專利名稱：用于三維衍射成像的流式細胞儀系統(tǒng)及方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及流式細胞儀系統(tǒng)，特別是涉及可測量衍射圖像信號與三維結(jié)構(gòu)參數(shù)的 流式細胞儀系統(tǒng)。
背景技術(shù)：
在生命科學(xué)研究中流式細胞儀系統(tǒng)可用來對包含大量生物細胞和粒子的群落進 行定量分析。考慮用一束光(通常為單波長)照射經(jīng)過流體力學(xué)聚焦的一流體。該流體一 般包括作為載體的鞘流與包含許多粒子的樣品流。這種流體一般可使單個粒子流過照射光 束。多個傳感器可用來收集發(fā)自被照射粒子位置的信號。例如，可將一個傳感器置于靠近 照射光束的位置測量前向散射光和將一個或多個傳感器置于與照射光束垂直的方向測量 側(cè)向散射光。被照射的粒子可含熒光分子，用一個或多個熒光傳感器可測量粒子所產(chǎn)生的 熒光信號。每個流過照射光束的懸浮粒子都會產(chǎn)生散射光，其內(nèi)的熒光分子則可能會產(chǎn)生 頻率小于照射光頻率的熒光信號。散射光與熒光均可被測量并分析。
通過流式細胞儀測量到的信號可用來確定所測粒子的物理與化學(xué)結(jié)構(gòu)特征。例 如，前向散射光可與粒子體積相關(guān)聯(lián)，側(cè)向散射光則可與粒子形狀與內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征相關(guān)聯(lián)。 使用高速傳感器可快速測量散射光和/或熒光信號并據(jù)此對包含許多細胞的群落進行快 速數(shù)據(jù)分析。例如，細胞群落可在一由熒光信號，前向散射光信號和/或側(cè)向散射光信號定 義的多維特征空間內(nèi)分類。
近年來，利用如電荷耦合器件(CCD)相機測量明場、暗場和熒光圖像數(shù)據(jù)的圖像 流式細胞儀已經(jīng)出現(xiàn)。這種圖像流式細胞儀利用光學(xué)顯微鏡技術(shù)測量被照射粒子的二維圖 像，分析速度可達每秒一千個細胞。但是這種技術(shù)依賴于傳統(tǒng)的明場或熒光顯微鏡方法，所 獲取的圖像為粒子三維結(jié)構(gòu)以非相干方式的二維投影復(fù)制圖(第三維被壓縮至“景深”之 內(nèi))。這種二維圖像因其不包括三維信息，盡管可用各種模式識別算法分析，但以現(xiàn)有的模 式識別算法進行自動分析還是非常復(fù)雜，需要大量人工介入操作，非常困難。在粒子靜止條 件下共聚焦成像技術(shù)可用于在第三維方向上獲取許多幅景深非常小的非衍射二維圖像，然 后疊加重建三維結(jié)構(gòu)。但這種技術(shù)一般需要許多幅圖像，因而不能應(yīng)用于粒子流動速度較 快的圖像流式細胞儀。此外，現(xiàn)有的流式細胞儀中粒子的流速較高，信號的信噪比較低，這 些特點會限制可從散射光和/或熒光信號中提取的信息量。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的實現(xiàn)方法可為一種流式細胞儀系統(tǒng)其中包括由外層鞘流與內(nèi)層樣品流 組成的可形成流體力學(xué)聚焦的流體控制器件。一個可照射位于內(nèi)層樣品流中單個粒子的相干光源。一個可用來探測被相干光源照射激發(fā)的粒子所產(chǎn)生的彈性散射光的空間分布的傳 感器。一個可用來從彈性散射光的空間分布提取該粒子的三維結(jié)構(gòu)形態(tài)參數(shù)的分析模塊。 本發(fā)明的某些實現(xiàn)方法包括傳感器可用來獲得記錄相干彈性散射光空間分布的衍射圖像 數(shù)據(jù)。
在另外一些實現(xiàn)方法中，用一個非相干光源照射粒子并用一個傳感器測量被非相 干光源激發(fā)的粒子產(chǎn)生的包括明場，暗場和熒光信號的非相干圖像數(shù)據(jù)。系統(tǒng)的分析模塊 可設(shè)計用來結(jié)合衍射圖像與非相干圖像數(shù)據(jù)分析位于樣品流的粒子。
在另外一些實現(xiàn)方法中，可設(shè)計使用分析模塊分析彈性散射光的相干分布對粒子 進行分類?？稍O(shè)計使用分析模塊分析衍射圖像數(shù)據(jù)并提取粒子結(jié)構(gòu)的體積信息，例如一個 生物細胞內(nèi)的細胞質(zhì)體積和/或細胞核體積和/或線粒體體積。
在另外一些實現(xiàn)方法中，流體控制器件設(shè)計用來形成為層流狀的流相干。流體控 制器件可包括一流動室，其材料的折射率與層流中的鞘流的折射率非常接近。流動室至少 有一邊面形狀為平面或接近平面。
在另外一些實現(xiàn)方法中，傳感器設(shè)計用來探測在某一角度范圍內(nèi)的散射光，其中 心角度與自相干光源入照的光傳播方向呈某一角度，如90度。
在另外一些實現(xiàn)方法中，可根據(jù)包括計算獲得的衍射圖像數(shù)據(jù)和/或?qū)嶒灤_定的 細胞結(jié)構(gòu)的數(shù)據(jù)庫分析提取三維結(jié)構(gòu)參數(shù)。
根據(jù)本發(fā)明更進一步的一些實現(xiàn)方法，通過流式細胞儀分析粒子并決定其三維結(jié) 構(gòu)參數(shù)的方法包括由外層鞘流與內(nèi)層樣品流組成的可形成流體力學(xué)聚焦的流體。位于內(nèi)層 樣品流的粒子由一相干光源照射。測量相干光源激發(fā)下的粒子所產(chǎn)生的彈性散射光并從中 提取粒子的三維結(jié)構(gòu)參數(shù)。
本發(fā)明還有一些實現(xiàn)方法可提供計算程序產(chǎn)品，可用來分析流式細胞儀所測量的 粒子并提取其三維結(jié)構(gòu)參數(shù)。這種流式細胞儀系統(tǒng)具有包括由外層鞘流體與內(nèi)層樣品流體 組成的可形成流體力學(xué)聚焦的一流體。一個用來照射粒子的相干光源，一個用來探測被相 干光源照射激發(fā)的粒子所產(chǎn)生的彈性散射光的相干空間分布的傳感器。計算程序產(chǎn)品包括 可供計算機使用的存儲可讀程序編碼的存儲器。計算機可讀的程序編碼可用來讀入由流式 儀測量的彈性散射光的相干空間分布的衍射圖像數(shù)據(jù)。


所有附圖均包括在技術(shù)說明之內(nèi)，也是技術(shù)說明的一部分，本發(fā)明的實現(xiàn)方法既 由附圖與說明示意，用來解釋本發(fā)明的原理。
圖1為本發(fā)明實施方法之一的一種流式細胞儀系統(tǒng)示意圖。
圖2為本發(fā)明其他實施方法的另一種流式細胞儀系統(tǒng)的示意圖。
圖3為本發(fā)明實施方法之一的一種包括可測量衍射與非相干圖像器件和特征提 取與分類器件的流式細胞儀系統(tǒng)方框圖。
圖4A為本發(fā)明其他實施方法的另一種流式細胞儀系統(tǒng)的示意圖。
圖4B為本發(fā)明其他實施方法的另一種流式細胞儀系統(tǒng)的示意圖。
圖5為本發(fā)明實施方法的一種流式細胞儀系統(tǒng)的示意圖。
圖6A為本發(fā)明實施方法的一種液流控制器件的數(shù)字照片。
圖6B為本發(fā)明實施方法的一種流式細胞儀系統(tǒng)的示意圖。
圖6C為本發(fā)明實施方法的一種流式細胞儀系統(tǒng)的數(shù)字照片。
圖6D為圖6C所示流式細胞儀系統(tǒng)的示意圖。
圖7為基于本發(fā)明實施方法的入射光與散射光分布的示意圖。
圖8A為一幅自直徑為25微米的微球測得的衍射圖，激發(fā)處于樣品流中微球的激 光波長為633納米。
圖8B為根據(jù)米理論模型計算的衍射圖，其橫軸代表散射角度θ s，縱軸代表散射角 度(Ps，角度范圍在70度至110度之間，計算不含可調(diào)參數(shù)。
圖9為入射光波波前以及由于一生物細胞內(nèi)部折射率分布不均勻所造成的散射 光波前的示意圖，其中包括細胞核，線粒體，g=格基結(jié)構(gòu)，λ =波長，2a=線性尺度。
圖10為包括7個NALM-6培養(yǎng)細胞三維結(jié)構(gòu)參數(shù)的數(shù)據(jù)表。
圖11為包括分布在不同二維特征空間內(nèi)九個NALM-6培養(yǎng)細胞的數(shù)據(jù)，這些二維 空間由散射光矩陣元素Sll在散射角度θ s = 0時的值與其在不同測向散射光角度范圍內(nèi) 積分值定義。
圖12為本發(fā)明一些實施方法的一種流式細胞儀系統(tǒng)的示意圖。
圖13A-13C為顯微目鏡置于χ = 0時所獲得的不同微球與細胞的明場數(shù)字圖像， 其中微球直徑9. 6微米(圖13A)，25微米(圖13B)以及一個B16/GPR4細胞(圖13C)，短 直線=20微米。
圖14顯示自一直徑為25微米的聚苯乙烯微球(嵌于凝膠內(nèi))所獲取的多幅數(shù)字 衍射圖與一幅非相干光源照射下獲得的明場圖(第一列，第三行)。在一波長λ = 532微 米的激光束照射條件下，衍射圖于不同的χ位置獲取。第一列自左至右x = 0微米，100微 米，200微米；第二列自左至右χ = 300微米，400微米，500微米；第三列自左至右x = 0 微米(明場圖)，-100微米，-200微米；第四列自左至右x = -300微米，-400微米，-500 微米。
圖15顯示多幅獲自嵌于凝膠內(nèi)不同微粒的數(shù)字衍射圖，左列為一直徑為9. 6 微米的聚苯乙烯微球，中間及右列分別為屬黑色素腫瘤培養(yǎng)細胞的兩個不同細胞Β16/ vector (#1細胞)和B16/GPR4(#2細胞)。第一列衍射圖獲取位置為χ = 200微米，第二列 衍射圖為χ = -200微米。
圖16左列與中列顯示多幅根據(jù)米理論模型計算的散射光角度分布投影獲得的數(shù) 字衍射圖，左列圖所用的最大投影半角Θ = 24°，中列為最大投影半角Θ = 16°。右列 顯示的為自嵌于凝膠內(nèi)的聚苯乙烯微球測量的衍射圖，測量位置Χ = 200微米，第一列的微 球直徑為25微米，第二列直徑為9. 6微米。
圖17Α-17Β為自10，000個B16F10培養(yǎng)細胞測量的側(cè)向散射光信號與前向散射光 信號雙參數(shù)點圖，圖17Α為B16/GPR4培養(yǎng)細胞，圖17Β為Bie/vector培養(yǎng)細胞。
圖18為一 B16/GPR4細胞三維結(jié)構(gòu)的二維剖面圖。
圖19為流動狀態(tài)下直徑為9. 6微米的微球所產(chǎn)生的數(shù)字衍射圖像，激發(fā)光波長為 532納米，流速在1. 6毫米/秒至1. 8毫米/秒之間，曝光時間為50微秒。
圖20為流動狀態(tài)下直徑為9. 6微米的微球所產(chǎn)生的數(shù)字衍射圖像，激發(fā)光波長為 532納米，流速為12毫米/秒，曝光時間為50微秒。
圖21A為流動狀態(tài)下直徑為5. 2微米的微球所產(chǎn)生的數(shù)字衍射圖像，流速約為4. 7毫米/秒。
圖21B為流動狀態(tài)下直徑為9. 6微米的微球所產(chǎn)生的數(shù)字衍射圖像，流速約為12毫米/秒之間。
圖21C為流動狀態(tài)下直徑為25微米的微球所產(chǎn)生的數(shù)字衍射圖像，流速約為7毫 米/秒之間。
具體實施方式
下面結(jié)合附圖和具體實施方式
為例對本發(fā)明做出詳細說明。但本發(fā)明可通過許多 種不同方式實施，因此本發(fā)明的實施不應(yīng)限于這里所介紹的方式，這里介紹的實施方式只 是用于完整地公布本發(fā)明，使其全部內(nèi)容可為業(yè)內(nèi)同行所知。
全文中同樣的數(shù)字指同樣的部件。在附圖中，一些線段、層次、成份、部件或特征的 粗細可能會為了清晰而加粗或加大。虛線除注明外表示備選特征。
這里所用的術(shù)語僅是為了描述本發(fā)明的某種實施方式，并非具有限制意義。特別 值得指出的是，本文中所用的“包括”一類詞語用以表明一些所述的特征、數(shù)字、步驟、操作、 部件、成份等的存在，但不排除其他以表明一些所述的特征、數(shù)字、步驟、操作、部件、成份等 的存在。正如所述，“和/或” 一詞包含了任一和所有上述一或多部分的組合。正如所述， 類似于“介于X和Y之間”和“介于大約X和Y之間”等詞應(yīng)解釋為包含了 X和Y。正如所 述，類似于“介于大約X和Y之間”應(yīng)解釋為“介于大約X和大約Y之間”。正如所述，類似 于“自大約X至Y”應(yīng)解釋為“自大約X至大約Y之間”。除另定義外，這里使用的所有詞 匯(包括技術(shù)和科學(xué)詞匯)所具有的意義與任何一位本發(fā)明所屬專業(yè)的同行通常理解的一 致。更應(yīng)進一步理解的是，在常用字典或詞典中所定義的詞匯在本文中使用時其意義應(yīng)與 上下文和相關(guān)專業(yè)的解釋一致。除非明確定義時，一般不應(yīng)對詞匯作理想化或過于正式的 解釋。從所周知的功能或操作可能不會作仔細描述，以行文簡潔。
應(yīng)該理解的是，當(dāng)提到某一部件與另一部件“相鄰”、“相接”、“相連”、“接觸”等等 時，這兩個部件可以是直接相鄰、相接、相連或接觸，也可是其間還有其他部件。與此對照， 當(dāng)提到某一部件與另一部件“直接相鄰”、“直接相接”、“直接相連”、“直接接觸”等等，這兩 個部件之間沒有其他部件。業(yè)內(nèi)人士應(yīng)該理解，當(dāng)提到一個結(jié)構(gòu)或特征與另一特征相接時， 該結(jié)構(gòu)或特征可能會與相接特征存在相交部分。
在使用例如“在下面”、“處于下方”、“在上面”、“處于上方”之類空間相對關(guān)系詞匯 時，這些詞匯應(yīng)理解為是為了便于在附圖中說明一個部件或特征與另外的部件或特征之間 的關(guān)系。這類空間相對關(guān)系詞匯應(yīng)理解為是用來包括圖中描述的裝置或操作的所有方位。 例如，如果圖中裝置是倒置的，則在相對于其它部件或特征時用“在下面”或“處于下方”所 描述的某一部件或特征的方位應(yīng)該為“在上面”或“處于上方”。一個典型的例子就是“在下 面”可以包含“在下面”和“在上面”的方位意義。所描述的裝置方位可能變化(旋轉(zhuǎn)90度 或其他方位)，其空間相對位置的解釋也應(yīng)相對變化。除非明確定義時，類似的詞匯如“向 上的”、“向下的”、“豎直的”、“水平的”等相似詞匯也應(yīng)同樣解釋。
在使用“第一”、“第二”等詞匯描繪某些部件時，這些部件不應(yīng)被這些詞匯限制。這 些詞匯只是用于區(qū)分不同的部件。所以，一個上述的“第一”部件也可稱為“第二”部件而不會偏離本發(fā)明所述的原則。除非明確定義時，權(quán)力要求或附圖中的操作(或步驟)的順 序并不限于所述的前后次序。
下面對本發(fā)明的描述會涉及到使用方框圖和/或流程圖說明的基于本發(fā)明的各 種實施方式的方法，儀器(系統(tǒng))和/或計算機程序產(chǎn)品。在方框圖和/或流程圖中的各 個方框或不同方框的組合應(yīng)理解為可通過計算機程序指令實現(xiàn)。這些計算機程序指令可輸 進一個通用或?qū)Ｓ糜嬎銠C和/或其他可編程的數(shù)據(jù)處理儀器而成為一臺機器，使得這些指 令可通過計算機處理器和/或其他可編程的數(shù)據(jù)處理儀器得到執(zhí)行并實現(xiàn)方框圖和/或流 程圖或其中方框的功能/行為。
上述計算機程序指令還可儲存于一個計算機可讀的存儲器并用于控制一臺計算 機和/或其他可編程的數(shù)據(jù)處理儀器實現(xiàn)某一特定方式的功能，例如儲存于一個計算機可 讀的存儲器內(nèi)的指令生產(chǎn)一件產(chǎn)品用于實現(xiàn)方框圖和/或流程圖或其中方框的功能/行 為。
上述計算機程序指令還可輸入至一臺計算機和/或其他可編程的數(shù)據(jù)處理儀器 并用于啟動一系列計算機和/或其他可編程的數(shù)據(jù)處理儀器的運行步驟而形成通過計算 機實現(xiàn)的過程，在過程之中指令得到執(zhí)行而實現(xiàn)方框圖和/或流程圖或其中方框的功能/ 行為。
因此本發(fā)明可以通過硬件和/或軟件(包括固件、常駐軟件、微代碼等)實現(xiàn)。此 外本發(fā)明的實現(xiàn)還可具有一儲存于計算機可用或可讀的存儲介質(zhì)內(nèi)的計算機程序產(chǎn)品的 形式，其中存儲介質(zhì)含有計算機可用或可讀的程序代碼并用于一個指令執(zhí)行系統(tǒng)或與其相 聯(lián)。在本文中計算機可用或可讀的介質(zhì)可以是任何可含有、儲存、通訊、傳播或傳輸程序并 用于一個指令執(zhí)行系統(tǒng)、儀器或設(shè)備或與其相聯(lián)的介質(zhì)。
計算機可用或可讀的介質(zhì)可以包括但不限于下列介質(zhì)中的任何一種電子介質(zhì)、 磁性介質(zhì)、光學(xué)介質(zhì)，電磁介質(zhì)、紅外介質(zhì)或半導(dǎo)體系統(tǒng)、儀器、設(shè)備或傳播介質(zhì)。更為具體 的計算機可讀介質(zhì)的例子包括(非完全名單)一個包含一或數(shù)條電線的電路連接、一個可 攜帶的計算機盤、一個隨機存取存儲(RAM)、一個只讀存儲(ROM)、一個可擦可編程序只讀 存儲(EPRM或閃存)、一根光纖和一個可攜帶只讀存儲光盤(CD-ROM)。應(yīng)該指出，計算機可 用或可讀的介質(zhì)甚至可以是紙或者其他適當(dāng)?shù)目捎∷⒊绦虻慕橘|(zhì)，因為程序可通過例如光 學(xué)掃描紙或其他介質(zhì)的方式進行電子紀錄后以適當(dāng)方式加以編譯和處理，然后根據(jù)需要儲 存在一個計算機存儲器內(nèi)。
圖像數(shù)據(jù)為使用如成像傳感器所紀錄的信號空間分布。因此，光學(xué)圖像為由電 磁場組成的光波信號的空間分布，一般可分為兩類1)基于相干光信號空間分布的衍射圖 像，2)基于非相干光信號空間分布的非相干圖像。這兩類圖像的區(qū)別在于不同空間位置的 電磁場之間的相干性。形成衍射圖像的光波信號主要由存在于空間不同位置的高度相干場 組成，而形成非相干圖像的光波信號則主要由存在于空間不同位置的非相干場組成。傳統(tǒng) 光學(xué)顯微鏡即為一廣為人知的非相干圖像方法，包括通過被非相干光照射的粒子所產(chǎn)生的 彈性散射光信號而形成的亮場圖像和通過被非相干光照射的粒子所產(chǎn)生的熒光信號而形 成的熒光圖像。這些圖像的非衍射性質(zhì)使其只能在實際三維空間中復(fù)制具有三維結(jié)構(gòu)的細 胞的二維投影結(jié)構(gòu)，細胞的第三維結(jié)構(gòu)被壓縮成為所謂的“影深”，無法獲得真正的三維結(jié) 構(gòu)信息。與此形成對照，在粒子被例如激光束的相干光束照射或激發(fā)時，我們可以測量獲得9衍射圖像并據(jù)此提取粒子的三維結(jié)構(gòu)特征和信息。光學(xué)全息圖即為衍射圖像的一個例子， 全息圖片可通過用膠片紀錄在激光束照射下的物體所產(chǎn)生的彈性散射光與作為參考光束 的該激光束的一部分之間的干涉條紋而獲得。全息圖片在相同波長的激光束照射下可在不 同觀看角度上重現(xiàn)所記錄物體的三維結(jié)構(gòu)。隨著圖像處理技術(shù)的進步，現(xiàn)在我們已可不需 使用參考光束干涉的方式而直接從散射光所形成的衍射圖像獲取三維結(jié)構(gòu)特征。
現(xiàn)在根據(jù)圖1至圖21C討論本發(fā)明的不同實施方式。
如圖1所示，一種基于微流器件設(shè)計的流式細胞儀10包括一個流控裝置100，測量 相干光分布的成像傳感器130，相干光分布的圖像分析裝置140。流控裝置100又包括樣品 流入口 102和鞘流入口 104，分別提供沿著流體通道106在微流樣品室108流動的樣品流和 鞘流。樣品室108通過流體排出口 110輸出樣品流與鞘流流體。流控裝置100應(yīng)具有可在 流體室108內(nèi)通過流體聚焦形成由樣品流和鞘流組成的沿著流體通道106流動的層流的能 力。樣品流和鞘流在控制裝置控制下分別流入入口 102和104。在流體通道106內(nèi)流體動 力學(xué)聚焦條件下的樣品流可以基本保證被測粒子以單列方式通過樣品室108。樣品流包括 的所測粒子可以是包括人體細胞在內(nèi)的生物細胞，也可是其他微粒。
例如激光束120的相干光源輸出光束可用來照射在流體室108內(nèi)流動的樣品流內(nèi) 的粒子。一個相干分布成像傳感器130可用來探測由被測粒子產(chǎn)生的彈性散射光在空間的 相干分布。一個相干圖像分析裝置140可用來從彈性散射光相干空間分布提取被測粒子三 維結(jié)構(gòu)特征和形態(tài)參數(shù)。
在這種實施方式中，當(dāng)位于樣品室108樣品流內(nèi)的粒子被相干光束照射時，粒子 會在不同方向產(chǎn)生散射光。彈性散射光會形成復(fù)雜的空間分布模式，與粒子的大小、形狀 以及粒子內(nèi)部的光折射率分布也即結(jié)構(gòu)有關(guān)。根據(jù)本發(fā)明的實施方式，彈性散射光的空間 分布或衍射圖像數(shù)據(jù)可用成像傳感器130在某一角度范圍內(nèi)測量，并據(jù)此獲得被測粒子的 三維結(jié)構(gòu)參數(shù)。例如圖像分析裝置140可用來自衍射圖像數(shù)據(jù)提取與粒子結(jié)構(gòu)相關(guān)的體積 與光折射率，如生物細胞內(nèi)部的細胞核和/或線粒體的體積與光折射率。
在更具體的實施方式中，流控裝置100可以為一個層流控制裝置，用來提供流速 低于10毫米/秒的層流，這樣可在曝光時間小于50微秒時位于樣品室108和樣品流內(nèi)的 被測粒子在曝光時間內(nèi)的移動距離較小(如低于0. 5微米)。在這種實施方式中，流控裝置 100可以增強信噪比，提高包括衍射圖像在內(nèi)的成像質(zhì)量。
在一些實施方式中，微流樣品室108可使用光折射率與樣品室108內(nèi)的鞘流光折 射率非常相近的材料制作，這些材料包括硅膠或其它高分子材料。在這種實施方式中，可以 通過匹配激光束120入射至樣品室108的部分與其內(nèi)的流體的光折射率降低成像噪音背 景。此外，例如圖6所示，樣品室108還可至少有一邊面為平面形狀使得激光束120可以自 此面以垂直于平面的方向入射，從而進一步降低由于在樣品室108入射面的光散射所造成 的成像噪音背景，增強信噪比。
本發(fā)明還有一種如圖2至圖3所示的微流器件型流式細胞儀系統(tǒng)200的實施方 式。系統(tǒng)200包括一個非相干光源202，一個激光源204，一個樣品室或微流裝置206 (細胞 或其他粒子從其中流過)和一個分束元件208。自非相干光源202和激光源204產(chǎn)生的光 束入射到微流裝置206內(nèi)的粒子。散射光與熒光信號在通過分束元件208時分開。粒子在 激光源204產(chǎn)生的光束激發(fā)下所產(chǎn)生的彈性散射光信號通過一波長濾光片1后由一成像傳感器220(如標注為CCDl的電荷耦合器件相機)作為衍射圖像數(shù)據(jù)記錄；而同一粒子在 非相干光源202產(chǎn)生的光束激發(fā)下所產(chǎn)生的彈性散射光和/或熒光信號由另一成像傳感 器210(如標注為CCD2的電荷耦合器件相機)作為非衍射亮場或熒光圖像數(shù)據(jù)記錄，具 體的圖像數(shù)據(jù)種類可通過選用不同的波長濾光片2選擇(見圖2)。如圖2所示，由非相 干光源202產(chǎn)生的光束通過透鏡1和透鏡2、含有多個不同波長的濾光片的轉(zhuǎn)輪FW以及 一個聚光鏡后聚焦至微流裝置206內(nèi)的粒子。粒子在非相干光源202激發(fā)下所產(chǎn)生的彈 性散射光和/或熒光信號通過物鏡260 (例如聚焦平面在無窮遠處的物鏡)和分光片208 后再通過筒鏡和波長濾光片2后由非相干成像傳感器210探測。粒子在激光源204激發(fā) 下所產(chǎn)生的彈性散射光通過物鏡260和分光片208后再通過另一個筒鏡和波長濾光片1 后由衍射成像傳感器220探測。
在微流器件型的實施方式中，傳感器220獲取的衍射圖像是由某一角度范圍內(nèi)的 散射光形成的，例如與激光源204產(chǎn)生的入射光方向成大約90度角度范圍內(nèi)的散射光方 向。傳感器210也可獲取粒子由于非相干光源202激發(fā)所產(chǎn)生的非相干散射光形成的非衍 射亮場或暗場圖像和/或由非相干熒光信號形成的非衍射熒光圖像。在本發(fā)明的一些實施 方式中，衍射圖像與非相干圖像可以在基本相同的時間段內(nèi)獲取，并可結(jié)合起來對所測量 的微流裝置206內(nèi)的粒子進行分析。業(yè)內(nèi)專業(yè)人士都知道，非相干圖像是為重現(xiàn)所測粒子 的結(jié)構(gòu)而形成，但其粒子結(jié)構(gòu)細節(jié)的重現(xiàn)精度也即分辨率會由于非相干光殘存的相干性而 受到限制，也稱為分辨率的衍射極限。在本發(fā)明的一些實施方式中，非相干圖像和衍射圖像 可以合并在一起用于對粒子的分析。
如圖3所示，由傳感器210獲取的非相干圖像和由傳感器220獲取的衍射圖像可 通過特征提取模塊230分析。微流裝置206內(nèi)的粒子可根據(jù)分類模塊240對圖像數(shù)據(jù)分析 后分類。分類方法可以有多種，例如可以根據(jù)細胞類粒子的體積或其他特征進行分類。在本 發(fā)明的一些實施方式中，衍射圖像模擬數(shù)據(jù)250可通過光學(xué)模型和已知的粒子結(jié)構(gòu)獲得， 這些圖像模擬數(shù)據(jù)可用來“訓(xùn)練”分類方法，使其可通過分類模塊240分析并提取粒子的 三維結(jié)構(gòu)特征后對粒子分類。
在圖4A至4B所示的一些實施方式中，可用另外一個激光源270提供粒子激發(fā)光 束，然后在接近180度的背散射方向由傳感器220測量有彈性散射光形成的衍射圖像。如 圖4A至4B所示，激光源270的輸出光束通過擴束器272，波片274以及衰減片276后再經(jīng) 過分光片208(從圖2所示的方位旋轉(zhuǎn)90度)入射至微流裝置206內(nèi)的粒子，產(chǎn)生沿背散 射方向上的散射光。
以上描述很清楚地表明所述的相干激光源204和270以及非相干光源202均可分 別用適當(dāng)?shù)墓庠雌骷崿F(xiàn)。在一些實施方式中，非相干光源202可以是包括175瓦氙燈的 庫勒(Kohler)照明系統(tǒng)，而相干激光源204和270可以是波長在180納米至3000納米之 間的同一或不同的激光系統(tǒng)。具體的激光波長可以是444納米或532納米或633納米。物 鏡260可以是一個聚焦平面設(shè)計在無窮遠處的物鏡，其數(shù)值孔徑和工作距離均較大，比如 由Mituyo公司生產(chǎn)的型號為M Plan Apo HR 50x或IOOx的物鏡。通過在物鏡260后不 同距離放置的不同筒鏡，衍射圖像和非相干圖像可使用同一物鏡260測量，如圖2和圖4A 至圖4B所示。例如其中的物鏡放大倍數(shù)可以是50x，數(shù)值孔徑為0. 55和工作距離為13毫 米。在這些條件下，在空氣中所測量的衍射圖像是由半角值為48. 6度的角度范圍內(nèi)的散射光形成的。如果自光源202和204的入射光所產(chǎn)生的散射光束經(jīng)過微流裝置206的有機硅 膠(其可見光范圍內(nèi)的折射率大約為1.40)壁出射，由于光束的折射則所收集的散射光束 角度范圍的半角值會降低為大約32度。傳感器210和220可以使用光敏度較高的電子倍 增電荷耦合器件(EMCXD)相機，可減低曝光時間，例如由AndorTechnology公司生產(chǎn)的型號 為DU88^(，像素數(shù)目為10(Mxl002的電子倍增電荷耦合器件相機。盡管如由Apogee公司生 產(chǎn)的型號為Alta U2000相機一類的普通冷卻電荷耦合器件相機也可用于圖像測量，電子倍 增電荷耦合器件相機采用電子倍增的機制在放大所測得光電信號后再進行模數(shù)轉(zhuǎn)換，這樣 可在每個像素只有10個光子數(shù)量級的弱光條件下將信噪比提高3到10倍，從而使得將曝 光時間自50微秒降低到10微秒或更低成為可能。曝光時間短的好處是可以允許細胞快速 流動，從而提高測量處理細胞的速度。上文提到的電子倍增電荷耦合器件相機一般可有高 達35兆赫茲的像素讀出速率，在將像素進行4x4的合并后，圖像讀出速率可達每秒112幅。 電子倍增電荷耦合器件相機的暗電流與讀出噪音一般都較低，因此相機圖像輸出信號的動 態(tài)范圍較大(例如可達70分貝)，可對之進行例如14或更高位數(shù)的信號數(shù)字化，有利于提 高后面的衍射圖像數(shù)據(jù)分析精度。我們應(yīng)該在這里指出，上述的如角度值、像素數(shù)目、圖像 讀出速率等具體數(shù)據(jù)值僅僅作為某些實施方式的范例，這些數(shù)據(jù)可采用其他的適當(dāng)值。
據(jù)此，任何其他適當(dāng)?shù)牧魇郊毎麅x均可作為本發(fā)明所述的衍射圖像數(shù)據(jù)測量的實 施方式。例如本發(fā)明所述的衍射圖像測量可通過不同的流式細胞儀系統(tǒng)設(shè)計在不同的角度 范圍內(nèi)實現(xiàn)。此外，還可通過可靠的觸發(fā)與延遲電路器件對圖像數(shù)據(jù)測量進行準確地控制 測量時間。圖5所示的為一具有斜面的微流器件，可用于收集中心散射角度為45度的衍射 圖像。
在本發(fā)明一些實施方式中，粒子分類由圖3所示的分類模塊240根據(jù)衍射圖像 和/或非相干圖像數(shù)據(jù)完成。例如粒子分類可以先使用具有已知粒子三維結(jié)構(gòu)特征與參 數(shù)以及所計算的衍射圖像和/或非相干圖像數(shù)據(jù)庫訓(xùn)練分類算法，然后通過這些算法對粒 子進行分類，對于生物細胞而言，所謂已知粒子三維結(jié)構(gòu)特征與參數(shù)可以包括核體積、核形 狀、核光學(xué)折射率及其分布、核體積與細胞質(zhì)體積之比、細胞形狀、細胞質(zhì)與核之折射率值 的對比度、線粒體密度、線粒體與細胞質(zhì)之折射率值的對比度和線粒體與核之折射率值的 對比度。其他可以確定的細胞特征包括生存率、分子鍵聯(lián)過程等。用于訓(xùn)練分類算法的 數(shù)據(jù)庫可以由非流式儀方法獲得的數(shù)據(jù)組成，其中三維結(jié)構(gòu)特征可用共聚焦顯微鏡測量方 法確定，而衍射圖像則可通過嚴格的基于麥克斯韋方程的彈性光散射模型計算獲得(可參 見(1) J. Q. Lu, P. Yang, X. H. Hu, ” Simulations of Light Scattering from aBiconcave Red Blood Cell Using the FDTD method" ， Journal of Biomedical Optics，10(2)， 024022 (2005) ； (2) R. S. Brock，X. H. Hu，D. A. Weidner，J. R. Mourant, 1Q. Lu，“ Effect of Detailed Cell Structure on Light Scattering Distribution :FDTD studyof a B-cell with 3D Structure Reconstructed from Confocal Images" ， Journal ofQuantitative Spectroscopy & Radiative Transfer，102，25-36 (2006))。
在本發(fā)明一些實施方式中，粒子的結(jié)構(gòu)參數(shù)可以通過在置于偏離聚焦位置的成像 系統(tǒng)所測得的圖像數(shù)據(jù)分析獲得，如下面的例4中所述。
盡管這里討論的本發(fā)明實施方式是依據(jù)圖1中基于微流器件設(shè)計的流式細胞儀 10和流控裝置100描述的，應(yīng)該指出本發(fā)明還可采用其他流控技術(shù)。例如流控裝置可以采12用非微流器件方式加以實現(xiàn)。圖12顯示了一個基于“流中流”設(shè)計概念的流控裝置300。 流控裝置300包括一個用于儲存樣品流302A的樣品流池302、一個鞘流入口 304以及包含 三種不同流體通道306A、306B和306C的流體樣品室305。流體樣品室305可以是內(nèi)部充滿 水的玻璃容器。
樣品流池302包括一個用于將樣品流302A壓入流體樣品室305的活塞302B，使 得樣品流302A與自鞘流入口 304處流入的鞘流會合。樣品流302A進入流體通道306A、鞘 流經(jīng)入口 304進入另一通道306B后與樣品流302A在此處會合。樣品流池302也包括一個 保持樣品粒子在樣品流302A中懸浮的攪拌裝置302C。流體樣品室305包括流體通道306B 和306C，其間有一隙域308。通過對流體流量以及流體通道306A和306B尺寸和位置的調(diào) 節(jié)，可以使自通道306A流至通道306B的樣品流與鞘流形成層流后經(jīng)過隙域308流入通道 306C，最后流至出口 310。此時粒子P在流體動力學(xué)聚焦條件下由樣品流302A夾載以單列 方式通過隙域308，使用在合適的位置上的物鏡沈0以及后接的相機(如電荷耦合器件相 機)即可對位于流體樣品室305內(nèi)隙域308的粒子P進行單個粒子圖像測量。樣品流用以 攜帶各種需要測量的粒子，例如這里所討論的生物細胞(包括人體細胞和水生植物細胞) 及其他微粒。
在這種配置方式下，粒子P在流經(jīng)隙域308時所發(fā)出的光信號被成像傳感器接收， 此時粒子P附近不存在類似于制作通道306A、306B和306C的光折射率不同的材料。
在本發(fā)明一些實施方式中，可用不銹鋼細管作為通道306A引導(dǎo)樣品流302A自的 樣品流池302流入通道306B，不銹鋼細管內(nèi)直徑例如可為大約200微米，外直徑可為大約 300微米。圖12所示的通道306B是由一個內(nèi)部長度約為8毫米的玻璃管T2連接一個漏 斗形的玻璃質(zhì)方形管Tl組成的，Tl的內(nèi)邊長可約為80微米外邊長可約為230微米。在由 供給流體的針管泵所提供的適當(dāng)?shù)膲簭姴顥l件下，樣品流與鞘流在通道306B的玻璃管T2 內(nèi)形成層流。通過此層流，粒子可在流過隙域308時定位于直徑最小約為100微米的樣品 流內(nèi)，然后由通道306C收集排出。隙域308在流動方向的長度可約為5毫米。如果流體樣 品室305內(nèi)的流體以及流過通道306A、306B和306C內(nèi)的流體具有相同或相似的光折射率 (例如樣品流、鞘流和流體樣品室305內(nèi)的流體均為水或以水為主的液體)，則在成像系統(tǒng) 的視野內(nèi)這三種流體之間的界面就不存在折射率差異或差異極小。比如工作距離為13毫 米的物鏡260可以用來選擇視野，使得流體樣品室305的玻璃外殼在視野之外，從而可在視 野內(nèi)消除具有不同折射率的界面，或使界面的折射率差異極小。
應(yīng)該指出流體樣品室305與物鏡260可用任何其他適當(dāng)?shù)姆绞綄崿F(xiàn)。例如在通道 306B中以層流形式流動的樣品流和鞘流可以從流體樣品室305的上端或側(cè)面進入，而不是 如圖12所示的從下端進入。
因此，通過減低或消除在粒子P附近區(qū)域內(nèi)的界面折射率差異可提高物鏡206 (如 圖2、圖3、圖4A至圖4B和圖5中所示)測量到的圖像質(zhì)量。與設(shè)計為微流裝置的樣品室 108相比，在粒子P附近隙域308不存在大的折射率差異。一或多數(shù)激光束可從流體樣品 室305的一個平側(cè)面入射后激發(fā)粒子P，然后使用顯微鏡物鏡260和其后的相機(如電荷耦 合器件相機)從另個平側(cè)面收集測量散射光。在一些實施方式中，物鏡260及其位置可以 選擇使其視野不含流體樣品室305的任何平側(cè)面(一般與粒子P的距離可在10至15毫米 之間)?；凇傲髦辛鳌备拍钤O(shè)計的通道306B和306C以及隙域308是用以減小或消除粒子P附近界面的折射率差異，同時還可提供與通常形式的流式細胞儀相似的層流條件，使得快 速分析和/或利用多束激光入射光成為可能。
我們現(xiàn)在將討論下述幾個不帶局限性的范例，用來描述本發(fā)明的其他實施方式。
例一
為了從相干散射光激發(fā)下的粒子所產(chǎn)生的彈性散射光信號中提取更多的結(jié)構(gòu)信 息，我們試制了一臺微流器件型流式細胞儀原型機，以驗證利用一臺標準的電荷耦合器件 相機(Alta 2000, Apogee)測量衍射圖像的概念。該原型機如圖6a至圖6d所示，其性能可 以達到表一所列的指標。
表一雙圖象微流器件型流式細胞儀的期望指標
權(quán)利要求
1.一種流式細胞儀系統(tǒng)，其中包括一個流控裝置可用于形成流體動力學(xué)聚焦流體，其特點為包括一個外層鞘流體和一個 內(nèi)層樣品流體；一個相干光源可用于對位于內(nèi)層樣品流體的一個粒子的照明；一個傳感器可用于測量被相干光源激發(fā)的粒子所產(chǎn)生的彈性散射光的空間相干分布；還有一個分析模塊可用于從彈性散射光的空間相干分布中提取粒子的三維結(jié)構(gòu)參數(shù)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞儀系統(tǒng)，其流控裝置由一個第一流體通道、一個第二流 體通道和一個在第一流體通道與第二流體通道之間的充滿流體的隙域組成，其傳感器可在 被相干光源激發(fā)的粒子位于第一流體通道與第二流體通道之間的隙域時用于測量其產(chǎn)生 的彈性散射光的空間相干分布。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞儀系統(tǒng)，其傳感器還可用于提供由粒子產(chǎn)生的彈性散射 光的空間相干分布所形成的衍射圖像數(shù)據(jù)。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細胞儀系統(tǒng)，還可包括一個非相干光源可用于對粒子的照明 和一個傳感器可用于測量被非相干光源激發(fā)的粒子所產(chǎn)生的亮場和/或暗場和/或熒光信 號所形成的非相干圖像數(shù)據(jù)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的細胞儀系統(tǒng)，其分析模塊可將相干圖像數(shù)據(jù)與非相干圖像數(shù) 據(jù)結(jié)合。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細胞儀系統(tǒng)，其分析模塊可根據(jù)彈性散射光的相干分布對粒 子分類。
7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的細胞儀系統(tǒng)，其分析模塊可根據(jù)衍射圖像數(shù)據(jù)提取粒子一種 結(jié)構(gòu)的一個結(jié)構(gòu)參數(shù)。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細胞儀系統(tǒng)，其衍射圖像數(shù)據(jù)是由在一個相對于粒子非聚焦 位置上測得的圖像數(shù)據(jù)組成的。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的細胞儀系統(tǒng)，其粒子結(jié)構(gòu)是由一個生物細胞中的細胞質(zhì)和/ 或核和/或線粒體的體積與折射率組成的。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞儀系統(tǒng)，其流控裝置可用于形成一個層流體。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞儀系統(tǒng)，其流控裝置可由一個其折射率與鞘流折射率 基本相似的流體室組成。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的細胞儀系統(tǒng)，其流體室具有至少一個平面邊面。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞儀系統(tǒng)，其傳感器還可用于測量在一個角度范圍內(nèi)的 散射光，其范圍的中心角度與來自相干光源的光束傳播的方向之間有一個偏離角度。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的細胞儀系統(tǒng)，其偏離角度大約為90度。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞儀系統(tǒng)，其分析模塊可根據(jù)一個計算和/或測量細胞圖 像數(shù)據(jù)庫提取粒子三維結(jié)構(gòu)參數(shù)。
16.一種分析流式細胞儀系統(tǒng)內(nèi)粒子以決定三維結(jié)構(gòu)參數(shù)的方法，其中包括形成一個 流體動力學(xué)聚焦流體，流體包括一個外層鞘流體和一個內(nèi)層樣品流體；使用一個相干光源對位于內(nèi)層樣品流體的一個粒子的照明；測量被相干光源激發(fā)的粒子所產(chǎn)生的彈性散射光；還有從彈性散射光的空間相干分布中提取粒子的一個三維結(jié)構(gòu)參數(shù)。
17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其流體動力學(xué)聚焦流體的形成可由使流體通過一個 位于一個流體通道和充滿流體的隙域?qū)崿F(xiàn)，并測量被相干光源激發(fā)的位于隙域內(nèi)的粒子所 產(chǎn)生的彈性散射光的空間相干分布。
18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，還包括提供由被相干光源激發(fā)的粒子所產(chǎn)生的彈性 散射光的空間相干分布所形成的衍射圖像數(shù)據(jù)。
19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，還包括用一個非相干光源對粒子照明和測量由非相 干光源激發(fā)產(chǎn)生的彈性散射和/或熒光信號所形成的非相干圖像數(shù)據(jù)。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，還包括將相干圖像數(shù)據(jù)與非相干圖像數(shù)據(jù)結(jié)合。
21.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，還包括根據(jù)彈性散射光的相干分布對粒子分類。
22.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，還包括根據(jù)衍射圖像數(shù)據(jù)確定粒子一種結(jié)構(gòu)中的體 積與折射率。
23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的方法，其粒子結(jié)構(gòu)是由一個生物細胞中的細胞質(zhì)和/或核 和/或線粒體的體積與折射率組成的。
24.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其一個流體動力學(xué)聚焦流體的形成為一個經(jīng)過流體 動力學(xué)聚焦的層流體。
25.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，還包括一個折射率與鞘流折射率基本相似的流體室。
26.根據(jù)權(quán)利要求25所述的方法，其流體室具有至少一個平面邊面。
27.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其測量的散射光分布于一個角度范圍內(nèi)，其中心角 度與來自相干光源的光束傳播的方向之間有一個偏離角度。
28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其偏離角度大約為90度。
29.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其三維結(jié)構(gòu)參數(shù)是從一個計算和/或測量細胞圖像 數(shù)據(jù)庫提取的。
30.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其光信號是在一個相對于粒子非聚焦位置上測量到的。
31.一個用于分析細胞流式儀中粒子并決定三維結(jié)構(gòu)參數(shù)的計算機程序產(chǎn)品，細胞流 式儀具有一個流體動力學(xué)聚焦流體并包括一個外層鞘流體和一個內(nèi)層樣品流體，一個可用 于照明一個粒子的相干光源，一個傳感器可用于測量被相干光源激發(fā)的粒子所產(chǎn)生的彈性 散射光的空間相干分布，該計算機程序產(chǎn)品包括一個可用的存儲介質(zhì)其中具有計算機可讀 的程序編碼，計算機可讀的程序編碼包括可讀入自細胞流式儀出射的由彈性散射光的空間相干分布形成的衍射圖像數(shù)據(jù)的計 算機可讀的程序編碼；可自彈性散射光的空間相干分布提取出粒子三維結(jié)構(gòu)參數(shù)的計算機可讀的程序編碼。
32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的計算機程序產(chǎn)品，還包括可讀入自細胞流式儀出射的非相 干圖像數(shù)據(jù)，非相干圖像數(shù)據(jù)包括由非相干光源激發(fā)的粒子產(chǎn)生的彈性散射信號所形成的 亮場和/或暗場圖像數(shù)據(jù)和/或熒光信號所形成的熒光圖像數(shù)據(jù)。
33.根據(jù)權(quán)利要求32所述的計算機程序產(chǎn)品，還包括可用于根據(jù)彈性散射光的空間相 干分布對粒子分類的計算機可讀的程序編碼。
34.根據(jù)權(quán)利要求31所述的計算機程序產(chǎn)品，還包括可用于根據(jù)衍射圖像數(shù)據(jù)確定粒 子一種結(jié)構(gòu)中的體積與折射率的計算機可讀的程序編碼。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的計算機程序產(chǎn)品，其粒子結(jié)構(gòu)是由一個生物細胞中的細胞 質(zhì)和/或核和/或線粒體的體積與折射率組成的。
36.根據(jù)權(quán)利要求31所述的計算機程序產(chǎn)品，其三維結(jié)構(gòu)參數(shù)是從一個計算和/或測 量細胞圖像數(shù)據(jù)庫提取的。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種流式細胞儀系統(tǒng)，其中包括由外層鞘流與內(nèi)層樣品流組成的可形成流體力學(xué)聚焦的液流控制器件。一個可照射處于內(nèi)層樣品流中單個粒子的相干光源。一個可用來探測被相干光源激發(fā)的粒子所產(chǎn)生的彈性散射光的空間分布的傳感器。一個可用來從彈性散射光的空間分布提取該粒子的三維結(jié)構(gòu)參數(shù)的分析模塊。
文檔編號G01N33/487GK102037343SQ200980114507
公開日2011年4月27日 申請日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日
發(fā)明者盧軍O., 肯尼思.M.雅可布, 胡新華 申請人:東卡萊羅納大學(xué)