專利名稱：一種確定牛乳過敏原表位關(guān)鍵氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及表位的精確定位。
背景技術(shù)：
牛乳過敏是一種常見的食物過敏反應(yīng)，1-2%的成人和高達8%的三歲以下兒童會 對牛乳產(chǎn)生食物過敏反應(yīng)。牛乳中含有將近20種蛋白質(zhì)都具有潛在的致敏性，據(jù)報道牛乳 過敏人群對牛乳的過敏一般表現(xiàn)為對多個蛋白的共過敏。乳球蛋白、a-乳白蛋白、酪 蛋白被認為是主要的過敏原，其他蛋白如牛血清白蛋白、免疫球蛋白、乳鐵蛋白在過敏反應(yīng) 中也起著非常重要的作用，有大約30% 50%的牛乳過敏者對這些微量蛋白過敏，且其中 有些患者只對這些微量蛋白過敏。日-乳球蛋白占牛奶總蛋白的10%，乳清蛋白的50%。3 _乳球蛋白是公認的主 要乳過敏原之一，大約82%的牛乳過敏患者對乳球蛋白過敏。母乳中不存在乳球 蛋白，這也是其成為主要過敏原的原因之一。同時，乳球蛋白屬lipocalin蛋白家族， lipocalin蛋白具有相同的由重復(fù)排列的8或10個反向平行的折片組成的桶狀結(jié) 構(gòu)。由于其復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，lipocalin蛋白家族中許多蛋白質(zhì)具有強的致敏性，一些動物源性 過敏原都屬于這類蛋白，如馬的主要過敏原Equ c 1、主要的鼠蛋白等。乳球蛋白耐酸 和耐蛋白酶水解。因此，消化后人體內(nèi)還存在著完整的乳球蛋白及其肽段，可能會引起 過敏反應(yīng)。日-乳球蛋白的存在形式與pH值有關(guān)，在鮮牛乳中(pH6. 6 6. 8)，它是以二聚體 的形式存在，當PH低于3. 5時，二聚體離解成單體，pH在3. 5 5. 2之間時，二聚體四聚化 形成八聚體，PH高于7. 5時，二聚體解離且構(gòu)象發(fā)生變化形成膨脹的單體。0 _乳球蛋白一 般是二聚體，其每個單體為18kDa，含有162個氨基酸，5個二硫鍵，其中4個為鏈內(nèi)，1個為 鏈間。“水牛奶中3 -乳球蛋白過敏原表位定位的初步研究”(《食品科學(xué)》2007，vol. 28， No. 10, P360-363)中公開了水牛奶中0 _乳球蛋白過敏原表位定位的初步研究結(jié)果，即 利用免疫親和純化的特異性兔血清對噬菌體隨機七肽庫進行親和淘選，并借助網(wǎng)絡(luò)工具 MIM0X分析，確定乳球蛋白過敏原的表位區(qū)，但不能確定其中的關(guān)鍵氨基酸。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在確定過敏原表位區(qū)的基礎(chǔ)上，加入對表位的理論預(yù)測以及通過 噬菌體展示技術(shù)和肽掃描相結(jié)合的方法對牛奶中0"乳球蛋白進行正確和全面的表位定 位并進一步確定其中的關(guān)鍵氨基酸。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。1、根據(jù)初步確定的模擬表位區(qū)氨基酸序列，合成表位肽段，并固定和保護，合成肽 段的c端共價結(jié)合到活化的纖維膜上，N端被乙酰化；2、用單個甘氨酸作為陰性對照，將合成的氨基酸序列與多克隆血清反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)的強度，確定乳球蛋白的主要表位；3、將乳球蛋白的主要表位中的每個氨基酸依次被丙氨酸或甘氨酸取代，得到 需合成的氨基酸序列；4、由步驟3得到的氨基酸序列，再合成表位肽段，并固定和保護，合成肽段的C端 共價結(jié)合到活化的纖維膜上，N端被乙?；?；5、用單個甘氨酸作為陰性對照，將合成的氨基酸序列與多克隆血清反應(yīng)，根據(jù)反 應(yīng)的強度，確定牛乳表位中的關(guān)鍵氨基酸。本發(fā)明以生物信息學(xué)預(yù)測B細胞表位的結(jié)果為基礎(chǔ)，采用相應(yīng)的多克隆抗體為 靶分子，通過噬菌體展示技術(shù)和肽掃描技術(shù)精確定位乳球蛋白的線性表位，可為闡明
乳球蛋白過敏的物質(zhì)基礎(chǔ)，進行乳過敏的診斷、治療以及食品中過敏原的檢測奠定基 礎(chǔ)，為開發(fā)低過敏性牛乳提供理論依據(jù)和技術(shù)支持，同時該方法也為其它食物過敏原表位 的精確定位提供新的途徑。


圖1為DANStar軟件多參數(shù)預(yù)測結(jié)果。圖2為親水性、a -螺旋，日-轉(zhuǎn)角和日-折疊的預(yù)測結(jié)果。圖3為本發(fā)明MIM0X序列比對的界面。圖4為本發(fā)明112個模擬表位中氨基酸對應(yīng)的乳球蛋白位點。圖5為肽掃描結(jié)果。圖6為1#兔血清識別不同肽段的強度。圖7為3#兔血清識別不同肽段的強度。圖8為4#兔血清識別不同肽段的強度。圖9為氨基酸置換方法確定關(guān)鍵氨基酸。
具體實施例方式本發(fā)明將通過以下實施例作進一步說明。實施例。本實施例所選材料純度達90%以上水牛乳0 _乳球蛋白，相應(yīng)的多克隆抗體，滴 度達1 40萬以上。所用水牛乳0 -乳球蛋白的制備為以下步驟以 DEAE-S印harose Fast Flow 陰離子交換(1. 2cmX 30cm)進行分離，先用 pH6. 8， 0. 02mol/L磷酸鹽起始緩沖液平衡離子交換柱；取適當稀釋超濾后的乳清，上樣；pH6. 8， 0. 02mol/L磷酸鹽平衡緩沖液洗脫未被吸附的蛋白質(zhì)，約200mL ；含0 0. 5mol/L NaCl磷 酸鹽緩沖液連續(xù)洗脫被吸附的蛋白質(zhì)，洗脫速度為1. 5mL/min ；收集目標洗脫峰，用截流分 子量5kDa Amicon Ultra_15超濾離心管超濾濃縮至1/50體積超濾濃縮后的離子交換目標 產(chǎn)物上S印hadexG-75凝膠層析柱(1. 2cmX 75cm)進一步分離裝柱，將柱材用真空泵脫氣； 0. 02mol/L pH6. 8的磷酸鹽緩沖液平衡凝膠層析柱；平衡后，上樣；0. 02mol/L pH6. 8的磷 酸鹽緩沖液洗脫，洗脫速度8mL/h。收集目標峰，超濾濃縮至1/50體積。得到的純化的目 標蛋白，采用SDS-PAGE、IEF-PAGE和ESI-Q-T0F-MS進行鑒定，其純度高達90%以上，并適用于實驗室小量和中量制備。以純化的牛乳乳球蛋白為抗原，初次免疫用弗氏完全佐劑；加強免疫用弗氏 不完全佐劑；免疫途徑以皮下多點注射方式進行每只兔子lmg/mL每兩周免疫一次，共免疫 4次。采用方陣滴定確定最佳包被濃度，間接ELISA跟蹤抗體效價達1 40萬以上；再通 過間接ELISA、競爭抑制ELISA以及免疫印跡實驗，證明分離純化的牛乳乳球蛋白的抗 原性完好，水牛乳乳球蛋白與牛乳乳球蛋白存在較強的免疫交叉反應(yīng)，其交叉率達 到 69. 27%。2、方法2. 1多參數(shù)預(yù)測水牛乳0 -乳球蛋白抗原線性表位結(jié)果利用DNAStar軟件對水牛乳乳球蛋白氨基酸序列進行表位相關(guān)參數(shù)的理論預(yù) 測，如圖1所示，可能構(gòu)成抗原區(qū)的位置如表1。表IDANStar軟件預(yù)測的表位區(qū) 通過網(wǎng)絡(luò)服務(wù)器，我們再次對牛乳0 -乳球蛋白的抗原區(qū)進行預(yù)測，圖2和表2顯 示了水牛乳乳球蛋白的親水性、a-螺旋、轉(zhuǎn)角和折疊的預(yù)測分析結(jié)果。表2親水性、a -螺旋，0 -轉(zhuǎn)角和0 -折疊的存在的可能位點 *通過Kyto&Dolittle分析的結(jié)果，**通過Welling分析的結(jié)果。綜合以上的預(yù)測分析，我們得到了水牛乳乳球蛋白可能的抗原表位區(qū) AA30-45, AA67-78, AA97-115，AA124-141, AA150-156。2. 2噬菌體隨機肽庫定位2. 2. 1噬菌體隨機七肽庫篩選將純化的多克隆抗體IgG用包被緩沖液(0. lmol/LNaHC03,pH 8. 6)稀釋至10 u g/ mL,每孔100 u L包被96孔酶標板，4°C輕微震蕩，孵育過夜。棄去包被液，每孔加滿封阻液 (0. lmol/LNaHC03, 5mg/mLBSA, 0. 02 % 的 NaN3)，4C 封阻 2h ；用 TBST (50mmol/L Tris-HCl, 150mmol/L NaCl,0. 1% Tween-20)快速洗板6次，每孔加入100 y L的噬菌體原始肽庫 (含2X1011個的噬菌體)，室溫輕搖震蕩60min ；棄去未結(jié)合噬菌體液，用TBST洗板10次，每孔加入甘氨酸洗脫液(0. 2mol/L, pH 2. 2Glycine_HCl，lmg/mLBSA) 100 u L，室溫輕搖 lOmin，洗脫特異性結(jié)合的噬菌體，收集洗脫液于微量離心管，加入中和緩沖液(Tris-HCl， pH 9.1)；留5yL用于滴度測定，剩余洗脫物進行擴增，用于下一輪篩選。同樣的方法進行 第2、3、4輪篩選，洗脫液TBST的濃度依次遞增為0. 25%、0. 5%、0. 5%。2. 2. 2噬菌體滴度的測定用LB培養(yǎng)基對洗脫液進行倍比稀釋，分別取各稀釋度的噬菌體加入到制備好的 對數(shù)生長期的ER2738菌液中，室溫溫育后加入到上層瓊脂中混勻，均勻鋪于平皿上，培養(yǎng) 過夜。記數(shù)平皿上藍斑個數(shù)。噬菌體滴度=平皿中藍斑個數(shù)X稀釋倍數(shù)，即每10 y L的噬 菌體形成單位。2. 2. 3挑選隨機克隆在小于100個克隆子的平板上隨機從第3和4輪挑取30個單菌落加到ER2738過 夜培養(yǎng)物，按1 100稀釋接種于LB培養(yǎng)基，37°C搖床培養(yǎng)4.5-5hrs后，培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入微量 離心管中，離心30秒。上清轉(zhuǎn)入一新的管中，再離心。用移液器將80%的上清轉(zhuǎn)入新鮮離 心管，此即為擴增噬菌體貯液，取500 y L用Nal提取單DNA，其余用作擴增和ELISA。2. 2. 4 擴增用20mL的培養(yǎng)基對每個克隆子進行擴增，步驟如肽庫擴增。2. 2. 5間接ELISA鑒定陽性克隆用包被緩沖液稀釋抗體(100ug/mL)，每孔100 u L包被96孔酶標板，密封濕盒中 4°C過夜。棄包被液，每孔加滿封阻液，4°C封阻2h。0.5% TBST洗板3次，每孔加入一個克 隆子的上清液，37°C 2h，洗板三次，加入1 5000稀釋的HRP標記的抗M13抗體lOOiiL/ 孔，室溫孵育lh，洗板后加100 u L/孔0PD底物顯色液，室溫作用10 20min顯色，2mol/ LH2S04終止反應(yīng)，490nm處讀數(shù)。2. 2. 6軟件MIM0X比對模擬表位將水牛乳0 -乳球蛋白氨基酸序列分為三個區(qū)段B1、B2和B3。通過不同實驗兔 的血清篩選到的模擬肽分別與水牛乳乳球蛋白氨基酸序列B1、B2和B3比對，采用下面 的格式，輸入到圖3的工作區(qū)進行比對，以確定模擬肽對應(yīng)于水牛乳0 _乳球蛋白氨基酸序 列中的位點，即模擬表位。>mimoseqBlIIVTQTMKGLDIQKVAGTWHSLAMAASDISLLDAQSAPLRVYVEELKPTPEGNL>mimoseqB2EILLQKWENGECAQKKIIAEKTKIPAVFKIDALNENKVLVLDTDYKKYLLFCME>mimoseqB3NSAEPEQSLACQCLVRTPEVDNEALEKFDKALKALPMHIRLAFNPTQLEGQCHV2. 3肽掃描表位定位2. 3. 1肽膜的合成本實驗所要分析的肽由Sigma公司合成并固定在纖維膜上。合成肽段的C端共價 結(jié)合到活化的纖維膜上，N端被乙?；?，既可以防止被降解，也可保持天然的過敏構(gòu)象，單個 甘氨酸為陰性對照。2. 3. 2肽膜的檢測
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1)用少量體積的甲醇漂洗膜5min ；2)用適量的TBS洗脫三次共lOmin，洗脫的體積取決于膜和管子的大小，膜需要完
全被覆蓋；3)用相同體積封阻劑室溫下封阻至少2小時；4)用相同體積的0. 1-10 u g/mL (封阻液稀釋)溫育3小時；5)用 T-TBS 再洗 lOmin ；6)用合適的HRP標記的二抗溫育2小時，用封阻液稀釋1 10000 ；7)用相同體積的T-TBS洗膜三次共5min ；8)檢測的顯色劑至少100 u 1/cm2加到膜上；9)用tip頭重復(fù)地洗膜或者緩慢地搖動容器；10)將膜倒置顯影；11)暴露60秒，顯影，定影；12)利用軟件ImagePro軟件定量確定0D值。2. 3. 3肽膜的再生過程1)用水洗膜三次共lOmin ；2)用再生緩沖液I洗膜至少4次共30min，溫度為50度；3)室溫下用10 X PBS至少洗3次共20min ；4)室溫下用T-TBS洗3次共20min ；5)室溫下用TBS至少洗3次共lOmin ；6)用標記的抗體檢測是否再生成功，如果不成功就用再生步驟2。3 結(jié)果3. 1噬菌體隨機肽庫模擬表位的DNA測序結(jié)果以1#’ 2#’ 3#和4#兔血清得到的親和純化的IgG為靶分子，挑選了 300個克隆子， 鑒定出112個陽性克隆，測序結(jié)果如表3-6所示。表31#兔陽性克隆的測序結(jié)果 表42#兔陽性克隆的測序結(jié)果
表53#兔陽性克隆的測序結(jié)果 表64#兔陽性克隆的測序結(jié)果
3. 2模擬表位的定位 采用MIMOX中的第一功能對測序得到的氨基酸序列與水牛乳3乳球蛋白氨基
酸序列進行比對，識別三個以上的模擬肽作為水牛乳乳球蛋白的模擬表位。圖4統(tǒng)計 了模擬肽識別的水牛乳乳球蛋白的氨基酸位點。對所得到的肽段的識別的位點和出 現(xiàn)的頻率進行分析，定位出水牛乳乳球蛋白的表位區(qū)為AA14-20，AA26-32，AA36-42， AA70-80，AA82-86以及AA149-156。同時對不同的兔子得到的模擬肽分別進行表位定位，結(jié) 果如表7。表7不同免疫兔子識別的模擬表位肽段區(qū) 3. 3合成肽定位結(jié)果3.3. 1肽膜的檢測條件肽膜用3%明膠37°C溫育lh后，將膜浸泡在4ug/mL —抗溶液15mL中，室溫搖床 溫和搖動2h ;T-TBS洗四次，lOmin/次，加二抗(1 10000)室溫溫育lh，用T-TBS洗四次， 15min/次，ECL將膜浸潤，反復(fù)滴加使膜充分與底物接觸，約2min，黑暗曝光10-30秒，然后 放置到顯影劑中30秒，再用定影劑浸泡20秒。3. 3. 2肽掃描定位結(jié)果合成肽膜的原始膜如圖5A所示，陰性血清作對照(圖5B)。1#-4#兔血清識別肽段的結(jié)果圖為5C-F。通過ImagePro軟件將1#，3#和4#兔血清識別肽段反應(yīng)的強度值如圖 6-8。其中兔2的特異性識別非常強，只識別一個肽段，這里未對此點進行量化和作圖比較。根據(jù)以上四個特異性血清與合成肽的免疫反應(yīng)的結(jié)果，實驗兔血清分別識別的肽 段如表8所示，根據(jù)識別率為50%以上時，確定為主要表位。結(jié)果顯示，本實驗確定了七個 主要識別表位:A6, A7，A8，B5, C，F(xiàn)4，F(xiàn)8，其氨基酸序列如表9所示。其中A7，A8，F(xiàn)4，F(xiàn)8可 被三只兔子識別，可認為是最主要的表位。表8不同免疫兔子識別的肽段
表9不同免疫兔子識別的肽段肽段名合成的位點氨基酸序列
3. 3. 2肽掃描定位關(guān)鍵按計算結(jié)果(見附圖9)
對表位A6，A7，A8，B5，C，F(xiàn)4，F(xiàn)8進行丙氨酸(甘氨酸)的單個氨基酸替換，確定表位中的關(guān)鍵氨基酸，見表10。
表10水牛乳0 -乳球蛋白表位中關(guān)鍵氨基酸*
*粗體和下劃線標注的為關(guān)鍵氨基酸
權(quán)利要求
一種確定牛乳過敏原表位關(guān)鍵氨基酸的方法，利用免疫親和純化的特異性兔血清對噬菌體隨機七肽庫進行親和淘選，并借助網(wǎng)絡(luò)工具MIMOX分析，確定β-乳球蛋白過敏原的表位區(qū)，其特征是(1)根據(jù)初步確定的模擬表位區(qū)氨基酸序列，合成表位肽段，并固定和保護，合成肽段的C端共價結(jié)合到活化的纖維膜上，N端被乙?；?；(2)用單個甘氨酸作為陰性對照，將合成的氨基酸序列與多克隆血清反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)的強度，確定β-乳球蛋白的主要表位；(3)將β-乳球蛋白的主要表位中的每個氨基酸依次被丙氨酸或甘氨酸取代，得到需合成的氨基酸序列；(4)由步驟3得到的氨基酸序列，再合成表位肽段，并固定和保護，合成肽段的C端共價結(jié)合到活化的纖維膜上，N端被乙?；?；(5)用單個甘氨酸作為陰性對照，將合成的氨基酸序列與多克隆血清反應(yīng)，根據(jù)反應(yīng)的強度，確定牛乳表位中的關(guān)鍵氨基酸。
全文摘要
一種確定牛乳過敏原表位關(guān)鍵氨基酸的方法，根據(jù)初步確定的模擬表位區(qū)氨基酸序列，合成表位肽段，固定和保護，其C端共價結(jié)合到活化的纖維膜上，N端被乙?；挥脝蝹€甘氨酸作為陰性對照，將合成的氨基酸序列與多克隆血清反應(yīng)，確定β-乳球蛋白的主要表位；將主要表位中的每個氨基酸依次被丙氨酸或甘氨酸取代，得到需合成的氨基酸序列；將得到的氨基酸序列，合成表位肽段，固定和保護，其C端共價結(jié)合到活化的纖維膜上，N端被乙?；?；用單個甘氨酸作為陰性對照，將合成的氨基酸序列與多克隆血清反應(yīng)，確定牛乳表位中的關(guān)鍵氨基酸。本發(fā)明可為乳過敏的診斷、治療以及食品中過敏原的檢測奠定基礎(chǔ)，為開發(fā)低過敏性牛乳提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。
文檔編號G01N33/68GK101865925SQ20101010233
公開日2010年10月20日 申請日期2010年1月28日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月28日
發(fā)明者佟平, 吳志華, 文學(xué)方, 李欣, 楊安樹, 陳紅兵, 高金燕 申請人:南昌大學(xué)