專利名稱：一種檢測(cè)肺炎支原體耐藥突變的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物、醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及耐藥病原微生物檢驗(yàn)的方法，具體涉及一種檢測(cè)肺 炎支原體耐藥突變的方法。尤其是一種檢測(cè)肺炎支原體及其大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變的方法。
背景技術(shù)：
肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae, Mp)屬于柔膜體綱，支原體科，支原體 屬。由Chanock等于1962年從胸水中首次分離。肺炎支原體可引起支氣管炎和非典型肺 炎。Foy報(bào)道1962 1975年間15% 20%的社區(qū)獲得性肺炎由肺炎支原體引起(Clin InfectDis. 1993，17 :S37)，兒童中18 %的支原體肺炎需要入院治療(Clin Microbiol Rev. 2004，17 697)。亞洲地區(qū)近期進(jìn)行的一項(xiàng)成人社區(qū)獲得性肺炎流行病學(xué)調(diào)查顯示，肺 炎支原體肺炎約占的12. 2% (Int J Infect Dis. 2005，9 144)。因此，肺炎支原體是引起 社區(qū)獲得性呼吸道感染的主要和重要病原體之一。由于肺炎支原體缺乏細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，因此對(duì)β -內(nèi)酰胺類、糖肽類和磺胺類等作用 于細(xì)胞壁的抗生素固有耐藥。臨床用于治療肺炎支原體感染的抗菌藥物主要包括大環(huán)內(nèi)酯 類、四環(huán)素類和氟喹諾酮類。四環(huán)素類藥物因可引起牙齒著色故在妊娠后期、新生兒以及8 歲以下兒童中限制使用，氟喹諾酮類可能引起軟骨發(fā)育異常因此不能應(yīng)用于兒童。因此，尤 其是對(duì)于兒童患者而言，大環(huán)內(nèi)酯類藥物是治療肺炎支原體感染的首選藥物。以往認(rèn)為肺炎支原體對(duì)紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類敏感性高，無耐藥株產(chǎn)生，但近年日 本、法國(guó)以及中國(guó)地區(qū)先后報(bào)道臨床分離到對(duì)紅霉素等大環(huán)內(nèi)酯類高度耐藥的肺炎支原 體，給臨床治療，特別是兒童感染者的治療帶來很大挑戰(zhàn)。耐藥機(jī)制研究顯示，肺炎支原 體23S rRNA發(fā)生2063位、2064位或2617位核苷酸的突變是紅霉素高耐藥的決定因素 (Antimicrob Agents Chemother. 2004,48 4624 ；Antimicrob Agents Chemother,2005, 49 2302)。近年紅霉素耐藥肺炎支原體感染發(fā)生率逐年上升，上海地區(qū)2005 08年肺炎 支原體對(duì)紅霉素耐藥率為 83% (Antimicrob Agents and Chemother. 2009，53 :2160)，耐藥 均由2063位突變所致，北京學(xué)者亦有類似報(bào)道，發(fā)現(xiàn)耐藥主要由2063位突變引起，少數(shù)由 2064位核苷酸突變導(dǎo)致。如能提供以上肺炎支原體耐藥突變信息，可為臨床醫(yī)生正確診斷 疾病、合理選用抗生素提供客觀依據(jù)。基于分離培養(yǎng)的肺炎支原體檢測(cè)及藥敏測(cè)定技術(shù)，由于肺炎支原體生長(zhǎng)緩慢、培 養(yǎng)周期長(zhǎng)(1 2周)、技術(shù)要求高、分離費(fèi)用昂貴，臨床應(yīng)用困難。因此在臨床常規(guī)工作 中國(guó)內(nèi)外均以血清學(xué)方法或聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)方法進(jìn)行檢測(cè)。然而，血清學(xué)需比較急 性期和恢復(fù)期雙份血清抗體滴度，只能提供回顧性診斷依據(jù)，對(duì)臨床治療指導(dǎo)意義不大。 PCR方法快速、靈敏，但多數(shù)方法只能檢測(cè)肺炎支原體，而不能檢測(cè)引起耐藥的23S rRNA突 變，無法提供藥敏方面的信息。目前雖然已有少量檢測(cè)肺炎支原體耐藥突變的PCR檢測(cè) 方法，但由于采用的是限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性(RFLP，Restriction FragmentLength Polymorphism)、高分辨解鏈溫度分析(HRM，High-Resolution Melt Analysis)等費(fèi)時(shí)、特 異性欠佳的PCR產(chǎn)物分析技術(shù)，實(shí)際應(yīng)用受到很大限制。
Cycling探針技術(shù)是由RNA和DNA構(gòu)成的雜合探針與Rnase H酶組合使用的高靈 敏度檢測(cè)方法，能夠高效率地檢出擴(kuò)增過程中形成的目的基因片段，具體原理如圖1所示 Cycling探針是內(nèi)部含有RNA堿基的嵌合探針(Chimera probe)，探針一端標(biāo)記熒光物質(zhì) (Fluorescer)、另一端標(biāo)記淬滅物質(zhì)(Quencher)，當(dāng)探針處于完整狀態(tài)時(shí)，由于熒光淬滅物 質(zhì)作用抑制熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。當(dāng)探針與擴(kuò)增產(chǎn)物中互補(bǔ)序列雜交(Hybridformation) 后，Rnase H酶在RNA堿基處切斷探針，淬滅抑制作用解除，熒光物質(zhì)發(fā)出熒光。此時(shí)通過測(cè) 定熒光強(qiáng)度，能夠?qū)崟r(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增產(chǎn)物量。如果探針的RNA及鄰近堿基與模板不匹配，Rnase H將不能切斷探針，所以cycling探針技術(shù)是一種單堿基突變的高特異性檢測(cè)方法，該技術(shù) 在肺炎支原體耐藥突變檢測(cè)方面尚無報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種快速、高敏感性、高特異性的檢測(cè)耐藥病原微生物的方 法，具體涉及一種檢測(cè)肺炎支原體耐藥突變的方法。尤其是一種檢測(cè)肺炎支原體及其大環(huán) 內(nèi)酯類耐藥突變的方法。為實(shí)現(xiàn)快速、高敏感性的目的，本發(fā)明采用PCR技術(shù)，為確保檢測(cè)的高特異性，本 發(fā)明采用了 Real-time PCR及可分辨單堿基差異的cycling探針技術(shù)。本發(fā)明通過生物信息學(xué)分析，在肺炎支原體23S rRNA基因2063位/2064位堿基 上下游序列中尋找針對(duì)肺炎支原體的特異性引物，引物序列為上游引物5，-CTGAAGCCCCAGTGAACGG-3，下游引物5，-ATTAGAACAGCACACAACCAAG-3，本發(fā)明中，根據(jù)肺炎支原體無突變敏感株及突變耐藥株23S rRNA基因2063位 /2064位的堿基差異，分別設(shè)計(jì)了針對(duì)無突變敏感株、2063位突變耐藥株及2064位突變耐 藥株的特異性cycling探針，探針序列為FAM熒光標(biāo)記的無突變敏感株檢測(cè)探針5’ -(Eclipse)GACGGAaAGAC(FAM)-3，HEX 熒光標(biāo)記的 2063 位突變耐藥株探針5，-(Eclipse)GACGGGaAGAC(HEX) _3，ROX 熒光標(biāo)記的 2064 位突變耐藥株探針5，-(Ecl ipse) GACGGAgAGAC (ROX) _3，探針序列中，小寫字母為cycling探針引入的RNA堿基。當(dāng)采用肺炎支原體特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增過程中，如果被檢標(biāo)本中有肺炎支原 體23S rRNA序列時(shí)，不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的相應(yīng)探針會(huì)與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物完全匹配雜交，并被 Rnase H切斷釋放特定熒光，通過Real-time PCR擴(kuò)增儀實(shí)時(shí)讀取熒光強(qiáng)度變化，可確定被 檢樣品中的序列的突變類型。例如被檢樣品為2063位突變耐藥株，擴(kuò)增過程中PCR產(chǎn)物 會(huì)與HEX標(biāo)記的探針雜交并被Rnase H切斷釋放HEX熒光，而其它2種探針由于不能與PCR 產(chǎn)物完全匹配雜交，不被Rnase H切斷釋放熒光，隨PCR循環(huán)數(shù)(擴(kuò)增曲線X軸)增加，產(chǎn) 物逐漸累積致使HEX熒光強(qiáng)度(擴(kuò)增曲線Y軸)增強(qiáng)，PCR擴(kuò)增結(jié)束時(shí)分析軟件可自動(dòng)生 成HEX熒光強(qiáng)度逐漸上升的擴(kuò)增曲線，以HEX熒光通道讀取窗口可呈現(xiàn)圖4所示曲線，無 2063位突變的則維持在水平的基線附近。同理，無突變及2064位突變的肺炎支原體樣品可 在FAM通道及ROX通道分別出現(xiàn)圖3與圖5所示曲線。本發(fā)明不需要額外的限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、高分辨解鏈溫度分析等費(fèi) 時(shí)、復(fù)雜的PCR產(chǎn)物方法，可在2小時(shí)內(nèi)完成樣品處理及Real-time PCR擴(kuò)增，快速檢出肺
4炎支原體。采用本發(fā)明檢測(cè)肺炎支原體臨床分離株，能正確區(qū)分無突變敏感株和突變耐藥 株，特異性為100%。敏感性可達(dá)IO2拷貝/PCR反應(yīng)，與目前檢測(cè)其它病原微生物的PCR試 劑盒敏感性相當(dāng)。本發(fā)明引物及探針與含Rnase H酶的PCR擴(kuò)增試劑組合，可用于肺炎支原體及其 大環(huán)內(nèi)酯類耐藥突變的檢測(cè)。本發(fā)明具有操作簡(jiǎn)便、快速，且敏感性、特異性高等優(yōu)點(diǎn)。


圖1是Cycling探針技術(shù)原理圖。圖2是肺炎支原體敏感標(biāo)準(zhǔn)株及臨床株P(guān)CR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖，其中，1.DNA marker, DL2000 ；2.肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC15531) ；3 肺炎支 原體標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC29342) ；4.大腸埃希菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25922) ；5.肺炎克雷伯菌標(biāo) 準(zhǔn)株(ATCC700603) ；6.金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC25923) ；7.肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)株 (ATCC49619) ；8.銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC27853).肺炎支原體大環(huán)內(nèi)酯類敏感臨床株； 10.肺炎支原體2063位突變耐藥株臨床株；11.肺炎支原體2064位突變耐藥臨床株。圖3是cycling探針法擴(kuò)增肺炎支原體敏感株的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線(FAM熒 光通道)，其中，A為敏感株陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增曲線，B為敏感株陽(yáng)性對(duì)照和臨床敏感株擴(kuò)增曲線 (X軸為PCR循環(huán)數(shù)，Y軸為FAM熒光強(qiáng)度)，顯示FAM熒光隨擴(kuò)增循環(huán)數(shù)增加而增強(qiáng)，結(jié)果 表明樣品中有與FAM熒光標(biāo)記的無突變敏感株檢測(cè)探針互補(bǔ)雜交的序列，即該樣品含無 突變的敏感肺炎支原體。圖4是cycling探針法擴(kuò)增2063位突變耐藥株的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線(HEX熒 光通道)，其中，A為2063位突變耐藥株陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增曲線，B為2063位突變耐藥株陽(yáng)性對(duì) 照和臨床耐藥株擴(kuò)增曲線(X軸為PCR循環(huán)數(shù)，Y軸為HEX熒光強(qiáng)度)，顯示HEX熒光隨擴(kuò)增 循環(huán)數(shù)增加而增強(qiáng)，結(jié)果表明樣品中有與HEX熒光標(biāo)記的2063位突變耐藥株探針互補(bǔ)雜 交的序列，即該樣品含2063位突變耐藥株。圖5是cycling探針法擴(kuò)增2064位突變耐藥株的實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增曲線(R0X熒 光通道)，其中，A為2064位突變耐藥株陽(yáng)性對(duì)照擴(kuò)增曲線，B為2064位突變耐藥株陽(yáng)性對(duì) 照和臨床耐藥株擴(kuò)增曲線(X軸為PCR循環(huán)數(shù)，Y軸為ROX熒光強(qiáng)度)，顯示HEX熒光隨擴(kuò)增 循環(huán)數(shù)增加而增強(qiáng)，結(jié)果表明樣品中有與HEX熒光標(biāo)記的2064位突變耐藥株探針互補(bǔ)雜 交的序列，即該樣品含2064位突變耐藥株。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 本發(fā)明的PCR引物的特異性分析采用天根細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(產(chǎn)品編號(hào)DP302_02)提取肺炎支原體標(biāo) 準(zhǔn)株(ATCC15531)、肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC29342)、大腸埃希菌(ATCC25922)、肺炎克雷伯 菌(ATCC700603)、金黃色葡萄球菌(ATCC25923)、肺炎鏈球菌(ATCC49619)、肺炎支原體大環(huán)內(nèi)酯類敏感臨床株、肺炎支原體2063位突變耐藥株臨床株、肺炎支原體2064位突變耐藥 臨床株的基因組DNA為擴(kuò)增模板(抽提時(shí)間約25分鐘)。以針對(duì)肺炎支原體的特異性上、 下游引物與Takara PCR擴(kuò)增試劑(產(chǎn)品編號(hào)DR100A)按說明書配制擴(kuò)增體系。擴(kuò)增條件 為預(yù)變性94°C 5分鐘；變性94°C 30秒，退火55 °C 30秒，延伸72 °C 35秒，循環(huán)40次。擴(kuò) 增產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析。結(jié)果如圖2所示，肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株、肺炎支原 體臨床分離株的DNA樣品經(jīng)擴(kuò)增有預(yù)期大小(316bp)陽(yáng)性條帶，其它DNA樣品均無陽(yáng)性條 帶及非特異擴(kuò)增，表明引物具有良好的特異性。實(shí)施例2 本發(fā)明的肺炎支原體臨床分離株將肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)株(ATCC15531，大環(huán)內(nèi)酯類敏感株)、2063位突變株及2064 位突變株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物切膠純化，插入PCR產(chǎn)物克隆載體，經(jīng)測(cè)序確認(rèn)無誤，純化、讀取 OD值后計(jì)算質(zhì)?？截悢?shù)，并將此載體稀釋至IO5拷貝/毫升每次PCR取1微升(約含IO2 拷貝)作為陽(yáng)性對(duì)照，陰性對(duì)照為相同濃度的大腸埃希菌基因組DNA。以上、下游引物、無 突變敏感株檢測(cè)探針、2063位突變耐藥株探針、2064位突變耐藥株探針與Takara公司的 CycleavePCR Core Kit (產(chǎn)品編號(hào)DCY501)按說明書配制PCR反應(yīng)體系，3種探針濃度經(jīng) 優(yōu)化分別為1. 5 μ Μ、6 μ M和6 μ M，采用ΑΒΙ7300型PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。擴(kuò)增條件為預(yù)變性 950C 30秒；變性95°C 5秒，退火55°C 15秒，延伸72°C 31秒，循環(huán)50次(擴(kuò)增時(shí)間約80分 鐘)。采用不同的熒光通道進(jìn)行檢測(cè)結(jié)果讀取，檢測(cè)結(jié)果如圖3 圖5所示，各陽(yáng)性對(duì)照在 相應(yīng)的熒光通道均有特異性擴(kuò)增曲線，相應(yīng)臨床分離株有相似的擴(kuò)增曲線。采用本發(fā)明檢測(cè)54株肺炎支原體臨床分離株(經(jīng)23S rRNA測(cè)序確認(rèn)8株為無 突變敏感株，45株2063位耐藥突變株，1株為2064為耐藥突變株)，結(jié)果顯示，本發(fā)明可在 2小時(shí)內(nèi)快速檢出肺炎支原體，并能正確區(qū)分無突變敏感株和突變耐藥株，本發(fā)明的檢測(cè)結(jié) 果與測(cè)序結(jié)果完全相符，特異性達(dá)100%。同時(shí)，陽(yáng)性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果顯示，本發(fā)明檢測(cè)敏感 性可達(dá)IO2拷貝/PCR反應(yīng)，與目前多數(shù)PCR檢測(cè)試劑盒的敏感性相當(dāng)。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)肺炎支原體耐藥突變的方法，其特征在于，采用Real-time PCR及可分辨 單堿基差異的cycling探針技術(shù)，通過下述步驟1)在肺炎支原體23SrRNA基因2063位/2064位堿基上下游序列中尋找針對(duì)肺炎支原 體的特異性引物，引物序列為上游引物 5，-CTGAAGCCCCAGTGAACGG-3，下游引物 5，-ATTAGAACAGCACACAACCAAG-3，；2)根據(jù)肺炎支原體無突變敏感株及突變耐藥株23SrRNA基因2063位/2064位的堿 基差異，分別設(shè)計(jì)針對(duì)無突變敏感株、2063位突變耐藥株及2064位突變耐藥株的特異性 cycling 探針；3)采用肺炎支原體特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過Real-timePCR擴(kuò)增儀實(shí)時(shí)讀取熒 光強(qiáng)度變化，確定被檢樣品中的序列的突變類型。
2.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2的特異性cycling探針及其序列 分別為FAM熒光標(biāo)記的無突變敏感株檢測(cè)探針5，- (Eclipse)GACGGAaAGAC(FAM)-3，HEX熒光標(biāo)記的2063位突變耐藥株探針5，-(Eclipse)GACGGGaAGAC(HEX)-3，ROX熒光標(biāo)記的2064位突變耐藥株探針5，-(Ecl ipse)GACGGAgAGAC(ROX)-3，其中，粗體小寫字母為cycling探針引入的RNA堿基。
3.按權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述的不同熒光基團(tuán)標(biāo)記的相應(yīng)探針與PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物完全匹配雜交，并被Rnase H切斷釋放特定熒光，通過Real-time PCR擴(kuò)增儀實(shí)時(shí) 讀取其熒光強(qiáng)度變化。
4.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的HEX標(biāo)記的探針與PCR產(chǎn)物雜交并被 Rnase H切斷釋放HEX熒光，而其它探針不與PCR產(chǎn)物完全匹配雜交，不被Rnase H切斷釋 放熒光，隨PCR循環(huán)數(shù)增加，產(chǎn)物累積致使HEX熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，生成HEX熒光強(qiáng)度逐漸上升 的擴(kuò)增曲線，無2063位突變的則維持在水平的基線附近。
5.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的FAM標(biāo)記的探針與PCR產(chǎn)物雜交并被 Rnase H切斷釋放FAM熒光，而其它探針不與PCR產(chǎn)物完全匹配雜交，不被Rnase H切斷釋 放熒光，隨PCR循環(huán)數(shù)增加，產(chǎn)物累積致使FAM熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，生成FAM熒光強(qiáng)度逐漸上升 的擴(kuò)增曲線，無突變的則維持在水平的基線附近，
6.按權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的ROX熒光標(biāo)記的探針與PCR產(chǎn)物雜 交并被Rnase H切斷釋放FAM熒光，而其它探針不與PCR產(chǎn)物完全匹配雜交，不被Rnase H 切斷釋放熒光，隨PCR循環(huán)數(shù)增加，產(chǎn)物累積致使ROX熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，生成ROX熒光強(qiáng)度逐 漸上升的擴(kuò)增曲線，無2064位突變的則維持在水平的基線附近。
7.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，本方法正確區(qū)分肺炎支原體臨床分離株的 無突變敏感株和突變耐藥株，特異性為100%，敏感性達(dá)IO2拷貝/PCR反應(yīng)。
全文摘要
本發(fā)明屬生物、醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種檢測(cè)肺炎支原體耐藥突變的方法。本發(fā)明采用Real-time PCR及可分辨單堿基差異的cycling探針技術(shù)，通過在肺炎支原體23S rRNA基因2063位/2064位堿基上下游序列中尋找針對(duì)肺炎支原體的特異性引物，根據(jù)肺炎支原體無突變敏感株及突變耐藥株23S rRNA基因2063位/2064位的堿基差異，分別設(shè)計(jì)針對(duì)無突變敏感株、2063位突變耐藥株及2064位突變耐藥株的特異性cycling探針；采用肺炎支原體特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過Real-time PCR擴(kuò)增儀實(shí)時(shí)讀取熒光強(qiáng)度變化，確定被檢樣品中的序列的突變類型。本發(fā)明能正確區(qū)分肺炎支原體臨床分離株無突變敏感株和突變耐藥株，特異性為100％。敏感性可達(dá)102拷貝/PCR反應(yīng)。
文檔編號(hào)G01N21/64GK102002522SQ20091019857
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者劉楊, 徐曉剛, 王明貴 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院