專利名稱：用于微生物分析的裝置的制作方法
用于微生物分析的裝置 本發(fā)明涉及一種用于對可能含有微生物的載體進行微生物分析的裝置，以便檢測
是否存在那些微生物。 —種分析這樣的載體的方法由如下操作構成在用所謂的熒光團或熒光團標記物
標記了微生物之后，通過分析那些微生物發(fā)出的熒光來檢測微生物的存在。 這些標記物僅在事先被微生物中包含的化學酶激活時才具有發(fā)熒光的特性。 這些標記物一般包括熒光團基團以及能夠隱蔽或防止熒光團基團的熒光顯示出
來的基團。在存在微生物時，其化學酶的效果是使該第二基團改性，從而可以檢測到第一基
團的熒光。 于是，如圖7的頻譜53和54所示，當這樣標記的微生物受到適當的激發(fā)光作用 時，熒光團基團能夠吸收峰值53'處于波長入2的吸收頻譜53的光能，并以特征熒光發(fā)射 譜54的形式釋放能量，發(fā)射譜的峰值54'處于不同于、的波長入3。
為了觀察在存在這種標記物的情況下微生物發(fā)射的熒光，如圖9所示，已經知道 有用于微生物分析的裝置(集成到顯微鏡中)，其包括照明設備，用于發(fā)射激發(fā)光，激發(fā)光 的高斯分布形式的光譜50的峰值50'處在波長、，選擇、使其等于波長入2，以利用充 分大的能量激發(fā)熒光團，從而在存在微生物的情況下使其發(fā)射具有其發(fā)射譜54的光。
這種裝置設有輸入濾波器，輸入濾波器置于照明設備和待照明的載體之間，例如 是光譜51如圖9所示的帶通濾波器，該濾波器具有以波長A工為中心的非常窄的通帶，以 便在給定照明設備的較寬譜寬對應于光譜50的條件下，僅選擇對于以期望能量正確激發(fā) 熒光團有用的波長。 這種裝置還包括置于被分析載體和用于觀察來自載體的光的區(qū)域之間的濾波器， 該濾波器如圖9的光譜52所示(這里是以波長A 2為中心的窄通帶帶通濾波器)，以便僅 讓由熒光團響應于激發(fā)光發(fā)射的光通過，而濾除所有其他無關波長。
例如，在美國專利US 7， 397， 602中描述了這種布置的裝置。 本發(fā)明涉及提供一種裝置，像現有技術的裝置那樣，該裝置用于檢測熒光，但該裝 置既更加經濟又更加簡單，同時提供了一樣好的性能。 為此，提供了一種用于對適于包含被熒光團試劑標記的微生物的載體進行微生物 分析的裝置，所述試劑在與所述微生物接觸時適于以峰值處于預定吸收波長(入2)的吸收 譜吸收光能并通過以峰值處于與所述吸收波長(入2)不同的預定發(fā)射波長(入3)的發(fā)射譜 發(fā)射熒光來釋放能量，所述裝置包括照明設備，所述照明設備適于對所述載體照明，以便使 所述被標記微生物響應于那些照明設備發(fā)射的激發(fā)光來發(fā)射具有所述發(fā)射譜的光；其特征 在于來自所述照明設備的激發(fā)光光譜包括處于與所述熒光團試劑的所述吸收波長(入2)和 發(fā)射波長(A 3)不同的預定激發(fā)波長(A》處的峰值，使得所述吸收波長(A2)位于所述激 發(fā)波長(A》和發(fā)射波長(A3)之間，所述激發(fā)波長(A》和吸收波長(A2)之間具有預定
的差，利用這一特征，容易將所述熒光團試劑發(fā)射的光與來自所述照明設備的光區(qū)分開。
這樣，在吸收波長、位于激發(fā)波長、和發(fā)射波長、之間的情況下，激發(fā)光譜
和吸收光譜之間的光譜偏移使得能夠有利地將位于A工之外的激發(fā)光光譜部分定位于那些吸收和發(fā)射波長之間，以便在波長入2獲得能量相當高的光來激發(fā)熒光團，使其通過熒光性 發(fā)光，并且使激發(fā)光譜與處于波長入3(和相鄰波長)的發(fā)射光譜具有小的交迭，以便在存 在微生物的情況下，來自照明設備且在被分析載體上反射的光不會與熒光團試劑發(fā)射的光 產生重大寄生干擾，從而能夠容易地將熒光團試劑發(fā)射的光與來自照明裝置的光區(qū)分開。
更具體而言，就這樣借助根據本發(fā)明的裝置的光譜偏移使激發(fā)光譜和發(fā)射光譜之 間的交迭很小，使熒光團發(fā)射光譜的峰值與激發(fā)光的光譜峰值進一步分離，相當大程度上 改善了熒光團發(fā)射波長(來自照明設備在該波長處發(fā)射的光)處寄生能量和實際來自被標 記微生物的熒光性質的能量之間的比例。 于是能夠容易地以充分大的對比度檢測到載體上對應于被標記微生物的亮點，使 它們能夠被清楚觀察到，尤其是利用肉眼觀察到。 于是，即使對于光譜色散不可忽略的照明設備(例如圖7和9的光譜50和55所 示)而言，該光譜偏移也使得能夠省去現有技術裝置的輸入濾波器，而不必由其他光譜色 散更低的照明設備(例如激光器，激光器通常極其昂貴)取代這種照明設備。
于是這樣就能夠顯著降低這種裝置的制造成本，同時使光能損失最小化，因為輸 入濾波器，尤其是窄通帶濾波器的存在必定導致這種裝置的能量處理量的顯著降低(從而 降低到達要照明的載體的光量)。 由于根據本發(fā)明的裝置中的光能損失較小，從而對于消耗的同樣的電能，能夠比 應用到現有技術的裝置的顯微鏡中照明更大的被分析載體表面(例如微孔濾膜的表面)。
出于制造和使用都簡單而方便的原因，根據本發(fā)明優(yōu)選如下特征
-所述激發(fā)波長(A 1)短于所述吸收波長(入2)，所述吸收波長(A2)短于所述發(fā) 射波長(入3);-激發(fā)光的所述光譜包括以所述激發(fā)波長(A 1)為中心的最大光強峰值；-所述激發(fā)波長(A 1)和吸收波長(A 2)之間的差小于所述熒光團試劑的所述吸
收波長(A 2)和發(fā)射波長(A 3)之間的差；-所述裝置還包括用于觀察所述熒光團試劑發(fā)射的光的窗口 ，所述窗口設有濾波 器，適于讓最長的波長通過，其截止波長位于所述吸收波長(A 2)和所述發(fā)射波長(A 3)之 間；-所述照明設備包括至少一個基座，所述基座上安裝至少一組光源，該組所述光源 彼此規(guī)則間隔，以形成用于所述載體的照明陣列；-所述照明設備包括兩個所述基座，所述基座向預定位置的方向相對于彼此傾斜 用于接收所述裝置中的所述載體；-每個所述基座相對于用于接收所述載體的所述預定位置傾斜40°和50°之間 的角度；-所述光源為發(fā)光二極管；和/或-所述照明設備包括適于發(fā)射多色光的燈和濾波器，所述濾波器適于讓最小的波 長通過，且其截止波長位于所述吸收波長(A 2)和所述發(fā)射波長(A3)之間。
參考附圖，從通過優(yōu)選但非限制性范例的方式給出的以下描述中將明了本發(fā)明的 特征和優(yōu)點，附圖中-

圖1是根據本發(fā)明的裝置的圖示；
-圖2是該裝置的透視圖，在其旁邊示出了裝置中用于分析的濾波單元；-圖3和4分別是從下方獲得的透視圖以及從該裝置的對稱正中平面截取的正截
面圖；-圖5是該裝置兩個印刷電路板之一的透視圖，其上固定了兩組發(fā)光二極管，每組 發(fā)光二極管都在預定波長發(fā)射光；-圖6是根據本發(fā)明的裝置的另一個實施例的透視圖；-圖7示出了根據本發(fā)明的不同光學構件的光譜圖以及該裝置用于標記微生物的
熒光團試劑的光譜圖，沿x軸為共同比例的波長，沿y軸為共同比例的相對光強； _圖8是根據本發(fā)明的裝置的又一實施例的部分的圖示；以及-圖9示出了類似于圖7但針對前述根據現有技術的裝置的光譜圖。 在借助圖7所示光譜圖詳述其工作模式之前，現在將在借助圖1到5給出根據本
發(fā)明的裝置的優(yōu)選實施例的描述。 圖1到5所示的裝置1包括外殼2、由兩個照明構件4形成的照明設備3、滑動抽 屜5和觀察窗口 7。 外殼是大致平行六面體形狀，具有上壁10和四個側壁11到14，故意沒有示出壁 14的一部分，以便示出裝置的內部。 在這里，觀察窗口 7由低通濾波器6構成(即，其允許最低頻率，即最長的波長通 過)，外殼2的上壁10中形成開口 9，以在其中接收濾波器6。 在下面將會看到，由壁10到14和30界定的該外殼2的內部形成分析室，分析室 與環(huán)境光隔離，其中容納要分析的載體。這里，要分析的載體是屬于濾波器單元40的微孔濾膜4l，這里是由MilliporeO以
Milliflex㊣為商標出售的單元。這個膜41直徑為55mm，被濾波器單元的主體42所圍繞。 這里使用的膜41是纖維素酯，其孔徑適于維持期望檢測其存在的微生物，大部分
常常在0. 10和100微米之間。 抽屜5具有主體30、軸環(huán)31和握柄32。 在主體30中，形成柱形腔33，用于接收濾波器單元40。 現在將借助圖3到5描述照明設備3 。 這些設備3包括兩個獨立的照明構件4。 每個構件4包括梯形截面的底座20、其上設置有兩組27和28 二極管22和23的 印刷電路板21、覆蓋那些二極管的漫射體24以及電路板21的邊緣和漫射體24邊緣之間的 兩個暗色濾光鏡26。 底座20固定于外殼2內部的外殼壁10上，而電路板21固定到底座20遠離靠著 壁10設置的那些面的其傾斜面上，使得那些電路板沿著載體41的接收區(qū)域33的方向朝向 彼此傾斜。 于是這樣提供了每個底座20，使得當單元40處于裝置外殼33中時(圖1)，每個
板子21相對于壁10和膜41所占據的預定位置具有45°的傾角A(圖1)。 電路板21的上邊緣25彼此相距100mm的距離，而那些邊緣25距壁1023mm的距離。 發(fā)光二極管22和23的頂點位于距漫射體2415mm距離處。
這里，這些漫射體24是由玻璃板制成的，玻璃板的一面(轉向二極管的面)經噴 沙處理。 在每個印刷電路板上，如圖5所示，設置由十六個二極管22構成的第一組二極管 27以及由四個二極管23構成的第二組二極管28。 二極管22彼此規(guī)則地間隔并設置成四個二極管一排等間距的四排，使得每個二 極管22距與其直接相鄰的二極管2216mm的距離。于是這一組27形成二極管陣列，使得在 將其置于外殼2中其預定位置時能夠均勻地對膜41進行照明，陣列的中心29位于距離該 預定位置54. 75mm的高度H處(圖1)。 二極管23分布于在二極管22的陣列中心隔行形成的正方形的四個角中，每個二 極管23位于距直接與其相鄰的兩個二極管2332mm距離處并處于正方形的中心處，在正方 形的角部有四個二極管22(圖5)。這個陣列的中心與二極管22構成的陣列中心29重合。
二極管22是來自LUMILED②公司以LXHL-PB01作為參考銷售的二極管，圖7中 示出了其發(fā)射譜55，這一高斯分布形式的光譜峰值55'處于470nm的波長A工處，于是發(fā) 射藍光。 二極管23是來自同一公司以參考LXHL-PD01銷售的二極管，圖中未示出其發(fā)射 譜，其發(fā)射譜也是高斯分布形式，在625nm波長處具有峰值，于是發(fā)射紅光。
對于25%的相對強度值而言，這些二極管具有140°的發(fā)射立體角，對于60%的 相對強度值，具有90。的發(fā)射立體角。 二極管23具有基本為二極管22四倍的發(fā)射功率，從而它們的數量比二極管22少 四倍。 隔行設置二極管22和23的陣列(即彼此嵌套)，從而在要照明的濾波器單元那里 獲得可能最均勻的光，無論光是來自二極管22還是來自二極管23 。 每組二極管都產生以預定波長為中心的光譜，以便能夠激發(fā)不同預定類型的熒光 團。 每個電路板21上的導電跡線電連接到用于裝置的命令和控制單元(未示出)。
現在將簡要介紹要分析樣本的制備。 在實際檢測步驟之前，操作員通過單元40的膜41進行過濾，以采集要分析的樣品 (可能含有微生物)。 —旦微生物被過濾并保留在膜上，可以包括任選步驟，即使與適當生長培養(yǎng)基接
觸的微生物生長。生長培養(yǎng)基優(yōu)選為凝膠介質，在過濾之后在其上沉積膜。該步驟是任選
的，使得能夠獲得一開始過濾的每種微生物菌落，這增大了要檢測的細胞數量。 然后使膜及其包含的微生物與使微生物細胞壁可滲透的成分接觸，隨后將熒光團
標記物加入實現可滲透的成分中，以便進入要檢測的微生物內部。 現在將介紹基于根據本發(fā)明的裝置判斷如此制備的樣品上是否存在微生物的實 施方式。 在第一階段中，拉出抽屜5，操作員在該抽屜的腔33中放入濾波器單元40(其可能 被未示出的透明蓋板覆蓋以保護膜不受外部污染物影響)。然后推入抽屜5，直到軸環(huán)31 抵靠壁13為止，使得膜41置于外殼2中其預定位置，以便被照明。 根據用于標記微生物的熒光團，操作員接下來選擇(例如通過圖中未示出的開關)對應的二極管22或23以將其導通(在圖示的范例中為二極管22)，以便均勻地照明膜 41的整個表面，并在正確波長激發(fā)用于進行標記的熒光團。 漫射體24以及二極管在電路板21上的空間分布使得無論使用哪組二極管，都能 夠對膜41的整個表面進行特別均勻的照明。 由于電路板21置于接收濾波器6的開口 9的每個邊上，因此響應于來自二極管的 激發(fā)光從濾波器單元40發(fā)射的光如圖1所示通過該濾波器，從而能夠用肉眼或經由攝像機 通過濾波器6觀察膜41的光響應。 現在將描述利用圖7所示不同光譜圖在存在微生物的情況下獲得的光響應。
在圖7中，光譜55是高斯形的，對應于激發(fā)光的光譜(這里為二極管22產生的光 譜)，并具有一峰，其與最大光強值對應的峰值55'處于等于470nm的波長A工處。
光譜53和54分別對應于這里選擇用于標記膜上存在的微生物的熒光團的吸收譜 和發(fā)射譜。 這里描述的熒光團是5-6CFDA(羧基-熒光素_Di_乙酸)。 吸收譜53在大于A工的波長A 2處具有峰值53 '，發(fā)射譜54在大于A 2的波長 入3處具有峰值54'。 在圖示的范例中，、等于492nm，、等于517nm，這里、和、之間的差小于入2 和、之間的差。 有意識地選擇激發(fā)波長A p使其小于A 2，使得光譜55的峰值55'相對于光譜53 的峰值53'在光譜54的相對側上偏移。選擇這一偏移，以便使來自照明設備的光具有足夠 高能量來激發(fā)熒光團，而光不會與熒光團響應于激發(fā)光而發(fā)射的光產生嚴重寄生干擾。
光譜56是觀察窗口的濾波器6的光譜，選擇其截止頻率(這里大約為550nm)以 使熒光團發(fā)射的光(光譜54)基本通過，并阻擋更短波長的光，尤其是來自二極管22的在 單元40上反射之后的光。 這一輸出濾波器(彩色濾波器)有弱選擇性，以允許充分多的光返回用戶眼睛，給 出大致明亮的景色，于是觀察起來讓人舒適，同時確保對比度水平適于用肉眼觀察。
當來自照明設備3的激發(fā)光照射濾波器單元40的膜41時，使得具有被熒光團標 記的微生物的該膜的每個位置以小尺寸(幾百微米)亮斑的形式變得可見，亮斑可以直接 由濾波器6之外的肉眼觀察到。 角度A和高度H的值為無論用肉眼或通過攝像機讀取膜41上的亮斑提供了最佳 表現。 這些值是通過以下操作確定的向控制膜施加黑標記和熒光黃標記，并針對角度 A和高度H的不同值尋找熒光頻帶亮度最大同時使黑標記上的寄生亮度最小的配置A、 H。
這樣做已經令人驚訝地證實，范圍[40° -50° ]的角度A給出了熒光標記的最大 強度并且對于黑標記實際上不存在的寄生光，從而對應于閱讀舒適度方面的最佳值。
因此，為了相對于安裝裝置期間的作用具有特定安全裕度，從而在此選擇了平均 值45° 。 至于高度值H，這是被照明對象尺寸的函數，已測試的不同配置表明，對于直徑為 55mm的膜以及角度A的值范圍在40。到50°而言，在39. 75mm和69. 75mm的高度范圍上獲 得了最佳結果。在此，類似地，在該范例中選擇的是平均值54. 75mm。
通過調節(jié)高度H，該裝置還適于照明除膜之外的其他類型樣品以及基本任何適于 (無論是在表面上或是在體積中)包含微生物且希望通過熒光性檢測其存在的載體。
圖6中示出了該裝置的另一個實施例。
—般而言，將增加了 100的相同附圖標記用于類似部分。 裝置101與裝置1具有相同特征，只是其缺少抽屜5 (例如這里，濾波器單元40直 接放在例如臺上)，并且這里觀察窗口 107是由靠著外殼102的壁110設置的矩形形式滑塊 108以及四個濾波器106到106〃 '形成的，每個濾波器都容納在滑塊108的對應開口中。
每個光學濾波器都是低通濾波器，從而允許低頻(最長的波長)通過，其截止頻率 與其他截止頻率不同。 滑塊108配合在該裝置的導軌(未示出)中，從而能夠將四個濾波器106到 106〃 '中任何選定的一個放置成與壁110的開口 109對準。 于是，根據所選的熒光團以及導通的二極管，能夠從四個可用濾波器中選擇具有 最適合截止頻率的一個(例如，以獲得最佳對比度)。 在一個未示出的實施例中，濾波器6不是低通濾波器，而是通帶以波長入2為中心 的帶通濾波器。 在圖8示意性示出的又一實施例中，照明設備的光譜峰值不必一定是局域化的， 于是，例如利用多色光燈204而不是二極管作為照明設備203在更大波長范圍上擴展光譜， 燈204與高通濾波器234相關聯，高通濾波器234允許最高頻率，即最短的波長通過，比現 有技術的帶通濾波器成本更低，其截止波長入。位于吸收波長、和發(fā)射波長入3之間(圖 8)。 最后，要指出的是，也可以針對很多其他應用按照不同版本生產這種照明系統(tǒng)，其 他應用例如是通過顯微鏡分析、掃描生物芯片、借助熒光性讀取板子、式細胞術、透照器、 PCR實時讀取進行分析，那么用于這些應用的每種的裝置幾何配置將是對相關應用特定的 版本。基座21固定于其上的裝置框架未必是像圖示外殼2的外殼；例如它可以是圍繞顯微 鏡光學裝置的環(huán)帶。 本發(fā)明不限于所述和圖示的實施例，而是涵蓋其任何變體。
權利要求
一種用于對適于包含被熒光團試劑標記的微生物的載體(41)進行微生物分析的裝置，所述試劑在與所述微生物接觸時適于以峰值(53′)處于預定吸收波長(λ2)的吸收譜吸收光能并通過以峰值(54′)處于與所述吸收波長(λ2)不同的預定發(fā)射波長(λ3)的發(fā)射譜(54)發(fā)射熒光來釋放該能量，所述裝置包括照明設備(3；203)，所述照明設備適于對所述載體(41)照明，以便使所述被標記的微生物響應于那些照明裝置(3；203)發(fā)射的激發(fā)光來發(fā)射具有所述發(fā)射譜(54)的光；其特征在于，來自所述照明設備(3；203)的所述激發(fā)光的光譜(55)包括處于與所述熒光團試劑的所述吸收波長(λ2)和發(fā)射波長(λ3)不同的預定激發(fā)波長(λ1)的峰值(55′)，使得所述吸收波長(λ2)位于所述激發(fā)波長(λ1)和發(fā)射波長(λ3)之間，并且所述激發(fā)波長(λ1)和吸收波長(λ2)之間具有預定的差，利用這一特征，容易將所述熒光團試劑發(fā)射的光與來自所述照明設備(3；203)的光區(qū)分開。
2. 根據權利要求l所述的裝置，其特征在于，所述激發(fā)波長(A》短于所述吸收波長 (入2)，所述吸收波長(A 2)短于所述發(fā)射波長(A 3)。
3. 根據權利要求1或2的任一項所述的裝置，其特征在于，所述激發(fā)光的所述光譜 (55)包括以所述激發(fā)波長(A》為中心的最大光強峰值(55')。
4. 根據權利要求1到3的任一項所述的裝置，其特征在于，所述激發(fā)波長(A》和吸收 波長(入2)之間的差小于所述熒光團試劑的所述吸收波長(A2)和發(fā)射波長(A3)之間的 差。
5. 根據權利要求1到4的任一項所述的裝置，其特征在于，其還包括用于觀察所述熒光 團試劑發(fā)射的光的窗口 (7;107)，所述窗口設有濾波器(6;106)，所述濾波器適于讓最長的 波長通過，且其截止波長位于所述吸收波長(入2)和所述發(fā)射波長(A3)之間。
6. 根據權利要求1到5的任一項所述的裝置，其特征在于，所述照明設備(3)包括至少 一個基座(21)，所述基座上安裝至少一組(27)光源(22)，該組(27)所述光源(22)彼此規(guī) 則間隔，以形成用于所述載體(41)的照明陣列。
7. 根據權利要求6所述的裝置，其特征在于，所述照明設備(3)包括兩個所述基座(21) ，所述基座向所述裝置中用于接收所述載體(41)的預定位置的方向相對于彼此傾斜。
8. 根據權利要求7所述的裝置，其特征在于，每個所述基座(21)相對于用于接收所述 載體(41)的所述預定位置傾斜40。和50°之間的角度(A)。
9. 根據權利要求6到8的任一項所述的裝置，其特征在于，所述光源為發(fā)光二極管(22) 。
10. 根據權利要求1到5的任一項所述的裝置，其特征在于，所述照明設備(203)包括 適于發(fā)射多色光的燈(204)和濾波器(234)，所述濾波器適于讓最小的波長通過，且其截止 波長(A。)位于所述吸收波長(入2)和所述發(fā)射波長(A 3)之間。
全文摘要
一種用于對適于包含被熒光團試劑標記的微生物的載體進行微生物分析的裝置，所述試劑適于以具有峰值(53′)處于預定吸收波長(λ2)的吸收譜(53)吸收光能并通過以峰值(54′)處于與所述吸收波長(λ2)不同的預定發(fā)射波長(λ3)的發(fā)射譜(54)發(fā)射熒光來釋放能量，所述裝置包括照明設備；來自照明設備的激發(fā)光的光譜(55)在預定激發(fā)波長(λ1)處具有峰值(55′)，激發(fā)波長(λ1)和吸收波長(λ2)之間具有預定的差，借助這一特征，能夠容易地將所述熒光團試劑發(fā)射的光與來自照明設備的光區(qū)分開。
文檔編號G01N21/64GK101712926SQ20091017329
公開日2010年5月26日 申請日期2009年9月22日 優(yōu)先權日2008年9月23日
發(fā)明者G·魏徹 申請人:米利波爾公司