專利名稱：蘿卜紅色素中花色苷的高效液相色譜檢測方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于化學(xué)分析檢測領(lǐng)域，特別涉及一種用高效液相色譜檢測蘿卜紅色素中
花色苷的定量分析方法。
背景技術(shù)：
食用色素作為食品添加劑的一個重要類別，在食品的研究和應(yīng)用開發(fā)中起著重要 作用。食用色素分為合成色素和天然色素兩類，合成色素由于安全性問題而受到的限制越 來越多。 一些西方國家如挪威等，已完全禁止使用合成色素，我國對合成色素的使用也有 很嚴(yán)格的規(guī)定，其使用范圍越來越窄。相比之下，天然色素由于來源于自然界的植物或動 物，具有諸多優(yōu)點絕大多數(shù)天然色素?zé)o毒副作用，安全性高；很多天然色素含有人體所必 須的營養(yǎng)物質(zhì)，或其本身就是維生素或具有維生素性質(zhì)的物質(zhì)，如核黃素、P _胡蘿卜素等； 有的天然色素具有一定的藥理藥效作用。 花色苷類色素作為六大類天然植物色素之一，廣泛地存在自然界的多種植物中。 其中食用天然色素中的蘿卜紅、高粱紅、紫甘薯色素、葡萄皮色素均屬于花色苷類色素。并 且，由于花色苷具有消炎、抗腫瘤、清除氧自由基、抑制脂蛋白氧化和血小板聚集的功能，使 其逐漸成為倍受推崇的食用天然紅色素。然而，由于花色苷類色素的成分極為復(fù)雜多樣，目 前，這類色素的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)依舊采用分光光度計測定色素色價的方法，無法滿足對色素成分 定量分析的要求。 蘿卜紅色素是從紅蘿卜塊根組織中提制的一種食用天然色素，多為天竺葵素 (Pelargonidin)的葡萄糖苷衍生物，屬花色苷類(Anthocyanin)。因此，能夠真實準(zhǔn)確的測 定蘿卜紅色素中花色苷尤其是天竺葵-3-0-葡萄糖苷的含量具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種高效液相色譜檢測蘿卜紅色素中花色苷的定量分析方 法。該項技術(shù)利用高效液相色譜法不僅可以對蘿卜紅色素中的花色苷進(jìn)行定性，而且還可 以進(jìn)行定量分析，在測定方面客觀真實地反映其含量，方法簡單，測定準(zhǔn)確。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下 —種蘿卜紅中花色苷的高效液相色譜檢測方法，其特征在于，采用反相高效液相 色譜法，高效液相色譜條件為色譜柱十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的C18色譜柱，250X4. 6mm， 5 y m ;
流動相組成體積比乙腈5%甲酸溶液=24 : 76;
流速1. 0mL/min ; 柱溫25。C; 檢測波長525nm; 進(jìn)樣量10iiL。 本發(fā)明具有如下的優(yōu)點和積極效果
1、本發(fā)明方法簡單，測定結(jié)果準(zhǔn)確、靈敏、重現(xiàn)性好。 2、線性試驗及檢出限試驗結(jié)果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，花色苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性 關(guān)系良好(r > 0. 999);檢出限為0. 0025mg/mL ;測定方法的回收率在97% _100%之間。


圖1蘿卜紅樣品的高效液相色譜圖。 圖2花色苷天竺葵-3-0-葡萄糖苷的高效液相色譜圖。
具體實施例方式
主要實驗儀器及色譜條件 福立FL2200型高效液相色譜儀，配自動進(jìn)樣器和紫外(UV)檢測器。色譜柱十八 烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的C18色譜柱，250X4.6mm，5iim;流動相乙腈5%甲酸溶液 =24 : 76(體積比);流速1. OmL/min ;柱溫25。C ;檢測波長:525nm ;進(jìn)樣量:10y L。
試劑與藥品 天竺葵-3-0-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)對照品(>99.0)，蘿卜紅色素樣品(E50)，乙腈(色 譜純)，甲醇(色譜純)，甲酸(分析純)，超純水(電阻率IS. ，Q cm)。
實施步驟一 高效液相色譜條件的選擇 在試驗研究過程中，采用了多組洗脫溶劑體系分離樣品，如乙腈-甲醇，乙腈-水， 甲醇_水體系，另外考察了 PH對樣品分離度的影響。由于天竺葵-3-0-葡萄糖苷中酚羥基 在水溶液中容易發(fā)生電離，極性增強(qiáng)，在固定相表面形成雙重保留機(jī)理，色譜峰拖尾嚴(yán)重， 定量分析誤差較大。因此選擇在流動相中加入甲酸調(diào)節(jié)pH。當(dāng)甲酸加入量為10%、9%、 7%、5%、3%時，天竺葵-3-0-葡萄糖苷色譜峰的保留時間分別為2. 32、2. 67、2. 97、3. 60、 4. 91min，結(jié)合峰型和保留時間，最終確定甲酸加入量為5%， pH值在3以上，符合色譜條件 的要求，并能明顯改善色譜峰形(見圖1)。 在流動相為乙腈-甲醇體系中，在不加酸的情況下，色譜峰比較寬，樣品沒有完全 分離導(dǎo)致保留時間較短而且峰形不佳。在流動相為甲醇-水的體系中，甲醇的洗脫能力不 強(qiáng)，保留時間延長，天竺葵-3-0-葡萄糖苷的峰與其他組分疊在一起，沒能分離開，峰形不 對稱，基線明顯漂移。在流動相為乙腈_水的體系中，隨著流動相中甲酸水溶液的比例的增 加，改善了天竺葵-3-0-葡萄糖苷峰拖尾和峰形不對稱的問題，可以達(dá)到理想的保留時間 和分離效果。結(jié)果表明以乙腈_5%甲酸溶液(24 : 76，V/V)為流動相獲得了較優(yōu)的色譜 分離效果。 實施步驟二 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品溶液的制備 稱取天竺葵-3-0-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)對照品5. Omg，加甲醇溶解，定容于5mL容量瓶中 即得1. Omg/mL標(biāo)準(zhǔn)對照品儲備液，放入_201:冰箱中冷藏，備用。 取一定量蘿卜紅色素樣品，用甲醇定容于lOmL容量瓶中，搖勻，即得待測樣品溶 液，放入_201:冰箱中冷藏，備用。進(jìn)樣時用0. 45 ii m濾膜過濾。
實施步驟三標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別吸取O. 05、0. 1、0. 2、0. 5、1. OmL天竺葵-3_0_葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品儲備液，用甲醇 定容于5mL容量瓶中配制成_系列不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，在較優(yōu)的色譜條件下進(jìn)行色譜分析，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，計算校準(zhǔn)曲線回歸方程為Y = 8. 61 X 10—8X-0. 0048， 線性相關(guān)系數(shù)r = 0.999。試驗表明，天竺葵-3-0-葡萄糖苷在0.01-0. 10mg/mL范圍內(nèi)呈 良好的線性關(guān)系。將標(biāo)準(zhǔn)液逐級稀釋進(jìn)樣，測其峰高響應(yīng)值及基線噪音強(qiáng)度，以3倍信噪比 計算檢出限為0. 0025mg/mL。
實施步驟四樣品的測定 吸取10 ii L經(jīng)O. 45 ii m微孔膜過濾的蘿卜紅色素溶液(2mg/mL)，注入液相色譜儀， 比較樣品與標(biāo)準(zhǔn)品的高效液相色譜圖，依組分保留時間進(jìn)行定性分析，與標(biāo)準(zhǔn)樣品高效液 相色譜圖中相同時間的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線比較進(jìn)行定量分析。按下式計算蘿卜紅色素 中天竺葵-3-0-葡萄糖苷含量
伊奉中花伊苷含旦(mn/i:)-測定的花色苷濃度^g/mL)x色素樣品定容體積(mL) 八 3g g - 色素樣品總質(zhì)量(g) 測得的蘿卜紅色素樣品中天竺葵-3-0-葡萄糖苷平均含量為34. 15mg/g。
權(quán)利要求
一種蘿卜紅色素中花色苷的高效液相色譜檢測方法，其特征在于采用紫外檢測器，十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的C18色譜柱，以乙腈和甲酸溶液為流動相，采用525nm為檢測波長，樣品采用甲醇溶解，0.45μm濾膜過濾，以外標(biāo)法定量計算蘿卜紅樣品中花色苷含量。
2. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的蘿卜紅色素中花色苷的高效液相色譜檢測方法，其特征在于 采用紫外檢測器。
3. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的蘿卜紅色素中花色苷的高效液相色譜檢測方法，其特征在于 采用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的C18色譜柱。
4. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的蘿卜紅色素中花色苷的高效液相色譜檢測方法，其特征在于 流動相采用乙腈5%甲酸溶液=24 : 76(體積比)。
5. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的蘿卜紅色素中花色苷的高效液相色譜檢測方法，其特征在于 采用最佳檢測波長為525nm。
6. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的蘿卜紅色素中花色苷的高效液相色譜檢測方法，其特征在于 樣品采用甲醇溶解，0. 45 ii m濾膜過濾。
7. 根據(jù)權(quán)利1要求所述的蘿卜紅色素中花色苷的高效液相色譜檢測方法，其特征在于 樣品根據(jù)組分保留時間進(jìn)行定性分析，與標(biāo)準(zhǔn)樣品高效液相色譜圖中相同時間的峰面積與 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線比較進(jìn)行定量分析。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用高效液相色譜檢測蘿卜紅色素中花色苷的定量分析方法，其特征在于本發(fā)明采用反相高效液相色譜法，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑的C18色譜柱(4.6mm×250mm×5μm)，流動相為乙腈-5％甲酸溶液(24∶76，v/v)，流速為1.0mL/min，柱溫為25℃，在紫外檢測波長525nm條件下進(jìn)樣10μL。根據(jù)樣品的保留時間和色譜圖進(jìn)行定性分析，根據(jù)峰面積進(jìn)行定量分析。該發(fā)明的優(yōu)點在于方法先進(jìn)，靈敏度高，重現(xiàn)性、選擇性好，適用于蘿卜紅色素中花色苷的微量分析。
文檔編號G01N30/50GK101776659SQ20101010490
公開日2010年7月14日 申請日期2010年2月3日 優(yōu)先權(quán)日2010年2月3日
發(fā)明者楊寅, 歐陽杰, 武彥文, 汪雨, 游輝, 陳舜琮 申請人:北京市理化分析測試中心