專利名稱：一種糖尿病酮癥及其他酮體偏高癥狀診斷試紙的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于糖尿病酮癥及其他酮體偏高癥狀的臨床檢測(cè)領(lǐng)域，特別涉及一種糖尿 病酮癥及其他酮體偏高癥狀診斷試紙。
背景技術(shù)：
3-羥基丁酸(3-Hydroxybutyric acid)是脂肪代謝的終產(chǎn)物之一，約占酮體的 78%，而乙酰乙酸和丙酮占22%，分子式=C4H8O3，結(jié)構(gòu)式如下所示
OH O正常情況下，酮體的濃度基本恒定，而在糖尿病酮癥及其他酮體偏高癥狀發(fā)生早 期，3-羥基丁酸就可有明顯升高，此時(shí)乙酰乙酸尚無明顯變化。在酮癥恢復(fù)期，3-羥基丁酸 迅速下降時(shí)，乙酰乙酸在一定時(shí)間內(nèi)仍然保持升高或下降緩慢，這時(shí)用硝普鹽法會(huì)引起臨 床對(duì)病情的高估。因此，3-羥基丁酸的測(cè)定在糖尿病酮癥及其他酮體偏高癥狀的診斷、治療 監(jiān)測(cè)中比乙酰乙酸測(cè)定更靈敏，更可靠，同樣在糖尿病控制的預(yù)防中也非常有價(jià)值，正常人 血 3-羥基丁酸< 0. 27mmol/L0同時(shí)，3-羥基丁酸在奶牛酮病診斷預(yù)防中也是一個(gè)重要指標(biāo)奶牛酮病是泌乳奶牛 常見的營(yíng)養(yǎng)代謝病，主要類型有(1)原發(fā)性酮病(生產(chǎn)性或自發(fā)性酮病)(primary ketosis，productive ketosis orspontaneous ketosis)-干物質(zhì)攝入減少而能量需求增加所致的能量負(fù)平衡；(2)繼發(fā)性酮病(secondary ketosis)-采食量減少；(3)食物性酮病(alimentary ketosis)-青貯丁酸含量高；(4)饑餓性酮病(starvation ketosis)-體況不佳，飼料質(zhì)量不良；(5)特殊營(yíng)養(yǎng)缺乏性酮病(ketosis due to specific nutritional deficiency)-鈷缺乏、磷缺乏。酮病表現(xiàn)為高血酮持續(xù)能量負(fù)平衡，嚴(yán)重的會(huì)導(dǎo)致高血脂而發(fā)生脂肪肝，產(chǎn)奶量、 乳汁質(zhì)量下降，繁殖性能降低，以及內(nèi)分泌紊亂等，從而導(dǎo)致奶牛淘汰率增加，給奶牛場(chǎng)造 成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。據(jù)研究，美國(guó)奶牛的酮病發(fā)生率達(dá)到17%，印度達(dá)15%，而加拿大，在 泌乳期的前9周，奶牛亞臨床酮病的發(fā)病率高達(dá)59%。我國(guó)奶牛酮病的發(fā)病率占泌乳牛的 10% 30%，且發(fā)病率有逐年上升的趨勢(shì)。定期對(duì)奶牛奶酮，尿酮，血酮水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，更好 地控制和預(yù)防酮病，減少奶牛場(chǎng)的經(jīng)濟(jì)損失。牛奶中3-羥基丁酸、丙酮的變化臨界值常用于診斷奶牛酮病的手段。血酮在 100mg/L 200mg/L為亞臨床酮病，60mg/L 100mg/L為可疑酮?。谎獫{中BHBA正常值為 小于1.0mmol/L，當(dāng)其在lmmol/L 2. 5mmol/L為亞臨床型酮病。奶牛血清中的BHBA在 0. 9mmol/L以下為正常，0. 9mmol/L 1. 7mmol/L為輕微酮血癥，大于1. 7mmol/L為嚴(yán)重酮 血癥。尿酮正常為3mg/L 30mg/L，在30mg/L以上為異常，在100mg/L以上為亞臨床癥狀。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種糖尿病酮癥及其他酮體偏高癥狀診斷試 紙，該試紙可以組裝成多種檢測(cè)裝置，且具有操作方便，檢測(cè)快速，靈敏度好，準(zhǔn)確性高等優(yōu) 點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的一種糖尿病酮癥及其他酮體偏高癥狀診斷試紙，包括如下試劑
草酸 200-2000mg ；
NADP+(輔酶 11)0. 01-1. Og ；
3-羥基丁酸脫氫酶2000-100000iu ；(1)第一相浸液 總體積ν = IOOml穩(wěn)定劑和/或保護(hù)劑I-IOg ；牛血清白蛋白20_2000mg ；NAD+ (輔酶 I) 0. 1-2. Og ；黃遞酶200_20000iu ；補(bǔ)加緩沖液至總體積為IOOml ；(2)第二相浸液 總體積ν = IOOm氯化硝基四氮唑藍(lán)NBT 0. 1-0. 5g ；吩嗪二甲酯硫酸鹽PMS 0. 02-0. 2g ；補(bǔ)加有機(jī)溶劑至總體積為IOOml ；所述的穩(wěn)定劑和/或保護(hù)劑是天然或人工聚合高分子膠體；選自明膠、阿拉伯膠、 牛血清白蛋白、聚乙二醇、聚丙烯酸_丙烯酸酯中的一種或幾種混合物；所述的緩沖液為pH = 5. 8-8. 8的40-80mmol/L Tris-丙二酸緩沖液或磷酸鹽緩 沖液；所述的有機(jī)溶劑為乙醇或甲醇；本發(fā)明的一種糖尿病酮癥及其他酮體偏高癥狀診斷試紙的制備方法，包括(1)將濾紙?jiān)谏鲜龅谝幌嘟褐薪?-8分鐘后，吸取過多的浸液，于20_50°C下 迅速溫?zé)岣稍?，再在第二相浸液中浸?-8分鐘后，于20-50°C下再次干燥，得到測(cè)定試紙 的原紙；(2)將上述測(cè)定試紙的原紙粘貼在塑料片基上，切割成塊，制得測(cè)定試劑條。所述的試劑條的規(guī)格為0. 3X0. 3 0. 8X0. 8cm2。本發(fā)明的反應(yīng)原理如下
3-羥基丁酸脫氫酶
^乙酰乙酸+NAD (P) H+H+
3-羥基丁酸+NAD (P).
NAD(P)H+NBTNAD (P) H+PMS — NAD (P) ++PMS · H2PMS · H2+NBT — PMS+formazan其中，NAD+:輔酶I;NADH 還原輔酶 I ；NADP 輔酶 II ；
Diaphorase
^ NAD(P)+ + formazan
NADPH 還原輔酶 II;Diaphorase :黃遞8| ；NBT 硝基四氮唑藍(lán)，氯化硝基四氮唑藍(lán)一類顯色劑；PMS 吩嗪二甲酯硫酸鹽；formazan 甲臜(為藍(lán)紫色化合物)；生成的formazan的顯色程度與待測(cè)體液的3_羥基丁酸濃度正相關(guān)，可以印制成 標(biāo)準(zhǔn)色卡附加在包裝材料(密封袋或說明書)上，顯色的程度與標(biāo)準(zhǔn)色可比較從而半定量 測(cè)定3-羥基丁酸濃度。有益效果本發(fā)明的診斷試紙可以組裝成多種檢測(cè)裝置，且具有操作方便，檢測(cè)快速，靈敏度 好，準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，可以半定量檢測(cè)常規(guī)液體(如，牛奶、尿液)、血液(如，血清/全血) 中的3-羥基丁酸的含量，具有良好的應(yīng)用前景。


圖1為試劑塊與PVC片所組成的檢測(cè)裝置；圖2為由試劑塊、濾血膜、兩片PVC片所組成的檢測(cè)裝置；其中，一片PVC作為顯色面，另一片PVC作為加樣面。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。實(shí)施例1第一相酶溶液液總體積為IOOmL的配制過程如下1)溶入阿拉伯膠5g ；2)溶入牛血清白蛋白500mg ；3)溶入草酸 300mg ；4)溶入 NAD+0. 5g, NADP+O. 2g ；5)溶入黃遞酶，IOOOOiu ；6)溶入3-羥基丁酸脫氫酶IOOOOOiu ；7)加入 pH8. 0 的 50mmol/L Tris-丙二酸緩沖液至 IOOml ；第一相溶液浸漬溶液制備好后，加入浸漬機(jī)，將一卷Whatman 3匪濾紙安裝好，烘干溫度設(shè)定 30°C，走紙速度設(shè)定3. Omm/秒，開始浸漬走紙，溶液浸完后濾紙?jiān)诤娓上渫Ａ?小時(shí)，以便 完全烘干；第二相溶液制備溶入氯化硝基四氮唑藍(lán)250mg ；(即濃度為0. 25g/100ml)吩嗪二甲酯硫酸鹽IOOmg ；(即濃度為0. 10g/100ml)
以無水乙醇IOOml為溶劑。第二相溶液浸漬將第二相溶液加入浸漬機(jī)，將浸好第一相的濾紙安裝好，烘干溫度設(shè)定45°C，走紙 速度設(shè)定3. Omm/秒，開始浸漬走紙，溶液浸完后濾紙?jiān)诤娓上渫Ａ?小時(shí)，以便完全烘干， 至此原紙制作完成。試紙制作取一段原紙，單面貼好雙面膠，用5mm滾刀切成5mm細(xì)條，將細(xì)條貼在 8cm*25cm寬的pvc薄片上，在用滾刀切成5mm寬的試劑條，放到黑色密閉瓶中，放好干燥劑牛奶3-羥基丁酸濃度的測(cè)定3-羥基丁酸鈉 sigma :H6501新鮮牛奶(光明)，稱取12.60mg3_羥基丁酸鈉，加入IOOml鮮牛奶中溶解，分別 用鮮牛奶稀釋成 0umol/L，50umol/L，100umol/L, 200umol/L, 500umol/L, 1 OOOumo 1/L 六種 濃度。取六根實(shí)施例1制備的試劑條同時(shí)浸入上述六種溶液中，約十秒鐘取出，用吸水紙吸 去多余水分，然后兩分鐘看顏色，結(jié)果從陰性的黃色到lOOOumol/L的深紫色各梯度區(qū)分明顯。實(shí)施例2第一相酶溶液液總體積為IOOmL的配制過程如下8)溶入阿拉伯膠5g ；9)溶入牛血清白蛋白500mg ；10)溶入草酸 300mg ；11)溶入 NAD+0. 5g, NADP+O. 2g ；12)溶入黃遞酶，IOOOOiu ；13)溶入3-羥基丁酸脫氫酶IOOOOOiu ；14)加入 ρΗ8· 0 的 50mmol/L Tris-丙二酸緩沖液至 IOOrnl ；第一相溶液浸漬溶液制備好后，加入浸漬機(jī)，將一卷Whatman 3匪濾紙安裝好，烘干溫度設(shè)定 30°C，走紙速度設(shè)定3. Omm/秒，開始浸漬走紙，溶液浸完后濾紙?jiān)诤娓上渫Ａ?小時(shí)，以便 完全烘干；第二相溶液制備溶入氯化硝基四氮唑藍(lán)250mg ；吩嗪二甲酯硫酸鹽IOOmg ；以無水乙醇100ml為溶劑。第二相溶液浸漬將第二相溶液加入浸漬機(jī)，將浸好第一相的濾紙安裝好，烘干溫度設(shè)定45°C，走紙 速度設(shè)定3. Omm/秒，開始浸漬走紙，溶液浸完后濾紙?jiān)诤娓上渫Ａ?小時(shí)，以便完全烘干， 至此原紙制作完成。試紙制作取一段原紙，單面貼好雙面膠，用5mm滾刀切成5mm細(xì)條，將細(xì)條貼在 8cm*25cm寬的pvc薄片上，在用滾刀切成5mm寬的試劑條，放到黑色密閉瓶中，放好干燥劑 備用。(圖1)
全血3-羥基丁酸濃度的測(cè)定取一段原紙用8mm滾刀切成8mm細(xì)條，然后再用剪刀剪成方塊備用，在8cm*25cm 寬的pvc薄片單側(cè)貼好雙面膠，然后用8mm滾刀切成8mm寬的細(xì)條，在距一端IOmm處打直 徑5mm的孔，將試劑塊貼在打孔的位置上，試劑塊上面覆蓋一塊10mm*5mm的濾血膜，備用。 (圖2)取10份用雅培C8000生化儀測(cè)定3_羥基丁酸的血樣用上述試條測(cè)定，結(jié)果陰陽(yáng) 性，及陽(yáng)性標(biāo)本的濃度，基本和生化儀的結(jié)果相符。實(shí)施例3第一相酶溶液液總體積為IOOmL的配制過程如下1)溶入阿拉伯膠5g ；2)溶入牛血清白蛋白500mg ；3)溶入草酸 300mg ；4)溶入 NAD+0. 5g, NADP+O. 5g ；5)溶入黃遞酶，IOOOOiu ；6)溶入3-羥基丁酸脫氫酶IOOOOOiu ；7)加入 ρΗ8· 7 的 80mmol/L Tris-丙二酸緩沖液至 IOOml ；第一相溶液浸漬溶液制備好后，加入浸漬機(jī)，將一卷Whatman 3匪濾紙安裝好，烘干溫度設(shè)定 30°C，走紙速度設(shè)定3. Omm/秒，開始浸漬走紙，溶液浸完后濾紙?jiān)诤娓上渫Ａ?小時(shí)，以便 完全烘干；第二相溶液制備溶入氯化硝基四氮唑藍(lán)250mg ；吩嗪二甲酯硫酸鹽IOOmg ；以無水乙醇IOOml為溶劑。第二相溶液浸漬將第二相溶液加入浸漬機(jī)，將浸好第一相的濾紙安裝好，烘干溫度設(shè)定45°C，走紙 速度設(shè)定3. 0mm/，開始浸漬走紙，溶液浸完后濾紙?jiān)诤娓上渫Ａ?小時(shí)，以便完全烘干，至 此原紙制作完成。試紙制作取一段原紙，單面貼好雙面膠，用5mm滾刀切成5mm細(xì)條，將細(xì)條貼在 8cm*25cm寬的pvc薄片上，在用滾刀切成5mm寬的試劑條，放到黑色密閉瓶中，放好干燥劑 備用。(圖1)尿液3-羥基丁酸濃度的測(cè)定3-羥基丁酸鈉 sigma :H6501陰性尿液3-羥基丁酸，稱取12. 60mg3-羥基丁酸鈉，加入IOOm陰性尿液中溶解， 分別用陰性尿液稀釋成 Oumol/L，100umol/L, 200umol/L, 500umol/L, 1000umol/L 五種濃 度。取5根實(shí)施例2制備的試劑條同時(shí)浸入上述5種溶液中，約十秒鐘取出，用吸水紙吸去 多余水分，然后兩分鐘看顏色，結(jié)果從0的黃色到lOOOumol/L的深紫色各梯度區(qū)分明顯。
權(quán)利要求
一種糖尿病酮癥及其他酮體偏高癥狀診斷試紙，包括如下試劑(1)第一相浸液v＝100ml穩(wěn)定劑和/或保護(hù)劑1 10g；牛血清白蛋白20 2000mg； 草酸200 2000mg；NAD+(輔酶I)0.1 2.0g；NADP+(輔酶II)0.01 1.0g；黃遞酶200 20000iu； 3 羥基丁酸脫氫酶2000 100000iu；補(bǔ)加緩沖液至總體積為100ml；(2)第二相浸液 v＝100m氯化硝基四氮唑藍(lán)NBT 0.1 0.5g；吩嗪二甲酯硫酸鹽PMS 0.02 0.2g；補(bǔ)加有機(jī)溶劑至總體積為100ml。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種糖尿病酮癥及其他酮體偏高癥狀診斷試紙，其特征在 于所述的穩(wěn)定劑和/或保護(hù)劑是天然或人工聚合高分子膠體；選自明膠、阿拉伯膠、牛血 清白蛋白、聚乙二醇、聚丙烯酸-丙烯酸酯中的一種或幾種混合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種糖尿病酮癥及其他酮體偏高癥狀診斷試紙，其特征在 于所述的緩沖液為PH = 5. 8-8. 8的40-80mmol/L Tris-丙二酸緩沖液或磷酸鹽緩沖液。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種糖尿病酮癥及其他酮體偏高癥狀診斷試紙，其特征在 于所述的有機(jī)溶劑為乙醇或甲醇。
5.一種糖尿病酮癥及其他酮體偏高癥狀診斷試紙的制備方法，包括(1)將濾紙?jiān)谏鲜龅谝幌嘟褐薪?-8分鐘后，吸取過多的浸液，于20-50°C下迅速 溫?zé)岣稍铮僭诘诙嘟褐薪?-8分鐘后，于20-50°C下再次干燥，得到測(cè)定試紙的原 紙；(2)將上述測(cè)定試紙的原紙粘貼在塑料片基上，切割成塊，制得測(cè)定試劑條。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種糖尿病酮癥及其他酮體偏高癥狀診斷試紙條的制備方 法，其特征在于所述的試劑條的規(guī)格為0. 3X0. 3 0. 8X0. 8cm2。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種糖尿病酮癥及其他酮體偏高癥狀診斷試紙，包括如下試劑(1)第一相浸液穩(wěn)定劑和保護(hù)劑、牛血清白蛋白、草酸、NAD+、NADP+、黃遞酶、3-羥基丁酸脫氫酶及緩沖液；(2)第二相浸液NBT、PMS及有機(jī)溶劑；其制備包括將濾紙?jiān)诘谝幌嘟褐薪莺螅∵^多的浸液，于20-50℃下迅速溫?zé)岣稍?，再在第二相浸液中浸泡，?0-50℃下再次干燥，得到測(cè)定試紙的原紙；然后粘貼在塑料片基上，切割成塊，制得測(cè)定試劑條。本發(fā)明的診斷試紙可以組裝成多種檢測(cè)裝置，且具有操作方便，檢測(cè)快速，靈敏度好，準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，可以半定量檢測(cè)牛奶、尿液、血液中的3-羥基丁酸的含量，具有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N21/78GK101900734SQ201010104920
公開日2010年12月1日 申請(qǐng)日期2010年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月3日
發(fā)明者孫大尼, 王福進(jìn), 管利豐 申請(qǐng)人:上海高豐醫(yī)療電器有限公司