專利名稱：：基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)免疫層析試紙條的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種免疫層析試紙條，特別是涉及采用上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料即UCP作為生物標(biāo)記物的免疫層析試紙條。該種試紙條的結(jié)果在紅外光的照射下以可見光光信號的形式表現(xiàn)出來，并可使用上換發(fā)光生物傳感器進(jìn)行判讀，從而實現(xiàn)對目標(biāo)被檢物快速、靈敏的定性定量檢測。
背景技術(shù)：
：上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料(Up-ConvertingPhosphor,UCP)是一種可對能量進(jìn)行上轉(zhuǎn)的稀土金屬合成物，即UCP可吸收低能量的(長波長)紅外光，但卻發(fā)射高能量的(短波長)可見光。UCP是由幾種稀土金屬元素?fù)诫s于某些晶體的晶格中構(gòu)成的。在這種材料中有三種主要的成分主基質(zhì)(hostmatrix)、吸收子(absorber)和發(fā)射子(emitter)。作為主基質(zhì)的晶體材料有氧硫化物(如Y202S、Gd02S、La202S等)、氟化物(如YF3、GdF3、LaF3等)、鎵酸鹽(如YGa03、Y3Ga5012等)以及硅酸鹽(如YSi205、YSi307等)等；常用作吸收子的稀土金屬離子有鐿離子(Yb3+)、鉺離子(Er3+)、釤離子(Sm3+)等；常用作發(fā)射子的稀土金屬離子有鉺離子(Er"、鈥離子(Ho"、銩離子(Tm"、鋱離子(Tb3+)等。吸收子和發(fā)射子這一離子對在主基質(zhì)晶格內(nèi)適宜的空間取向和距離，是產(chǎn)生上轉(zhuǎn)換發(fā)光的基礎(chǔ)。不同的吸收子、發(fā)射子、主基質(zhì)結(jié)合可使UCP具有不同的光學(xué)性質(zhì)。如(l)主基質(zhì)相同的情況下，一系列UCP采用相同的吸收子，不同的發(fā)射子，則它可由相同波長的紅外光激發(fā)，產(chǎn)生不同波長的發(fā)射光(如980nm紅外光激發(fā)吸收子-Yb"-發(fā)射子-Er"、吸收子_Yb3+-發(fā)射子-Tm3+，分別發(fā)射550nm綠色可見光、475nm藍(lán)色可見光)；采用不同的吸收子，相同的發(fā)射子，則雖經(jīng)由不同的激發(fā)光，但卻可產(chǎn)生相同的發(fā)射光。(2)主基質(zhì)不同的情況下，UCP光譜特征也將改變(如吸收子_Yb3+-發(fā)射子_￡,，在主基質(zhì)YF3、GdF3中，分別發(fā)射紅色和綠色的可見光)。組成的多樣性決定了UCP光譜(激發(fā)光譜、發(fā)射光譜)的多樣性，這成為其使用中靈活性的基礎(chǔ)。本技術(shù)中所使用的UCP均由上海科炎光電技術(shù)有限公司提供。UCP作為一種完全惰性的無機(jī)材料經(jīng)過一系列的表面修飾與活化，其中包括UCP表面硅化、UCP表面氨基化、UCP表面功能化、UCP表面連接抗體，便能與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，在生物領(lǐng)域中充分的發(fā)揮其自身所具有的各種特性。目前，免疫層析技術(shù)中所使用的標(biāo)記物通常為酶、膠體金以及著色膠珠標(biāo)記物，這幾種標(biāo)記物應(yīng)用于免疫層析技術(shù)中有兩個共同點物理吸附交聯(lián)法與通過顏色判斷結(jié)果。其中物理吸附法(即通過疏水性以及靜電吸附制備標(biāo)記物)的脆弱性使得基于該種標(biāo)記物的免疫層析對于反應(yīng)的條件要求極為苛刻，從而一些有效的非特異去除試劑，如吐溫20(Tween20)、吹通100(Triton100)、十二烷基磺酸鈉(SDS)等，由于對疏水性以及靜電性的影響改變而只能在低濃度使用，由此便造成了基于該種標(biāo)記物的免疫層析試紙假陽性率、假陰性率較高的必然結(jié)果；另外通過顏色判斷結(jié)果在使用操作簡便的同時必然受觀察者主觀影響大、靈敏度低，且只能停留在定性水平，而絕對無法實現(xiàn)精確定量。這些缺點大大的限制了免疫層析技術(shù)在生物檢測中的應(yīng)用范圍。附圖1中描述了UCP顆粒在生物檢測領(lǐng)域中應(yīng)用的原理示意圖。將上轉(zhuǎn)換發(fā)光顆粒與生物活性分子通過共價鍵相連接制備標(biāo)記物，該標(biāo)記物在層析的過程中通過免疫反應(yīng)固定于固相載體的表面，并在紅外光的激發(fā)下發(fā)射出可見光。由此實現(xiàn)上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料與免疫層析技術(shù)相結(jié)合對生物樣品中的目標(biāo)被檢物進(jìn)行檢測。將上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP與免疫層析技術(shù)相結(jié)合，為傳統(tǒng)的免疫層析技術(shù)帶來了突破性的變革A.UCP發(fā)光標(biāo)記物的特點，使得以其作為標(biāo)記物的免疫層析試紙條可與儀器結(jié)合，對目標(biāo)被檢物進(jìn)行靈敏度極高的精確定量檢測；B.UCP所具有的多種特征光譜(激發(fā)光譜與發(fā)射光譜)，使得基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙可進(jìn)行靈敏度極高的多重分析，即一次性的對生物樣品中的多種目標(biāo)被檢物進(jìn)行檢測；C.UCP獨特的上轉(zhuǎn)換發(fā)光現(xiàn)象，使得以其作為標(biāo)記物的檢測過程排除了由于待檢測生物樣品自發(fā)熒光造成干擾的可能，提高信噪比，從而提高了檢測的靈敏度與穩(wěn)定性；D.通過共價方式交聯(lián)生物活性分子，在保證檢測靈敏度的前提下提高了系統(tǒng)的可靠性與穩(wěn)定性。
發(fā)明內(nèi)容為了對生物樣品進(jìn)行快速、靈敏、定量地檢測，本發(fā)明提供了一種免疫層析試紙條，其采用上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料即UCP作為生物標(biāo)記物，結(jié)果在紅外光的照射下以可見光光信號的形式表現(xiàn)出來，并可使用上換發(fā)光生物傳感器進(jìn)行判讀。其結(jié)構(gòu)包括a.樣品墊；b.結(jié)合墊或結(jié)合物釋放墊，其上固定有UCP標(biāo)記的生物活性分子；c.分析膜，其上有檢測帶和質(zhì)控帶；d.吸水墊，通過虹吸作用提供液體流過整個試紙條的動力；e.塑料背板，其中一面涂有粘膠；上述樣品墊、結(jié)合墊、膜、吸水墊通過粘膠固定于塑料背板上。上述各部分之間是相互重疊的，保證了液體在試紙條上流動的連續(xù)性。當(dāng)進(jìn)行檢測時，將樣品滴加到樣品墊上，樣品通過滲透與虹吸作用進(jìn)入結(jié)合墊，使其中的UCP結(jié)合物重新溶解游離，并在吸水墊的虹吸作用下，離開結(jié)合墊進(jìn)入膜，在其內(nèi)部向吸水墊的方向流動。此過程中UCP結(jié)合物、目標(biāo)被檢物、檢測帶、質(zhì)控帶之間將特異地發(fā)生一定的免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生具有指示性的信號。依據(jù)在試紙條上所發(fā)生免疫反應(yīng)方式的不同，可分為夾心模式、競爭模式與間接模式。A.夾心模式基于夾心模式的試紙條可用于檢測樣品中存在的病原體、微生物以及大分子抗原、抗體等。其中，對病原體、微生物以及大分子抗原進(jìn)行檢測的模式為雙抗體夾心，對抗體進(jìn)行檢測為雙抗原夾心。以下主要以雙抗體夾心為例進(jìn)行說明。在試紙條的制備過程中，首先將UCP與被檢物特異性抗體A(即，可與被檢物特異性結(jié)合的抗體，但其只可結(jié)合于被檢物上的A位點)相結(jié)合，并固定于結(jié)合墊內(nèi)；然后，將被檢物特異性抗體B(S卩，可與被檢物特異性結(jié)合的抗體，但其只可結(jié)合于被檢物上的B位點；注此處所使用的抗體也可以為被檢物特異性多克隆抗體。)固定于膜上作為檢測帶，將二抗(即，可與被檢物特異性抗體A特異性結(jié)合的抗體)固定于膜上作為質(zhì)控帶，將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙貼于吸水墊上作為終點指示帶。附圖2是生物樣品中含有待測物，亦即陽性樣品檢測的示意圖，樣品中的被檢物首先和結(jié)合墊中的UCP-抗體A相結(jié)合，即UCP-抗體A結(jié)合于被檢物上的A位點。然后，二者形成的免疫復(fù)合物(UCP-抗體A-被檢物)以及游離的UCP-抗體A結(jié)合物，與樣品中的液體基質(zhì)一起在吸水墊的帶動下進(jìn)入膜。當(dāng)其流過檢測帶時，檢測帶上的抗體B將與免疫復(fù)合物(UCP-抗體A-被檢物)中被檢物上的B位點相結(jié)合形成UCP-抗體A-被檢物-抗體B復(fù)合物，并被固定于檢測帶上。而游離UCP-抗體A不與抗體B結(jié)合，在吸水墊的帶動下繼續(xù)流動。當(dāng)通過質(zhì)控帶時，與其上的二抗(即，可與抗體A特異性結(jié)合的抗體)結(jié)合并被固定于質(zhì)控帶上。殘余的液體基質(zhì)繼續(xù)向吸水墊流動，并與其上PH試紙內(nèi)的指示劑發(fā)生反應(yīng)，使其由黃色變?yōu)榫G色。終點指示帶發(fā)生顏色變化的試紙條便可以進(jìn)行結(jié)果判讀。使用上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器(UPT生物傳感器)對試紙條進(jìn)行結(jié)果判讀，陽性檢測中試紙條的檢測帶與質(zhì)控帶上均有可見磷光產(chǎn)生，其所對應(yīng)的信號強(qiáng)度分別為T與C。檢測帶上磷光光強(qiáng)T與質(zhì)控帶上磷光光強(qiáng)C的比值，即T/C，與樣品中含有的被檢物濃度成正比。附圖3是生物樣品中不含有待測物，亦即陰性樣品檢測時的示意圖。由于樣品中不含有被檢物，因而重新溶解游離，并隨樣品的液體基質(zhì)一起進(jìn)入膜的只有UCP-抗體A。由此，只有在質(zhì)控帶上發(fā)生UCP-抗體A與二抗的免疫反應(yīng)，并將UCP-抗體A固定其上。這樣陰性檢測中的試紙條在最終的UPT生物傳感器判讀下，只有質(zhì)控帶上有可見磷光產(chǎn)生。將夾心模式系統(tǒng)中的抗體A與抗體B換為抗原A與抗原B，既可以雙抗原夾心對某種病原體感染所產(chǎn)生的抗體進(jìn)行檢測。反應(yīng)原理、結(jié)果指征與以上的雙抗體夾心檢測抗原相同。B.競爭模式基于競爭模式的試紙條可用于檢測樣品中存在的小分子抗原。在試紙條的制備過程中，首先將UCP與被檢物特異性抗體A相結(jié)合，并固定于結(jié)合墊內(nèi)；然后，將與被檢物相同的抗原(均含有抗體A可特異性結(jié)合的A位點)固定于膜上作為檢測帶，將二抗(即，可與被檢物特異性抗體A特異性結(jié)合的抗體)固定于膜上作為質(zhì)控帶，將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙貼于吸水墊上作為終點指示帶。當(dāng)對陽性樣品進(jìn)行檢測時，可以分為兩種情況被檢物濃度高、被檢物濃度較低。附圖4為被檢物濃度高時的競爭免疫反應(yīng)的示意圖。當(dāng)樣品中被檢物濃度高時，加樣后樣品中的被檢物和結(jié)合墊中的UCP-抗體A全部結(jié)合，即UCP-抗體A結(jié)合于被檢物上的A點。因而，在吸水墊的帶動下，與樣品中的液體基質(zhì)一起進(jìn)入膜的只有UCP-抗體A-被檢物免疫復(fù)合物。當(dāng)其流過檢測帶時，由于免疫復(fù)合物中UCP標(biāo)記的抗體A已與被檢物結(jié)合，所以不能與檢測帶上含有A位點的抗原結(jié)合。UCP-抗體A-被檢物免疫復(fù)合物繼續(xù)流動，當(dāng)流過質(zhì)控帶時發(fā)生免疫復(fù)合物中抗體A與二抗的免疫反應(yīng)，并將UCP-抗體A-被檢物免疫復(fù)合物固定其上。殘余的液體基質(zhì)繼續(xù)向吸水墊流動，并與其上PH試紙內(nèi)的指示劑發(fā)生反應(yīng)，使其由黃色變?yōu)榫G色。對變色后的試紙條進(jìn)行傳感器判讀，在紅外光的照射下只有質(zhì)控帶上有可見磷光產(chǎn)生。附圖5為被檢物濃度低時的競爭免疫反應(yīng)的示意圖。當(dāng)樣品中被檢物濃度較低時，加樣后樣品中的被檢物首先和結(jié)合墊中的UCP-抗體A相結(jié)合。然后，二者形成的免疫復(fù)合物(UCP-抗體A-被檢物)以及游離的UCP-抗體A結(jié)合物，與樣品中的液體基質(zhì)一起在吸水墊的帶動下進(jìn)入膜。當(dāng)其流過檢測帶時，由于免疫復(fù)合物中UCP標(biāo)記的抗體A已與被檢物結(jié)合，因而只有游離的UCP-抗體A結(jié)合物可與檢測帶上含有A位點的抗原結(jié)合，并被固定。剩余的UCP-抗體A-被檢物免疫復(fù)合物繼續(xù)流動，當(dāng)流過質(zhì)控帶時發(fā)生免疫復(fù)合物中抗體A與二抗的免疫反應(yīng)，并將UCP-抗體A-被檢物免疫復(fù)合物固定其上。這樣試紙條在最終的紅外光照射下，檢測帶與質(zhì)控帶上均有可見磷光產(chǎn)生，其所對應(yīng)的信號強(qiáng)度分別為T與C。檢測帶上磷光光強(qiáng)T與質(zhì)控帶上磷光光強(qiáng)C的比值，即T/C，與樣品中含有的被檢物濃度成反比。附圖6為對陰性樣品進(jìn)行檢測時的競爭免疫反應(yīng)的示意圖。由于樣品中不含有被檢物，因而重新溶解游離，并隨樣品的液體基質(zhì)一起進(jìn)入膜的只有UCP-抗體A。其與檢測帶上含有A位點的抗原，質(zhì)控帶上的二抗均可結(jié)合。這樣試紙條在最終的紅外光照射下，檢測帶與質(zhì)控帶上均有可見磷光產(chǎn)生。但此時的T/C值與陽性檢測低濃度時相比達(dá)到最強(qiáng)。C.間接模式基于間接模式的試紙條可用于檢測多種動物(包括人)受某種病原體感染后血清中的相應(yīng)抗體。在試紙條的制備過程中，首先將UCP與葡萄球菌蛋白A(SPA)相結(jié)合，并固定于結(jié)合墊內(nèi)；然后，將某種病原體的表面抗原固定于膜上作為檢測帶，將羊IgG固定于膜上作為質(zhì)控帶，將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙貼于吸水墊上作為終點指示帶。附圖7為對陽性血清樣品進(jìn)行檢測時的間接免疫反應(yīng)示意圖。加樣后樣品中的液體基質(zhì)使UCP-SPA結(jié)合物重新溶解游離并與血清樣品中存在的各種IgG(免疫球蛋白G，其中包括一部分病原體特異性抗體IgG)相結(jié)合。在吸水墊的帶動下，UCP-SPA-IgG結(jié)合物與游離的UCP-SPA—起流動進(jìn)入膜。當(dāng)流過檢測帶時，UCP-SPA-IgG結(jié)合物中的UCP-SPA-病原體特異性抗體IgG通過病原體特異性抗體IgG與檢測帶上的病原體抗原發(fā)生特異的免疫結(jié)合反應(yīng)，并結(jié)合于其上。游離的UCP-SPA和其它的一些UCP-SPA-IgG結(jié)合物(其中不含有UCP-SPA-病原體特異性抗體IgG)將繼續(xù)流動，并在通過質(zhì)控帶時UCP-SPA與其上的羊IgG相結(jié)合。殘余的液體基質(zhì)繼續(xù)向吸水墊流動，并與其上pH試紙內(nèi)的指示劑發(fā)生反應(yīng)，使其由黃色變?yōu)榫G色。對變色后的試紙條進(jìn)行傳感器判讀，在紅外光照射下質(zhì)控帶與檢測帶上均有可見磷光，其所對應(yīng)的信號強(qiáng)度分別為T與C。檢測帶上磷光光強(qiáng)T與質(zhì)控帶上磷光光強(qiáng)C的比值，即T/C，與血清樣品中病原體特異性抗體IgG的濃度成正比。(注葡萄球菌蛋白A，即SPA，的特性是可以與多種動物的IgG發(fā)生結(jié)合。)附圖8為對陰性血清樣品進(jìn)行檢測時的間接免疫反應(yīng)示意圖。由于樣品中不含有病原體特異性抗體IgG，因而重新溶解游離，并隨樣品的液體基質(zhì)一起進(jìn)入膜的只有UCP-SPA與其它的一些UCP-SPA-IgG結(jié)合物(其中不含有UCP-SPA-病原體特異性抗體IgG)。其中UCP-SPA與質(zhì)控帶上的羊IgG結(jié)合，而檢測帶上的病原體抗原未參加任何反應(yīng)。這樣試紙條在最終的紅外光照射下，只有質(zhì)控帶上有可見磷光產(chǎn)生。該試紙條結(jié)構(gòu)中包括一外殼，所述外殼上包括加樣孔，結(jié)果判讀窗口和終點指示窗口。通過加樣孔，將生物樣品添加到樣品墊上；結(jié)果判讀窗口對應(yīng)于分析膜上的檢測帶和質(zhì)控帶；終點指示窗口對應(yīng)于吸水墊上的終點指示帶。UCP所標(biāo)記的生物活性分子，包括抗原、抗體、葡萄球菌蛋白A、外源凝激素、多聚核苷酸、受體配體、藥物、細(xì)胞等。UCP顆粒的直徑為200-300nm。并且，可以對UCP顆粒的表面進(jìn)行了修飾。當(dāng)用于雙抗體夾心免疫檢測方法時，其中，結(jié)合墊上固定有UCP標(biāo)記的第一特異性抗體，該特異性抗體可與待測物的一個位點相結(jié)合；分析膜的檢測帶上固定有與待測物的另一個位點相結(jié)合的第二特異性抗體，質(zhì)控帶上固定有可與第一特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合的抗體。當(dāng)用于雙抗原夾心免疫檢測方法時，其中，結(jié)合墊上固定有UCP標(biāo)記的抗原A;分析膜的檢測帶上固定有抗原B，抗原A與抗原B可以結(jié)合于目標(biāo)被檢抗體的不同位點；質(zhì)控帶上固定有可與抗原A發(fā)生特異性結(jié)合的抗體。當(dāng)用于競爭免疫檢測方法時，其中，結(jié)合墊上固定有UCP標(biāo)記的特異性抗體，該抗體可與待測物的一個位點相結(jié)合；分析膜的檢測帶上固定有與待測物具有相同的上述位點的抗原，質(zhì)控帶上固定有可與上述特異性抗體發(fā)生特異性結(jié)合的抗體。當(dāng)用于間接免疫檢測方法時，其中，結(jié)合墊上固定有UCP標(biāo)記的葡萄球菌蛋白A;分析膜的檢測帶上固定有某種病原體的表面抗原，質(zhì)控帶上固定有IgG。本發(fā)明的另一個方面還涉及到所述試紙條的制備方法，其包括以下步驟l)UCP-生物活性分子的制備對UCP顆粒進(jìn)行表面修飾，與生物活性分子進(jìn)行連接，在UCP保存液中進(jìn)行保存；取一定量的保存于UCP保存液中的UCP-生物活性分子結(jié)合物，離心，并棄去上清液；在沉降的UCP生物活性分子結(jié)合物中加入稀釋液，并充分混勻，制備成懸濁液；2)樣品墊的制備選用纖維素膜作為樣品墊固相材料，剪切成具有一定規(guī)格的條帶；將樣品墊放入樣品墊封閉液中浸泡；然后將樣品墊從封閉液中取出，并烘干，使樣品墊充分干燥；3)結(jié)合墊的制備選用玻璃纖維素膜作為結(jié)合墊固相材料，剪切成具有一定規(guī)格的條帶；在該條帶上加上UCP-生物活性分子結(jié)合物的懸濁液；烘干該條帶，使結(jié)合墊充分干燥；4)分析膜的制備選用硝酸纖維素膜作為分析膜固相材料，剪切成具有一定規(guī)格的條帶；在條帶上的不同位置噴點生物活性分子，制成檢測帶和質(zhì)控帶；烘干該條帶，使分析膜充分干燥；5)裝配該試紙條將處理過的分析膜粘貼于塑料背板上，質(zhì)控帶向上，檢測帶向下；7將處理過的結(jié)合墊粘貼于塑料背板上，上端壓于分析膜的下端，并相互重疊；將處理過的樣品墊粘貼于塑料背板上，下端與塑料背板平齊，上端壓于結(jié)合墊的下端，并相互重疊；將吸水墊粘貼于塑料背板上，上端與塑料背板平齊，下端壓于分析膜的上端，并與分析膜相互重疊；將裝配成形的條帶剪切成一定規(guī)格的試紙條。由此制備成本發(fā)明的基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)免疫層析試紙條，該試紙條可以裝入外殼中，在干燥條件下備用。該外殼可以是塑料的。其中，所述UCP保存液為pH=7.20.03mol/L磷酸鹽緩沖液(PB)，含有0.1%BSA，0.05%Tween20，0.02%NaN3。其中，所述UCP生物活性分子的稀釋液為pH=7.20.03mol/L磷酸鹽緩沖液(PB)，含有1%蔗糖，1%BSA。其中，所述樣品墊封閉液為pH=7.20.03mol/L磷酸鹽緩沖液(PB)，含有5%BSA，0.1%Tween20。其中，可將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙貼于吸水墊作為終點指示帶。本發(fā)明的另一個方面還涉及所述試紙條在檢測生物樣品中的應(yīng)用。以經(jīng)過表面修飾與活化的上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料UCP作為生物標(biāo)記物，開發(fā)新型免疫層析試紙使其可以極高的穩(wěn)定性、重現(xiàn)性及靈敏性應(yīng)用于快速生物檢測。最終實現(xiàn)對病原體、病原體感染所產(chǎn)生的抗體、違禁藥品、重大疾病(腫瘤、癌癥和糖尿病等)標(biāo)志物等多種目標(biāo)被檢物的定性、定量及多重檢測，以滿足生物恐怖劑檢測、傳染病和重大疾病的輔助診斷以及民用醫(yī)療保健的需求。附圖1:UCP顆粒用于生物檢測領(lǐng)域的原理示意圖附圖2:夾心免疫反應(yīng)為陽性的反應(yīng)示意圖附圖3:夾心免疫反應(yīng)為陰性的反應(yīng)示意圖附圖4:競爭免疫反應(yīng)為陽性時，待測物為高濃度的反應(yīng)示意圖附圖5:競爭免疫反應(yīng)為陽性時，待測物為低濃度的反應(yīng)示意圖附圖6:競爭免疫反應(yīng)為陰性的反應(yīng)示意圖附圖7:間接免疫反應(yīng)為陽性的反應(yīng)示意圖附圖8:間接免疫反應(yīng)為陰性的反應(yīng)示意圖附圖9:UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為乙肝表面抗原陰性檢測，右為陽性檢測)附圖10:乙肝病毒表面抗原檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線附圖11:UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為SARS病毒陰性檢測，右為陽性檢測)附圖12:SARS病毒檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線附圖13:UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為鼠疫FI-抗原陰性檢測，右為陽性檢測)附圖14:鼠疫FI-Ag檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測)0093]0094]生檢測)0095]0096]0097]0098]0099]0100]0101]0102]附圖15:UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為安非他命陰性檢測，右為陽性檢測)附圖16:安非他命檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線圖附圖17:UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為鼠疫感染抗體陰性檢測，右為陽性檢附圖18:鼠疫抗體檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線附圖19:UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為SARS病毒感染抗體陰性檢測，右為陽附圖20:SARS病毒抗體檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線附圖21:免疫層析試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖附圖22:裝配試紙條時，各部分的粘貼示意圖附圖23:試紙條的結(jié)構(gòu)與尺寸附圖24:試紙條外殼的俯視圖附圖25:試紙條外殼的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，分為上片和下片附圖26:上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器的立體結(jié)構(gòu)示意圖附圖27:上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器包含激發(fā)光路光軸、試紙條法線和磷光圖像接收光路光軸的平面結(jié)構(gòu)示意圖0103]附圖28:上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料的發(fā)射光譜曲線附圖29:濾光片的透過率曲線實驗例1:雙抗體夾心模式檢測乙肝表面抗原HBs-Ag:一、UPT生物傳感器結(jié)果判讀附圖9:UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為乙肝表面抗原陰性檢測，右為陽性檢二、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制1.將提純的乙肝表面抗原HBs-Ag標(biāo)準(zhǔn)品用1:IO稀釋的正常人血清(以pH0104]0105]0106]0107]測)0108]0109]7.20.03mol/LPB緩沖液稀釋)作為稀釋液配置系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0pg/ml、50pg/ml、100pg/ml、150pg/ml、200pg/ml、250pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、500pg/ml、600pg/ml、700pg/ml、800pg/ml、900pg/ml、1000pg/ml、1100pg/ml、1200pg/ml、1300pg/ml、1400pg/ml、1500pg/ml、1600pg/ml的20份樣品;2.每個樣品分別用10個UPT試紙條檢測10次，10次檢測中傳感器判讀得到的T值與C值分別取平均值，最終根據(jù)二者的比值得出與每個濃度對應(yīng)的T/C結(jié)果，列于下表1:濃度(pg/邁l)050100150200250300T平均值0.222590.245680.210780.367850.41990.47130.47517c平均值1.288431.322370.949271.03610.805990.845550.80156T/C0.172760.185790.222040.355030.520970.557390.59281<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>表1:乙肝病毒表面抗原檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線3.以T/C值作為X，以乙肝表面抗原HBs-Ag濃度作為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)統(tǒng)計擬和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的表達(dá)式為Y=268.73X+103.06，擬和系數(shù)的平方為R2=0.975;結(jié)果見附圖10:乙肝病毒表面抗原檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。4.乙肝表面抗原濃度的計算公式為血清樣品中含有的乙肝表面抗原HBs-Ag濃度(pg/ml)=10Y=10X(268.73X+103.06)=2687.3X+1030.6三、實際檢測結(jié)果1.檢測準(zhǔn)確性將50份購自生物制品鑒定所的乙肝病人血清盤(其中含13份陽性，37份陰性)同時用膠體金免疫層析試紙與本系統(tǒng)(UPT試紙條與傳感器)進(jìn)行雙盲檢測膠體金免疫層析試紙法——11份陽性，39份陰性(即，兩份陽性漏檢)；UPT試紙條與傳感器法——13份陽性，37份陰性，與實際結(jié)果完全吻合；同時與膠體金免疫層析試紙的定性檢測相對，UPT試紙條與傳感器法給出了每份樣品的最終準(zhǔn)確濃度。2.檢測穩(wěn)定性將一份乙肝病人血清用pH=7.20.03mol/LPB緩沖液10倍稀釋，用UPT試紙條與傳感器重復(fù)檢測10次，結(jié)果列于下表2:重復(fù)檢測序號12345T/C0.404470.392110.370420.40910.42247HBs-Ag濃度(pg/ml)2117.5322084.3172026.032129.9742165.90410<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>同一份血清重復(fù)測量的變異系數(shù)(CV)=2.621%表2:乙肝病毒表面抗原檢測重復(fù)性結(jié)論在乙肝表面抗原HBs-Ag檢測中，UPT試紙條與傳感器法與膠體金免疫層析試紙法相比具有更高的靈敏度，且在實現(xiàn)精確定量檢測的同時具有很好的穩(wěn)定性。實驗例2:雙抗體夾心模式檢測冠狀病毒(SARS病毒)—、UPT生物傳感器結(jié)果判讀附圖11:UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為SARS病毒陰性檢測，右為陽性檢測)二、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制1.將經(jīng)過培養(yǎng)、記數(shù)并滅活的SARS病毒用pH=7.20.03mol/LPB緩沖液作為稀釋液配置系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0org/ml、100org/ml、200org/ml、300org/ml、400org/ml、500org/ml、600org/ml、700org/ml、800org/ml、900org/ml、1000org/ml、1100org/ml、1200org/ml、1300org/ml、1400org/ml、1500org/ml、1600org/ml、1700org/ml、1800org/ml、1900org/ml、2000org/ml的21份樣品;2.每個樣品分別用10個UPT試紙條檢測10次，10次檢測中傳感器判讀得到的T值與C值分別取平均值，最終根據(jù)二者的比值得出與每個濃度對應(yīng)的T/C結(jié)果，列于下表<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>表3:SARS病毒檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線3.以T/C值作為X，以SARS病毒濃度作為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)統(tǒng)計擬和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的表達(dá)式為Y=337.2X+216.12，擬和系數(shù)的平方為R2=0.9631;結(jié)果見附圖12:SARS病毒檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。4.SARS病毒濃度的計算公式為樣品中含有的SARS病毒濃度(org/ml)=10Y=10X(337.2X+216.12)=3372X+2161.2三、實際檢測結(jié)果1.檢測準(zhǔn)確性將30份待檢樣品(其中含6份陽性，24份陰性)用本系統(tǒng)(UPT試紙條與傳感器)進(jìn)行雙盲檢測UPT試紙條與傳感器法——6份陽性，24份陰性，與實際結(jié)果完全吻合；同時UPT試紙條與傳感器法給出了每份樣品的最終精確濃度。2.檢測穩(wěn)定性將一份待檢樣品用pH=7.20.03mol/LPB緩沖液10倍稀釋，用UPT試紙條與傳感器檢測10次，結(jié)果列于下表4:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>同一份待檢樣品重復(fù)測量的變異系數(shù)(CV)=1.03%表4:SARS病毒檢測重復(fù)性結(jié)論在SARS病毒檢測中，UPT試紙條與傳感器法具有很好的靈敏度與穩(wěn)定性，且實現(xiàn)了精確定量。實驗例3:競爭模式檢測鼠疫FI-抗原(鼠疫FI-Ag):—、UPT生物傳感器結(jié)果判讀附圖13:UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為鼠疫FI-抗原陰性檢測，右為陽性檢測)二、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制1.將提純的鼠疫FI-Ag標(biāo)準(zhǔn)品用pH=7.20.03mol/LPB緩沖液作為稀釋液配置系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0pg/ml、100pg/ml、200pg/ml、300pg/ml、400pg/ml、500pg/ml、600pg/ml、700ng/ml、800pg/ml、900pg/ml、1000pg/ml、1100pg/ml、1200pg/ml、1300pg/ml、1400pg/ml、1500pg/ml、1600pg/ml、1700pg/ml、1800pg/ml、1900pg/ml、2000pg/ml的21份樣品；2.每個樣品分別用10個UPT試紙條檢測10次，10次檢測中傳感器判讀得到的T值與C值分別取平均值，最終根據(jù)二者的比值得出與每個濃度對應(yīng)的T/C結(jié)果，列于下表5:<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表5:鼠疫FI-Ag檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線3.以T/C值作為X，以鼠疫FI-Ag濃度作為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)統(tǒng)計擬和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的表達(dá)式為Y=-324.63X+2058.5，擬和系數(shù)的平方為R2=0.9993;結(jié)果見附圖14:鼠疫FI-Ag檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。4.鼠疫FI-Ag濃度的計算公式為樣品中含有的鼠疫FI-Ag濃度(pg/ml)=10Y=10X(-324.63X+2058.5)=-3246.3X+20585三、實際檢測結(jié)果1.檢測準(zhǔn)確性將32份待檢樣品(其中含19份陽性，13份陰性)用本系統(tǒng)(UPT試紙條與傳感器)進(jìn)行雙盲檢測UPT試紙條與傳感器法——19份陽性，13份陰性，與實際結(jié)果完全吻合；同時UPT試紙條與傳感器法給出了每份樣品的最終精確濃度。2.檢測穩(wěn)定性將一份待檢樣品用pH=7.20.03mol/LPB緩沖液10倍稀釋，用UPT試紙條與傳感器檢測10次，結(jié)果列于下表6:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>同一份待檢樣品重復(fù)測量的變異系數(shù)(CV)=1.034%表6:鼠疫FI-Ag檢測重復(fù)性結(jié)論在鼠疫FI-Ag檢測中，UPT試紙條與傳感器法具有很好的靈敏度與穩(wěn)定性，且實現(xiàn)了精確定量檢測。實驗例4:競爭模式檢測違禁藥品(以檢測安非他命為例進(jìn)行說明)—、UPT生物傳感器結(jié)果判讀附圖15:UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為安非他命陰性檢測，右為陽性檢測)二、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制1.將純品安非他命用pH二7.20.03mol/LPB緩沖液作為稀釋液配置系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為Opg/ml、10pg/ml、20pg/ml、30pg/ml、40pg/ml、50pg/ml、70pg/ml、90ng/ml、110pg/ml、130pg/ml、150pg/ml、170pg/ml、190pg/ml、210pg/ml、230pg/ml、250pg/ml、270pg/ml、290pg/ml、310pg/ml、330pg/ml的20份樣品；2.每個樣品分別用10個UPT試紙條檢測10次，10次檢測中傳感器判讀得到的T值與C值分別取平均值，最終根據(jù)二者的比值得出與每個濃度對應(yīng)的T/C結(jié)果，列于下表7:<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>表7:安非他命檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線3.以T/C值作為X，以安非他命濃度作為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)統(tǒng)計擬和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的表達(dá)式為Y=-51.985X+296.45，擬和系數(shù)的平方為R2=0.9529;結(jié)果見附圖16:安非他命檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。4.安非他命的濃度計算公式為樣品中含有的安非他命濃度(pg/ml)=10Y=10X(-51.985X+296.45)=-519.85X+2964.5三、實際檢測結(jié)果1.檢測準(zhǔn)確性將44份待檢樣品(其中含23份陽性，21份陰性)用本系統(tǒng)(UPT試紙條與傳感器)進(jìn)行雙盲檢測UPT試紙條與傳感器法——23份陽性，21份陰性，與實際結(jié)果完全吻合；同時UPT試紙條與傳感器法給出了每份樣品的最終精確濃度。2.檢測穩(wěn)定性將一份待檢樣品用pH=7.20.03mol/LPB緩沖液10倍稀釋，用UPT試紙條與傳感器檢測10次，結(jié)果列于下表8:<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>同一份待檢樣品重復(fù)測量的變異系數(shù)(CV)=0.423%表8:安非他命檢測重復(fù)性結(jié)論在安非他命檢測中，UPT試紙條與傳感器法具有很好的靈敏度與穩(wěn)定性，且實現(xiàn)了精確定量檢測。實驗例5:間接模式檢測鼠疫感染抗體(以檢測兔感染鼠疫產(chǎn)生抗體為例進(jìn)行說明)—、UPT生物傳感器結(jié)果判讀附圖17:UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為鼠疫感染抗體陰性檢測，右為陽性檢測)二、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制1.將提純的兔抗鼠疫IgG標(biāo)準(zhǔn)品用1:IO稀釋的正常兔血清(以pH=7.20.03mol/LPB緩沖液稀釋)作為稀釋液配置系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0ng/ml、2ng/ml、4ng/ml、6ng/ml、8ng/ml、10ng/ml、15ng/ml、20ng/ml、25ng/ml、30ng/ml、35ng/ml、40ng/ml、45ng/ml、50ng/ml、55ng/ml、60ng/ml、65ng/ml、70ng/ml、75ng/ml、80ng/ml的20份樣品；2.每個樣品分別用10個UPT試紙條檢測10次，10次檢測中傳感器判讀得到的T值與C值分別取平均值，最終根據(jù)二者的比值得出與每個濃度對應(yīng)的T/C結(jié)果，列于下表9:<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>表9:鼠疫抗體檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線3.以T/C值作為X，以鼠疫抗體濃度作為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)統(tǒng)計擬和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的表達(dá)式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>，擬和系數(shù)的平方為R2=0.9749;結(jié)果見附圖18:鼠疫抗體檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。4.鼠疫抗體濃度的計算公式為<formula>formulaseeoriginaldocumentpage17</formula>三、實際檢測結(jié)果1.檢測準(zhǔn)確性將100份兔血清(其中含31份陽性，69份陰性)同時用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)與本系統(tǒng)(UPT試紙條與傳感器)進(jìn)行雙盲檢測ELISA法——23份陽性，77份陰性；UPT試紙條與傳感器法——31份陽性(包括ELISA中的23份陰性，并從ELISA確定的77份陰性樣品中又檢出8份陽性)，69份陰性，與實際結(jié)果完全吻合；同時與ELISA的定性檢測相對，UPT試紙條與傳感器法給出了每份樣品的最終精確濃度。2.檢測穩(wěn)定性將一份感染鼠疫家兔的血清用pH=7.20.03mol/LPB緩沖液10倍稀釋，用UPT試紙條與傳感器檢測10次，結(jié)果列于下表10:<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>同一份血清重復(fù)測量的變異系數(shù)(CV)=1.408%表10:鼠疫抗體檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線結(jié)論在鼠疫感染抗體檢測中，UPT試紙條與傳感器法與ELISA法相比具有更高的靈敏度，且在實現(xiàn)精確定量的同時具有很好的穩(wěn)定性。實驗例6:間接模式檢測SARS病毒感染抗體—、UPT生物傳感器結(jié)果判讀附圖19:UPT生物傳感器結(jié)果判讀圖(左為SARS病毒感染抗體陰性檢測，右為陽性檢測)二、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制1.將從SARS病人血清中提純的人抗SARS病毒IgG標(biāo)準(zhǔn)品用1:10稀釋的距常人血清(以pH=7.20.03mol/LPB緩沖液稀釋)作為稀釋液配置系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品，濃度為0ng/ml、lng/ml、2ng/ml、3ng/ml、4ng/ml、5ng/ml、6ng/ml、8ng/ml、10ng/ml、12ng/ml、14ng/ml、16ng/ml、18ng/ml、20ng/ml、22ng/ml、24ng/ml、26ng/ml、28ng/ml、30ng/ml、32ng/ml、34ng/ml的21份樣品;2.每個樣品分別用10個UPT試紙條檢測10次，10次檢測中傳感器判讀得到的T值與C值分別取平均值，最終根據(jù)二者的比值得出與每個濃度對應(yīng)的T/C結(jié)果，列于下表11:濃度(ng/ml)0123456T平均值0.698760.642410.574180.455050.613170.525590.58502C平均值1.880671.571331.256420.921091.055310.779970.80162T/C0.371550.408830.4570.494030.581030.673860.7298濃度(ng/ml)8101214161820T平均值0.776071.510382.085721.821931.774871.878062.28666C平均值0.801911.1011.165430.792980.683930.630440.73583T/C0.967781.371831.789662.297572.595112.978973.10759濃度(ng/ml)22242628303234T平均值2.250972.136826.169535.224653.574914.734422.72789C平均值0.654850.575061.475971.100330.69070.822930.44401T/C3.437383.715824.179984.748265.175785.753126.14375表11:SARS病毒抗體檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線3.以T/C值作為X，以SARS病毒抗體濃度作為Y繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)統(tǒng)計擬和標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的表達(dá)式為Y=5.7365X+0.8012，擬和系數(shù)的平方為R2=0.9841;結(jié)果見附圖20:SARS病毒抗體檢測標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。4.SARS病毒抗體濃度的計算公式為18人血清中含有的SARS病毒抗體濃度(ng/ml)=10Y=10X(5.7365X+0.8012)=57.365X+8.012三、實際檢測結(jié)果1.檢測準(zhǔn)確性將45份可能感染SARS病毒的病人血清(最終確診其中含17份陽性，28份陰性)同時用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)與本系統(tǒng)(UP試紙條與傳感器)進(jìn)行雙盲檢測ELISA法——17份陽性，28份陰性，與實際結(jié)果完全吻合，檢測歷時2小時左右；UPT試紙條與傳感器法——17份陽性，28份陰性，與實際結(jié)果完全吻合，檢測歷時半個小時左右；與ELISA法相比，UPT試紙條與傳感器法檢測更為快速，且在ELISA法定性檢測的基礎(chǔ)上定量地給出了每份樣品的最終精確濃度。2.檢測穩(wěn)定性將一份SARS病人血清用pH=7.20.03mol/LPB緩沖液10倍稀釋，用UPT試紙條與傳感器檢測10次，結(jié)果列于下表12:重復(fù)檢測序號12345T/C0.702270.699380.697760.705110.71272SARS病毒抗體濃度(ng/ml)48.2977248.1319348.03948.4606448.89718重復(fù)檢測序號678910T/C0.704850.703060.701990.721360.70459SARS病毒抗體濃度(ng/ml)48.4457248.3430448.2816649.3928248.43081同一份血清重復(fù)測量的變異系數(shù)(CV)=0.819%表12:SARS病毒抗體檢測重復(fù)性結(jié)論在SARS病毒感染抗體檢測中，UPT試紙條與傳感器法與ELISA法相比更為快速、可實現(xiàn)精確定量檢測，且穩(wěn)定性很好。具體實施例方式以下結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)解釋。附圖21中顯示了試紙條的一般結(jié)構(gòu)包括樣品墊10(SamplePad)，結(jié)合墊11(ConjugatePad或結(jié)合物釋放墊ConjugateReleasePad),分析膜12(AnalyticalMembrane)，吸水墊13(WickingPad)、塑料背板14(其中一面涂有粘膠)(LaminatingCard)。樣品墊10、結(jié)合墊11、分析膜12、吸水墊13通過粘膠15固定于塑料背板14上。a.樣品墊10是使用過程中滴加被檢樣品的部位；b.結(jié)合墊11中固定有UCP-抗體、UCP-抗原等UCP-生物活性分子結(jié)合物，在加入19檢測樣品后，其可在試紙條上發(fā)生免疫反應(yīng)；c.分析膜12是層析試紙的核心部分，檢測帶17、質(zhì)控帶18均固定于分析膜12的某一具體位置；d.吸水墊13在整個檢測過程中，通過虹吸作用提供液體流過整個試紙條的動力。各個部分之間的重疊區(qū)域16保證了液體在試紙條上流動的連續(xù)性。當(dāng)進(jìn)行檢測時，將樣品滴加到樣品墊10上，樣品通過滲透與虹吸作用進(jìn)入結(jié)合墊11，使其中的UCP結(jié)合物重新溶解游離，并在吸水墊13的虹吸作用下，離開結(jié)合墊11進(jìn)入分析膜12，在其內(nèi)部向吸水墊13的方向流動。此過程中UCP結(jié)合物、目標(biāo)被檢物、檢測帶17、質(zhì)控帶18之間將特異地發(fā)生一定的免疫反應(yīng)，并產(chǎn)生具有指示性的信號。本發(fā)明中試紙條的裝配，包括以下步驟A.將塑料背板14剪切成7.4X30cm規(guī)格的條帶；B.將處理過的分析膜12粘于塑料背板14上21mm-46mm的位置，質(zhì)控帶18向上，檢測帶17向下；C.將處理過的結(jié)合墊11粘于塑料背板14上12mm的位置，上端壓于分析膜12的下端，重疊lmm;D.將處理過的樣品墊IO粘于塑料背板14上，下端與塑料背板14平齊，上端壓于結(jié)合墊11的下端，重疊3mm;E.將吸水墊13粘于塑料背板14上，上端與塑料背板14平齊，下端壓于分析膜12的上端，重疊2mm;F.將裝配成形的條帶用切條機(jī)剪切成4mm寬的試紙條；G.將試紙條裝入塑料外殼，干燥器中保存?zhèn)溆?。附圖22中為粘貼時各部分之間的重疊關(guān)系。附圖23為試紙條裝配完畢后各部分的結(jié)構(gòu)與尺寸，其中樣品墊10重疊后的凈暴露長度為15mm，結(jié)合墊11重疊后的凈暴露長度為7mm，分析膜12重疊后的凈暴露長度為22mm，吸水墊13重疊后的凈暴露長度為30mm。裝配完畢并經(jīng)過剪切的試紙條便可以裝入試紙條的外殼中。試紙條的外殼參見附圖24，其包括加樣孔20、結(jié)果判讀窗口21和終點指示窗口22。其中，結(jié)果判讀窗口21中對應(yīng)檢測帶17、質(zhì)控帶18。所述終點指示窗口22中對應(yīng)終點指示帶19。其中通過加樣孔20將樣品點加到試紙條上后，在吸水墊13的虹吸作用下液體樣品依次經(jīng)過檢測帶17、質(zhì)控帶18。當(dāng)終點指示帶19變?yōu)榫G色后，用生物傳感器對外殼上結(jié)果判讀窗口21中的各條帶進(jìn)行判讀，就可以得到結(jié)果。試紙條外殼分為上片和下片，參見附圖25。23、24為咬合齒釘，將二者壓緊便可以使試紙條外殼的上下片合為一體；25為擋板，26為倒釘，六個擋板25與三個倒釘26可將試紙條牢固地卡在外殼內(nèi)，防止移動；27為壓板，將上下片蓋緊后，壓板27的位置處于試紙條上樣品墊10與結(jié)合墊11、結(jié)合墊11與分析膜12重疊處，以此來增加試紙條各部分的連接，保證檢測中液體流動的連續(xù)性。如圖25所示，將試紙條放入外殼的下片，將上片與下片蓋緊，便成為可以用于檢測的成品。^MMl^上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器的結(jié)構(gòu)參閱圖26和圖27。由圖可知，本發(fā)明上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器包括激發(fā)光路、磷光圖像接收光路、圖像處理系統(tǒng)，分別用于照明試紙條3、接收試紙條3發(fā)出的磷光圖像、對試紙條3發(fā)出的磷光圖像進(jìn)行分析與處理，上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器中試紙條結(jié)構(gòu)示意圖參閱圖24。在激發(fā)光路上，沿光軸依次設(shè)置紅外激發(fā)光源1、一維聚焦鏡2，其光軸為010。在磷光圖像接收光路上，沿光軸依次設(shè)置前鏡組5、濾光片6、后鏡組7和圖像接收器8，其光軸為002。磷光圖像接收光路的物面與試紙條3的上表面重合，磷光圖像接收光路的像面與圖像接收器8的敏感面重合。試紙條3安裝于特制的外殼4中，其法線為003。激發(fā)光路形成的焦線AA照明試紙條3，焦線AA與試紙條3的長邊平行，且與試紙條3的對稱線重合。激發(fā)光路的光軸010、試紙條3的法線003和磷光圖像接收光路的光軸002位于同一個平面內(nèi)，激發(fā)光路的光軸010與試紙條3的法線003的夾角為Bl，磷光圖像接收光路的光軸002與試紙條3的法線003的夾角為B2。所說的激發(fā)光路由紅外激發(fā)光源1、一維聚焦鏡2組成，其作用是產(chǎn)生一條強(qiáng)度為0.15瓦/平方厘米(W/cm2)的細(xì)長紅外光焦線AA，照明試紙條3的所有功能帶。紅外激發(fā)光源1通常是經(jīng)過準(zhǔn)直的半導(dǎo)體激光器，發(fā)出平行光束，其波長一般為980nm附近。一維聚焦鏡2可以是柱面透鏡、棱鏡或其他可以產(chǎn)生焦線的光學(xué)元件。所說的試紙條3上含有兩個功能帶，即檢測帶17、質(zhì)控帶18。其中檢測帶17將根據(jù)不同的檢測模式與待檢測樣品中目標(biāo)被檢物以及UCP標(biāo)記物發(fā)生特異性的免疫反應(yīng)，其上結(jié)合UCP所產(chǎn)生的信號為T;質(zhì)控帶18通過免疫反應(yīng)結(jié)合UCP所產(chǎn)生的信號為C，T與C的比值，即T/C便是與不同濃度目標(biāo)被檢物對應(yīng)的檢測結(jié)果，其將與待檢測樣品中目標(biāo)被檢物的濃度呈一定的線形關(guān)系，同時C對于試紙條的生物學(xué)反應(yīng)性能具有監(jiān)控作用；所說的磷光圖像接收光路由前鏡組5、濾光片6、后鏡組7和圖像接收器8組成；磷光圖像接收光路的物方孔徑半角為U2。前鏡組5將試紙條3上各功能帶發(fā)出的磷光準(zhǔn)直成平行光。濾光片6濾除磷光信號中包含的雜光，以提高信噪比；它對磷光信號具有盡可能高的透過率(大于90%)，而對激發(fā)光具有盡可能低的透過率(小于10—5)。后鏡組7將濾除雜光后的磷光信號聚焦成像于圖像接收器8的敏感面上。圖像接收器8可以是一個線陣CCD攝像機(jī)，也可以是一個一維光電二極管陣列，其敏感元件的排列方向與試紙條3的細(xì)長方向一致。所以圖像接收器8可以對應(yīng)地測量試紙條3上各功能帶發(fā)出的磷光強(qiáng)度。所說的激發(fā)光路光軸010與試紙條3法線003的夾角為Bl、以及磷光圖像接收光路光軸002與試紙條3法線003的夾角為B2，且B1^B2，通常B1〉B2-U2，或B1<B2_U2，U2為磷光圖像接收光路的物方孔徑半角。這種設(shè)計的目的是阻止照明光線的反射光進(jìn)入磷光圖像接收光路，以減小雜光。與在先技術(shù)相比，本發(fā)明的特點在于激發(fā)光路產(chǎn)生高強(qiáng)度紅外激光焦線AA，同時將試紙條3上的各功能帶照明；磷光圖像接收光路對試紙條3上的各功能帶同時成像；夾角Bl與夾角B2不等，且滿足Bl>B2-U2，或Bl<B2-U2。上述特點使本發(fā)明具有判讀效率高、判讀靈敏度高、可進(jìn)行多重定量檢測等優(yōu)點。本發(fā)明上轉(zhuǎn)換發(fā)光生物傳感器的工作過程是首先將安裝于外殼4中的試紙條3放到判讀位置。由紅外激發(fā)光源1發(fā)出的平行光束經(jīng)一維聚焦鏡2形成焦線AA，焦線AA位于試紙條3的上表面，且與試紙條3的細(xì)長方向平行，這樣將試紙條3上的各功能帶全部照明。由試紙條3上各功能帶發(fā)出的磷光信號經(jīng)前鏡組5準(zhǔn)直后變成平行光，經(jīng)濾光片6濾除雜光后被后鏡組7聚焦成像于圖像接收器8的敏感面上。圖像處理系統(tǒng)9對圖像接收器8輸出的試紙條磷光圖像進(jìn)行分析與處理，給出試紙條3上各功能帶磷光信號的幅度，進(jìn)而給出被檢生物分子的屬性和含量。圖26和圖27是本發(fā)明的最佳實施例，其具體結(jié)構(gòu)和參數(shù)敘述如下激發(fā)光路中的紅外激發(fā)光源1發(fā)出的平行光束的截面尺寸為4mmXlmm，中心波長為980nm，功率為30mW;—維聚焦鏡2為平凸柱面透鏡，其焦距為20mm。焦線AA的尺寸為20mmXlmm，略小于試紙條3的結(jié)果判讀窗口21尺寸。結(jié)果判讀窗口21中試紙條3上的兩條帶分別為距終點指示窗一側(cè)結(jié)果判讀窗口21內(nèi)沿12.2mm處為檢測帶17、7.2mm處為質(zhì)控帶18。研究中采用的上轉(zhuǎn)換磷光材料是(YYbEr)F3(氟化釔鐿鉺)，在紅外光激發(fā)下發(fā)出的磷光光譜如圖28所示，其主峰值波長為541.5nm。磷光圖像接收光路中的前鏡組5的焦距為40mm，物方孔徑半角U2=20°;濾光片6的光譜透過率曲線如圖29所示，在541.5nm波長處的透過率大于90X，而在980nm波長處的透過率小于10—5。后鏡組7的焦距為40mm，所以磷光圖像接收光路的放大倍率為-1倍。圖像接收器8是一個線陣CCD攝像機(jī)，其敏感面長度為22mm，共含有2200個像素，像素尺寸為10ymX10ym。所以圖像接收器8對試紙條3的空間判讀分辨率為10iim。最佳實施例對純上轉(zhuǎn)換磷光材料的判讀靈敏度優(yōu)于1yg/L，可同時檢測4種以上的生物物質(zhì)。實施例2:雙抗體夾心柃測l乙肝表面抗原HBs-Ag:(1)免疫層析液相材料準(zhǔn)備A.UCP-抗體結(jié)合物a.利用已建立的表面修飾與活化方法對直徑200-300nm的UCP顆粒進(jìn)行表面修飾，并與抗乙肝表面抗原HBs-Ag單克隆抗體進(jìn)行連接，在UCP保存液(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液中，含0.1%BSA、0.05%Tween20、0.02%NaN3)中以濃度lmg/mL，4"C保存?zhèn)溆茫籦.將保存于UCP保存液中的lmg/mLUCP-抗體結(jié)合物6mL，12000r/min，4°C，離心30min，盡量棄盡上清；c.向離心管中的UCP-抗體結(jié)合物沉降，加入3mL結(jié)合物稀釋液(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液中，含1%蔗糖、1%BSA)渦旋充分混勻(終濃度:2mg/mLUCP-抗體結(jié)合物)d.將懸濁液倒入試劑瓶中，4t:保存?zhèn)溆茫籅.樣品墊封閉液a.用天平精確稱量BSA(牛血清白蛋白)lg，放入小燒杯中；b.燒杯中加入pH=7.20.03mol/LPB緩沖液20mL，玻璃棒攪拌充分混勻；c.BAS溶液中加入Tween20(吐溫20)20yL，玻璃棒攪拌充分混勻(終濃度5%BAS，O.1%Tween20);d.4。C保存?zhèn)溆?；C.檢測帶蛋白a.用天平精確稱量純化的兔抗HBs-Ag多克隆抗體2mg，置于1.5mL的微離心管中；b.微離心管中加入lmLpH=7.20.03mol/LPB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mU;c.分裝為50iiL每管，-2(TC凍存?zhèn)溆?；D.質(zhì)控帶蛋白；a.用天平精確稱量純化的羊抗鼠IgG抗體2mg，置于1.5mL的微離心管中；b.微離心管中加入lmLpH=7.20.03mol/LPB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mU;c.分裝為50iiL每管，-2(TC凍存?zhèn)溆茫?2)免疫層析固相載體材料準(zhǔn)備A.樣品墊a.選用纖維素膜(CelluloseMembrane)作為樣品墊固相材料，將其剪切成1.5X30.0cm規(guī)格的條帶;b.將樣品墊放入長形平皿中，樣品墊封閉液加于其上，常溫浸泡30min;c.將樣品墊由封閉液中取出，放于干凈的平皿中；d.37C烘干3小時，使樣品墊充分干燥；e.封閉后的樣品墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；B.結(jié)合墊a.選用玻璃纖維素膜(GlassFiber)作為結(jié)合墊固相材料，將其剪切成1.0X30.0cm規(guī)格的條帶;b.將4。C保存?zhèn)溆玫?mg/mLUCP-抗體結(jié)合物(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液，含1%蔗糖、1%BSA)超聲10s;c.將結(jié)合墊放入長形平皿中，UCP-抗體結(jié)合物懸濁液加于其上；d.將結(jié)合墊取出放于干凈的平皿中；e.37"烘干2.5小時，使結(jié)合墊充分干燥；f.處理后的結(jié)合墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；C.分析膜a.以孔徑為12iim的硝酸纖維素膜(NitrocelluloseMembrane)作為固相材料，將其剪切成2.5X30cm規(guī)格的條帶；；b.用點樣儀在2.5cm寬的分析膜上，從下向上lcm處噴點2mg/mL兔抗HBs-Ag多克隆抗體，2L/cm，作為檢測帶；c.用點樣儀在2.5cm寬的分析膜上，從下向上1.5cm處噴點2mg/mL羊抗鼠IgG抗體，2iiL/cm，作為質(zhì)控帶；d.37t:烘干2小時，使分析膜充分干燥；e.點樣后的分析膜在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；D.吸水墊a.選用纖維素膜(CelluloseMembrane)作為吸水墊固相材料，將其剪切成3.0X30cm規(guī)格的條帶;b.將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙固定于吸水墊從下向上2.Ocm處，作為終點指示帶；23c.吸水墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?3)免疫層析試紙條檢測A.將待檢測血清樣品用pH=7.20.03mol/LPB緩沖液10倍稀釋;B.100L稀釋后的樣品加于試紙條外殼上的加樣孔中；C.待終點指示窗口中的終點指示帶變?yōu)榫G色后，便可以用傳感器判讀外殼上結(jié)果判讀窗口中的檢測帶與質(zhì)控帶，以得出結(jié)果。^MMA^雙抗體夾心檢測冠狀病毒(SARS病毒)(1)免疫層析液相材料準(zhǔn)備A.UCP-抗體結(jié)合物a.利用已建立的表面修飾與活化方法對直徑200-300nm的UCP顆粒進(jìn)行表面修飾，并與純化的兔抗SARS病毒抗體進(jìn)行連接，在UCP保存液(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液中，含O.1%BSA、0.05%Tween20、0.02%NaN3)中以濃度lmg/mL，4。C保存?zhèn)溆?b.將保存于UCP保存液中的lmg/mLUCP-抗體結(jié)合物6mL，12000r/min，4°C，離心30min，盡量棄盡上清；c.向離心管中的UCP-抗體結(jié)合物沉降，加入3mL結(jié)合物稀釋液(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液中，含1%蔗糖、1%BSA)渦旋充分混勻(終濃度:2mg/mLUCP-抗體結(jié)合物)d.將懸濁液倒入試劑瓶中，4t:保存?zhèn)溆?；B.樣品墊封閉液a.用天平精確稱量BSA(牛血清白蛋白)lg，放入小燒杯中；b.燒杯中加入pH=7.20.03mol/LPB緩沖液20mL，玻璃棒攪拌充分混勻；c.BAS溶液中加入Tween20(吐溫20)20yL，玻璃棒攪拌充分混勻(終濃度5%BAS，O.1%Tween20);d.4。C保存?zhèn)溆?；C.檢測帶蛋白a.用天平精確稱量純化的羊抗SARS病毒抗體2mg，置于1.5mL的微離心管中；b.微離心管中加入lmLpH=7.20.03mol/LPB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mU;c.分裝為50iiL每管，-2(TC凍存?zhèn)溆?；D.質(zhì)控帶蛋白；a.用天平精確稱量純化的羊抗兔IgG抗體2mg，置于1.5mL微離心管中；b.微離心管中加入lmLpH=7.20.03mol/LPB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mU;c.分裝為50iiL每管，-2(TC凍存?zhèn)溆茫?2)免疫層析固相載體材料準(zhǔn)備A.樣品墊a.選用纖維素膜(CelluloseMembrane)作為樣品墊固相材料，將其剪切成1.5X30.Ocm規(guī)格的條帶;b.將樣品墊放入長形平皿中，樣品墊封閉液加于其上，常溫浸泡30min;24c.將樣品墊由封閉液中取出，放于干凈的平皿中；d.37"烘干3小時，使樣品墊充分干燥；e.封閉后的樣品墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；B.結(jié)合墊a.選用玻璃纖維素膜(GlassFiber)作為結(jié)合墊固相材料，將其剪切成1.0X30.0cm規(guī)格的條帶;b.將4。C保存?zhèn)溆玫?mg/mLUCP-抗體結(jié)合物(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液，含1%蔗糖、1%BSA)超聲10s;c.將結(jié)合墊放入長形平皿中，UCP-抗體結(jié)合物懸濁液加于其上；d.將結(jié)合墊取出放于干凈的平皿中；e.37"烘干2.5小時，使結(jié)合墊充分干燥；f.處理后的結(jié)合墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫籆.分析膜a.以孔徑為12iim的硝酸纖維素膜(NitrocelluloseMembrane)作為固相材料，將其剪切成2.5X30cm規(guī)格的條帶；；b.用點樣儀在2.5cm寬的分析膜上，從下向上lcm處噴點2mg/mL羊抗SARS病毒抗體，2iiL/cm，作為檢測帶；c.用點樣儀在2.5cm寬的分析膜上，從下向上1.5cm處噴點2mg/mL羊抗兔IgG抗體，2iiL/cm，作為質(zhì)控帶；d.37。C烘干2小時，使分析膜充分干燥；e.點樣后的分析膜在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫籇.吸水墊:a.選用纖維素膜(CelluloseMembrane)作為吸水墊固相材料，將其剪切成3.0X30cm規(guī)格的條帶;b.將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙固定于吸水墊從下向上2.Ocm處，作為終點指示帶；c.吸水墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?3)免疫層析試紙條檢測A.將待檢測血清樣品用pH=7.20.03mol/LPB緩沖液10倍稀釋；B.100iiL稀釋后的樣品加于試紙條外殼上的加樣孔中；C.待終點指示窗口中的終點指示帶變?yōu)榫G色后，便可以用傳感器判讀外殼上結(jié)果判讀窗口中的檢測帶與質(zhì)控帶，以得出結(jié)果。實施例4:鼠疫FI-Ag(鼠疫FI-抗原)檢測(1)免疫層析液相材料準(zhǔn)備A.UCP-抗體結(jié)合物a.利用已建立的表面修飾與活化方法對直徑200-300nm的UCP顆粒進(jìn)行表面修飾，并與純化的兔抗鼠疫抗體進(jìn)行連接，在UCP保存液(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液中，含0.1%BSA、0.05%Tween20、0.02%NaN3)中以濃度lmg/mL，4。C保存?zhèn)溆?b.將保存于UCP保存液中的lmg/mLUCP-抗體結(jié)合物6mL，12000r/min，4°C，離心2530min，盡量棄盡上清；c.向離心管中的UCP-抗體結(jié)合物沉降，加入3mL結(jié)合物稀釋液(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液中，含1%蔗糖、1%BSA)渦旋充分混勻(終濃度2mg/mLUCP-抗體結(jié)合物)d.將懸濁液倒入試劑瓶中，4t:保存?zhèn)溆?；B.樣品墊封閉液a.用天平精確稱量BSA(牛血清白蛋白)lg，放入小燒杯中；b.燒杯中加入pH=7.20.03mol/LPB緩沖液20mL，玻璃棒攪拌充分混勻；c.BAS溶液中加入Tween20(吐溫20)20yL，玻璃棒攪拌充分混勻(終濃度5%BAS，O.1%Tween20);d.4。C保存?zhèn)溆?；C.檢測帶蛋白:a.用天平精確稱量鼠疫FI-抗原2mg，置于1.5mL的微離心管中；b.微離心管中加入lmLpH=7.20.03mol/LPB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mU;c.分裝為50iiL每管，-2(TC凍存?zhèn)溆?；D.質(zhì)控帶蛋白a.用天平精確稱量純化的羊抗兔IgG抗體2mg，置于1.5mL的微離心管中；b.微離心管中加入lmLpH=7.20.03mol/LPB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度:2mg/mU;c.分裝為50iiL每管，-2(TC凍存?zhèn)溆茫?2)免疫層析固相載體材料準(zhǔn)備A.樣品墊a.選用纖維素膜(CelluloseMembrane)作為樣品墊固相材料，將其剪切成1.5X30.Ocm規(guī)格的條帶;b.將樣品墊放入長形平皿中，樣品墊封閉液加于其上，常溫浸泡30min;c.將樣品墊由封閉液中取出，放于干凈的平皿中；d.37"烘干3小時，使樣品墊充分干燥；e.封閉后的樣品墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；B.結(jié)合墊a.選用玻璃纖維素膜(GlassFiber)作為結(jié)合墊固相材料，將其剪切成1.0X30.Ocm規(guī)格的條帶;b.將4。C保存?zhèn)溆玫?mg/mLUCP-抗體結(jié)合物(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液，含1%蔗糖、1%BSA)超聲10s;c.將結(jié)合墊放入長形平皿中，UCP-抗體結(jié)合物懸濁液加于其上；d.將結(jié)合墊取出放于干凈的平皿中；e.37"烘干2.5小時，使結(jié)合墊充分干燥；f.處理后的結(jié)合墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫籆.分析膜a.以孔徑為12iim的硝酸纖維素膜(NitrocelluloseMembrane)作為固相材料，將其剪切成2.5X30cm規(guī)格的條帶；；b.用點樣儀在2.5cm寬的分析膜上，從下向上1cm處噴點2mg/mL鼠疫FI-抗原，2iiL/cm，作為檢測帶；c.用點樣儀在2.5cm寬的分析膜上，從下向上1.5cm處噴點2mg/mL羊抗兔IgG抗體，2iiL/cm，作為質(zhì)控帶；d.37。C烘干2小時，使膜充分干燥；e.點樣后的分析膜在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；D.吸水墊a.選用纖維素膜(CelluloseMembrane)作為吸水墊固相材料，將其剪切成3.0X30cm規(guī)格的條帶;b.將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙固定于吸水墊從下向上2.0cm處，作為終點指示帶；d.吸水墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?3)免疫層析試紙條檢測A.將待檢測樣品用pH=7.20.03mol/LPB緩沖液10倍稀釋;B.100iiL稀釋后的樣品加于試紙條外殼上的加樣孔中；C.待終點指示窗口中的終點指示帶變?yōu)榫G色后，便可以用傳感器判讀外殼上結(jié)果判讀窗口中的檢測帶與質(zhì)控帶，以得出結(jié)果。實施例5:違禁藥品柃測l(1)免疫層析液相材料準(zhǔn)備A.UCP-抗體結(jié)合物a.利用已建立的表面修飾與活化方法對直徑200-300nm的UCP顆粒進(jìn)行表面修飾，并與純化的兔抗違禁藥品抗體或結(jié)合配基(違禁藥品包括安非他命、甲基安非他命、苯環(huán)己哌啶和鴉片酊等藥物分子)進(jìn)行連接，在UCP保存液(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液中，含O.1%BSA、0.05%Tween20、0.02%NaN3)中以濃度lmg/mL，4。C保存?zhèn)溆?b.將保存于UCP保存液中的lmg/mLUCP-抗體結(jié)合物6mL，12000r/min，4°C，離心30min，盡量棄盡上清；c.向離心管中的UCP-抗體結(jié)合物沉降，加入3mL結(jié)合物稀釋液(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液中，含1%蔗糖、1%BSA)渦旋充分混勻(終濃度2mg/mLUCP-抗體結(jié)合物)d.將懸濁液倒入試劑瓶中，4t:保存?zhèn)溆?；B.樣品墊封閉液a.用天平精確稱量BSA(牛血清白蛋白)lg，放入小燒杯中；b.燒杯中加入pH=7.20.03mol/LPB緩沖液20mL，玻璃棒攪拌充分混勻；c.BAS溶液中加入Tween20(吐溫20)20yL，玻璃棒攪拌充分混勻(終濃度5%BAS，O.1%Tween20);d.4。C保存?zhèn)溆?；C.檢測帶蛋白a.用天平精確稱量BSA-違禁藥品分子復(fù)合物2mg，置于1.5mL的微離心管中；b.微離心管中加入lmLpH=7.20.03mol/LPB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mU;c.分裝為50iiL每管，-2(TC凍存?zhèn)溆?；D.質(zhì)控帶蛋白a.用天平精確稱量純化的羊抗兔IgG抗體2mg，置于1.5mL微離心管中；b.微離心管中加入lmLpH=7.20.03mol/LPB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mU;c.分裝為50iiL每管，-2(TC凍存?zhèn)溆茫?2)免疫層析固相載體材料準(zhǔn)備A.樣品墊a.選用纖維素膜(CelluloseMembrane)作為樣品墊固相材料，將其剪切成1.5X30.0cm規(guī)格的條帶;b.將樣品墊放入長形平皿中，樣品墊封閉液加于其上，常溫浸泡30min;c.將樣品墊由封閉液中取出，放于干凈的平皿中；d.37"烘干3小時，使樣品墊充分干燥；e.封閉后的樣品墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；B.結(jié)合墊a.選用玻璃纖維素膜(GlassFiber)作為結(jié)合墊固相材料，將其剪切成1.0X30.0cm規(guī)格的條帶;b.將4。C保存?zhèn)溆玫?mg/mLUCP-抗體結(jié)合物(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液，含1%蔗糖、1%BSA)超聲10s;c.將結(jié)合墊放入長形平皿中，UCP-抗體結(jié)合物懸濁液加于其上；d.將結(jié)合墊取出放于干凈的平皿中；e.37"烘干2.5小時，使結(jié)合墊充分干燥；f.處理后的結(jié)合墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；C.分析膜a.以孔徑為12iim的硝酸纖維素膜(NitrocelluloseMembrane)作為固相材料，將其剪切成2.5X30cm規(guī)格的條帶；；b.用點樣儀在2.5cm寬的分析膜上，從下向上1cm處噴點2mg/mLBSA-違禁藥品分子復(fù)合物，2L/cm，作為檢測帶；c.用點樣儀在2.5cm寬的分析膜上，從下向上1.5cm處噴點2mg/mL羊抗兔IgG抗體，2iiL/cm，作為質(zhì)控帶；d.37。C烘干2小時，使分析膜充分干燥；e.點樣后的分析膜在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；D.吸水墊a.選用纖維素膜(CelluloseMembrane)作為吸水墊固相材料，將其剪切成3.0X30cm規(guī)格的條帶;b.將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙固定于吸水墊從下向上2.Ocm處，作為終點指示帶；c.吸水墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；[O461](3)免疫層析試紙條檢測A.將待檢測樣品用pH=7.20.03mol/LPB緩沖液10倍稀釋；B.100L稀釋后的樣品加于試紙條外殼上的加樣孔中；C.待終點指示窗口中的終點指示帶變?yōu)榫G色后，便可以用傳感器判讀外殼上結(jié)果判讀窗口中的檢測帶與質(zhì)控帶，以得出結(jié)果。實施例6:鼠疫感染抗體柃測l:(1)免疫層析液相材料準(zhǔn)備A.UCP-SPA結(jié)合物a.利用已建立的表面修飾與活化方法對直徑200-300nm的UCP顆粒進(jìn)行表面修飾，并與SPA(葡萄球菌蛋白A)進(jìn)行連接，在UCP保存液(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液中，含0.1%BSA、0.05%Tween20、0.02%NaN3)中以濃度lmg/mL，4。C保存?zhèn)溆?b.將保存于UCP保存液中的Img/mLUCP-SPA結(jié)合物6mL，12000r/min，4°C，離心30min，盡量棄盡上清；c.向離心管中的UCP-SPA結(jié)合物沉降，加入3mL結(jié)合物稀釋液(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液中，含1%蔗糖、1%BSA)渦旋充分混勻(終濃度:2mg/mLUCP-SPA結(jié)合物)d.將懸濁液倒入試劑瓶中，4t:保存?zhèn)溆?；B.樣品墊封閉液a.用天平精確稱量BSA(牛血清白蛋白)lg，放入小燒杯中；b.燒杯中加入pH=7.20.03mol/LPB緩沖液20mL，玻璃棒攪拌充分混勻；c.BAS溶液中加入Tween20(吐溫20)20yL，玻璃棒攪拌充分混勻(終濃度5%BAS，O.1%Tween20);d.4。C保存?zhèn)溆?；C.檢測帶蛋白a.用天平精確稱量鼠疫FI-Ag(鼠疫FI_Ag)2mg，置于1.5mL的微離心管中；b.微離心管中加入lmLpH=7.20.03mol/LPB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL鼠疫FI-Ag);c.分裝為50iiL每管，-2(TC凍存?zhèn)溆?；D.質(zhì)控帶蛋白a.用天平精確稱量羊IgG2mg，置于lmL的微離心管中；b.微離心管中加入lmLpH=7.20.03mol/LPB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL羊IgG);c.分裝為50iiL每管，-2(TC凍存?zhèn)溆茫?2)免疫層析固相載體材料準(zhǔn)備A.樣品墊a.選用纖維素膜(CelluloseMembrane)作為樣品墊固相材料，將其剪切成1.5X30.Ocm規(guī)格的條帶;b.將樣品墊放入長形平皿中，樣品墊封閉液加于其上，常溫浸泡30min;c.將樣品墊由封閉液中取出，放于干凈的平皿中；d.37"烘干3小時，使樣品墊充分干燥；e.封閉后的樣品墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；B.結(jié)合墊a.選用玻璃纖維素膜(GlassFiber)作為結(jié)合墊固相材料，將其剪切成1.0X30.0cm規(guī)格的條帶;b.將4t:保存?zhèn)溆玫?mg/mLUCP-SPA(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液，含1%蔗糖、1%BSA)超聲10s;c.將結(jié)合墊放入長形平皿中，UCP-SPA結(jié)合物懸濁液加于其上；d.將結(jié)合墊取出放于干凈的平皿中；e.37"烘干2.5小時，使結(jié)合墊充分干燥；f.處理后的結(jié)合墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫籆.分析膜a.以孔徑為12iim的硝酸纖維素膜(NitrocelluloseMembrane)作為固相材料，將其剪切成2.5X30cm規(guī)格的條帶；；b.用點樣儀在2.5cm寬的分析膜上，從下向上lcm處噴點2mg/mL鼠疫Fl-Ag，2iiL/cm，作為檢測帶；c.用點樣儀在2.5cm寬的分析膜上，從下向上1.5cm處噴點2mg/mL羊IgG，2yL/cm，作為質(zhì)控帶；d.37t:烘干2小時，使分析膜充分干燥；e.點樣后的分析膜在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；D.吸水墊a.選用纖維素膜(CelluloseMembrane)作為吸水墊固相材料，將其剪切成3.0X30cm規(guī)格的條帶;b.將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙固定于吸水墊從下向上2.Ocm處，作為終點指示帶；c.吸水墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?3)免疫層析試紙條檢測A.待檢測血清樣品用pH=7.20.03mol/LPB緩沖液10倍稀釋；B.lOOiiL稀釋后的樣品加于試紙條外殼上的加樣孔中；C.待終點指示窗口中的終點指示帶變?yōu)榫G色后，便可以用傳感器判讀外殼上結(jié)果判讀窗口中的檢測帶與質(zhì)控帶，以得出結(jié)果。實施例7:SARS病毒感染抗體檢測(1)免疫層析液相材料準(zhǔn)備A.UCP-SPA結(jié)合物a.利用已建立的表面修飾與活化方法對直徑200-300nm的UCP顆粒進(jìn)行表面修飾，并與SPA(葡萄球菌蛋白A)進(jìn)行連接，在UCP保存液(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液中，含0.1%BSA、0.05%Tween20、0.02%NaN3)中以濃度lmg/mL，4。C保存?zhèn)溆?30b.將保存于UCP保存液中的Img/mLUCP-SPA結(jié)合物6mL，12000r/min，4°C，離心30min，盡量棄盡上清；c.向離心管中的UCP-SPA結(jié)合物沉降，加入3mL結(jié)合物稀釋液(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液中，含1%蔗糖、1%BSA)渦旋充分混勻(終濃度:2mg/mLUCP-SPA結(jié)合物)d.將懸濁液倒入試劑瓶中，4t:保存?zhèn)溆?；B.樣品墊封閉液a.用天平精確稱量BSA(牛血清白蛋白)lg，放入小燒杯中；b.燒杯中加入pH=7.20.03mol/LPB緩沖液20mL，玻璃棒攪拌充分混勻；c.BAS溶液中加入Tween20(吐溫20)20yL，玻璃棒攪拌充分混勻(終濃度5%BAS，O.1%Tween20);d.4。C保存?zhèn)溆?；C.檢測帶蛋白a.用天平精確稱量純化的SARS病毒表面N蛋白2mg，置于1.5mL的微離心管中；b.微離心管中加入lmLpH=7.20.03mol/LPB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mLSARS病毒表面N抗原);c.分裝為50iiL每管，-2(TC凍存?zhèn)溆?；D.質(zhì)控帶蛋白a.用天平精確稱量純化的羊IgG2mg，置于lmL的微離心管中；b.微離心管中加入lmLpH=7.20.03mol/LPB緩沖液，渦旋充分混勻(終濃度2mg/mL羊IgG);c.分裝為50iiL每管，-2(TC凍存?zhèn)溆茫?2)免疫層析固相載體材料準(zhǔn)備A.樣品墊a.選用纖維素膜(CelluloseMembrane)作為樣品墊固相材料，將其剪切成1.5X30.Ocm規(guī)格的條帶;b.將樣品墊放入長形平皿中，樣品墊封閉液加于其上，常溫浸泡30min;c.將樣品墊由封閉液中取出，放于干凈的平皿中；d.37"烘干3小時，使樣品墊充分干燥；e.封閉后的樣品墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；B.結(jié)合墊a.選用玻璃纖維素膜(GlassFiber)作為結(jié)合墊固相材料，將其剪切成1.0X30.Ocm規(guī)格的條帶;b.將4。C保存?zhèn)溆玫?mg/mLUCP-SPA結(jié)合物(pH=7.20.03mol/LPB緩沖液，含1%蔗糖、1%BSA)超聲10s;c.將結(jié)合墊放入長形平皿中，UCP-SPA結(jié)合物懸濁液加于其上；d.將結(jié)合墊取出放于干凈的平皿中；e.37"烘干2.5小時，使結(jié)合墊充分干燥；f.處理后的結(jié)合墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆?；C.分析膜a.以孔徑為12iim的硝酸纖維素膜(NitrocelluloseMembrane)作為固相材料，將其剪切成2.5X30cm規(guī)格的條帶；b.用點樣儀在2.5cm寬的分析膜上，從下向上1cm處噴點2mg/mLSARS病毒表面N蛋白，2iiL/cm，作為檢測帶；c.用點樣儀在2.5cm寬的分析膜上，從下向上1.5cm處噴點2mg/mL羊IgG，2yL/cm，作為質(zhì)控帶；d.37t:烘干2小時，使分析膜充分干燥；e.點樣后的分析膜在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫籇.吸水墊a.選用纖維素膜(CelluloseMembrane)作為吸水墊固相材料，將其剪切成3.0X30cm規(guī)格的條帶;b.將變色范圍5.5-9.0的精密pH試紙固定于吸水墊從下向上2.Ocm處，作為終點指示帶；c.吸水墊在干燥的環(huán)境中保存?zhèn)溆茫?3)免疫層析試紙條檢測A.將待檢測血清樣品用pH=7.20.03mol/LPB緩沖液10倍稀釋；B.100L稀釋后的樣品加于試紙條外殼上的加樣孔中；C.待終點指示窗口中的終點指示帶變?yōu)榫G色后，便可以用傳感器判讀外殼上結(jié)果判讀窗口中的檢測帶與質(zhì)控帶，以得出結(jié)果。上述實施例有助于理解本發(fā)明，但是并不是對本發(fā)明的限制。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以根據(jù)上述實施例對本發(fā)明作出適當(dāng)?shù)男薷暮妥儎?，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。權(quán)利要求一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙，其特征在于，采用上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料即UCP作為生物標(biāo)記物對目標(biāo)被檢物進(jìn)行定量檢測。2.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，試紙條對目標(biāo)被檢物進(jìn)行檢測后，檢測結(jié)果在紅外光的照射下將以可見光光信號的形式表現(xiàn)出來。3.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，作為試紙條檢測結(jié)果的可見光光信號可用儀器進(jìn)行判讀。4.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于，該試紙條包括一外殼，外殼上包括加樣孔，結(jié)果判讀窗口和終點指示窗口。5.如權(quán)利要求4所述的試紙條，其特征在于，通過所述加樣孔，將生物樣品添加到樣品墊上；結(jié)果判讀窗口對應(yīng)于分析膜上的檢測帶和質(zhì)控帶；終點指示窗口對應(yīng)于吸水墊上的終點指示帶。6.如權(quán)利要求1所述的試紙條，其特征在于保存液為pH=7.20.03mol/L磷酸鹽緩沖液，含有0.05%-0.3%BSA，O.01%_0.1%Tween20，0.01%_0.1%NaN3;所述UCP生物活性分子的稀釋液為pH=7.20.03mol/L磷酸鹽緩沖液，含有0.5%_2%蔗糖，0.5%-3%BSA;所述樣品墊封閉液為pH=7.20.03mol/L磷酸鹽緩沖液，含有1%-10%BSA，O.05%-0.2%Tween20。7.—種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙的制備方法，其特征在于該方法為采用上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料即UCP作為生物標(biāo)記物對目標(biāo)被檢物進(jìn)行定量檢測；結(jié)合墊上固定有UCP標(biāo)記的葡萄球菌蛋白A;分析膜的檢測帶上固定有待測物的表面抗原，質(zhì)控帶上固定有IgG;所述UCP保存液為pH=7.20.03mol/L磷酸鹽緩沖液，含有0.05%-0.3%BSA，0.01%-0.1%Tween20，0.01%-0.1%NaN3;所述UCP生物活性分子的稀釋液為pH=7.2的O.03mol/L磷酸鹽緩沖液，含有0.5%_2%蔗糖，0.5%-3%BSA;所述樣品墊封閉液為pH=7.20.03mol/L磷酸鹽緩沖液，含有1%-10%BSA，O.05%-0.2%Tween20。全文摘要本發(fā)明公開了一種基于上轉(zhuǎn)換發(fā)光技術(shù)的免疫層析試紙，其采用上轉(zhuǎn)換發(fā)光材料即UCP作為生物標(biāo)記物，結(jié)果在紅外光的照射下以可見光光信號的形式表現(xiàn)出來，并可進(jìn)行儀器判讀，從而實現(xiàn)對目標(biāo)被檢物的定量檢測。其結(jié)構(gòu)主要包括樣品墊、結(jié)合墊或結(jié)合物釋放墊、分析膜、吸水墊和塑料背板。本發(fā)明還公開了該試紙條的制備方法和在生物樣品定量檢測中的應(yīng)用。依據(jù)其待測物質(zhì)發(fā)生免疫反應(yīng)方式的不同，將試紙條分為夾心模式、競爭模式和間接模式，各種模式可對樣品中的不同待測物質(zhì)進(jìn)行快速、靈敏地定性和定量檢測分析。文檔編號G01N33/52GK101788559SQ201010123110公開日2010年7月28日申請日期2004年4月23日優(yōu)先權(quán)日2004年4月23日發(fā)明者侯秀潔,周蕾,楊瑞馥,王津,鄭巖,郭兆彪申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所