)譜(GC/T0F-MS)進行樣本分析外，還包 括其它任何基于質(zhì)譜測定技術、核磁共振測定技術和其它代謝組學測定技術的分析方法。
6.權利要求1中所得到的數(shù)據(jù)可以是絕對定量數(shù)據(jù)，也可以半定量數(shù)據(jù)，如峰面積、峰 高，或由此采用數(shù)學方法計算得到的數(shù)據(jù)。
7.除權利要求1中應用SIMCAP-11軟件和偏最小二乘-判別分析(PLS-DA)建立 數(shù)學模型的方法外，還包括其它代謝組學數(shù)據(jù)處理軟件，如SPSS、Matlab、SIMCA-P等各 類版本；包括選擇除偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)外的其它方法，如正交偏最小二 乘法(0PLS)、正交偏最小二乘法-判別分析(0PLS-DA)、主成分分析(PCA)、非線性映射 (N0nlinemapping，NLM)、聚類分析(HCA)等方法建立數(shù)學模型。
8.權利要求1中的數(shù)學模型可以為任意維空間模型，這里的多維空間可以是1、2、3維， 也可以是4、5、6甚至更多維空間。
9.權利要求1中用藥組和對照組之間相對距離可以有兩種計算方式，先取各組樣品的 坐標平均值，再計算得到；在有自身對照樣品時，也可先計算每個樣品給藥前后變化距離， 再取平均值得到。
10.權利要求9中藥效表示可以采用藥組和對照組之間相對距離，也可以是相對距離 的函數(shù)計算值，如常有對數(shù)值、自然對數(shù)值、平方值、平方根值等任何數(shù)學計算方式所得結
全文摘要
本發(fā)明公開了“一種應用代謝組學技術定量評價藥效的方法”。其特征在于利用基于質(zhì)譜、核磁共振等測定技術的代謝組學方法全面、定量測定生物樣本中小分子化合物，再采用多變量數(shù)據(jù)處理方法建立多維空間數(shù)學模型，計算給藥組與對照組的相對距離，以此作為藥效評價的定量指標，解決許多藥物藥效評價中缺乏定量評價指標的難題。與常規(guī)藥效評價的方法相比，該方法適應面廣、靈敏、取樣簡便、對機體無傷害，更全面、綜合地體現(xiàn)了藥效作用，可以為新藥研發(fā)和藥理研究中的藥效評價提供一種全面、可靠的定量評價方法。
文檔編號G01N30/72GK101799462SQ20101014186
公開日2010年8月11日 申請日期2010年4月8日 優(yōu)先權日2010年4月8日
發(fā)明者嚴蓓, 劉林生, 張穎, 曹蓓, 李夢婕, 查偉斌, 王廣基, 王新文, 石建, 趙春艷, 鄭天, 阿基業(yè), 陸益紅, 顧勝華, 黃青, 龔平 申請人:中國藥科大學