專利名稱：一種熒光探針及其合成方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及化學(xué)分析，生物分析，臨床醫(yī)學(xué)檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種熒光探針及其
合成方法和用途。 乏氧是實(shí)體腫瘤的一個(gè)重要特征，許多研究表明，腫瘤的抗藥性與乏氧密切相關(guān)。 對(duì)腫瘤乏氧的研究具有非常重要的意義。 目前有許多體內(nèi)或體外檢測腫瘤乏氧組織的方法，如氧敏感微電極法、免疫組織 化學(xué)技術(shù)等，這些方法均為損傷性檢測方法。另外，一些無損檢測技術(shù)如磁共振(MRI)分子 顯像技術(shù)、PET分子顯像技術(shù)等，也被應(yīng)用于腫瘤乏氧的顯像研究，但其設(shè)備昂貴，且檢測效 果很大程度上受制于探針的開發(fā)，因此在基礎(chǔ)研究中的實(shí)際應(yīng)用受到限制。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù) 及不足，本發(fā)明提供了一種用于乏氧檢測的熒光探針，其檢測手段簡便，靈敏度高，適合于 配備熒光檢測儀器的常規(guī)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種熒光探針及其合成方法和用途。
熒光探針具有如下結(jié)構(gòu)式 熒光探針的合成方法包括如下步驟 i)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以二氯甲烷為溶劑，加入摩爾比為i : 2 io : i的丁二酸酐、
2，4-二甲基吡咯和三氟化硼乙醚，反應(yīng)12 24h ;在5 1(TC下依次滴加摩爾比為5 : 6 8的三乙胺和三氟化硼乙醚，，氮?dú)獗Ｗo(hù)下繼續(xù)反應(yīng)24 36h ;用飽和食鹽水洗2 3次，有 機(jī)相用無水Na2S04干燥，減壓蒸餾除去溶劑，用硅膠柱層析得到中間產(chǎn)物； 2)以二氯甲烷為溶齊U，加入摩爾比為i : i 2 : i 2 : o. i o.2的上述中
間產(chǎn)物、4-氨基-2， 2， 6， 6-四甲基哌啶-1-氧自由基、二環(huán)己基碳二亞胺和4- 二甲氨基吡 啶，反應(yīng)1 2h ;過濾，減壓蒸餾除去溶劑，用硅膠柱層析得到熒光探針。
熒光探針用于乏氧細(xì)胞的檢測分析。 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是1)熒光探針的合成簡便，原料易得，成本低廉；2)該熒光探針具 有非常高的檢測靈敏度，適合微量檢測，有良好的應(yīng)用前景；3)該探針適合熒光顯微鏡、流
背景技術(shù)：
式細(xì)胞儀、分光光度計(jì)、熒光酶標(biāo)儀等多種熒光檢測儀器。


圖1是探針被還原后的熒光變化情況，維生素C溶液用磷酸緩沖液PBS(pH7. 4)配 制，終濃度分別為0 ii M， 50 ii M， 100 ii M， 150 y M(從左至右)，加入探針，使其終濃度為5 y M。 反應(yīng)5分鐘后紫外光激發(fā)，拍設(shè)圖像； 圖2 (a)是細(xì)胞用氯化鈷(濃度50 y M)處理48h， PBS洗后，加入探針溶液(濃度 5 M) ， 15分鐘后在熒光顯微鏡下拍攝； 圖2 (b)是細(xì)胞用PBS處理48h，加入探針溶液(濃度5 ii M) ， 15分鐘后在熒光顯微 鏡下拍攝，作為對(duì)照組。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明的合成方程式
o' 實(shí)施例l i)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以二氯甲烷為溶劑，加入摩爾比為i : io : i的丁二酸酐
(10mmol)、2，4-二甲基妣咯(lOOmmol)、三氟化硼乙醚(lOmmol)，反應(yīng)24h ;在5 10。C下依 次滴加三乙胺(50mmol)、三氟化硼乙醚(80mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下繼續(xù)反應(yīng)36h ;用飽和食鹽水 洗3次，有機(jī)相用無水Na2S04干燥，減壓蒸餾除去溶劑，用硅膠柱層析得到中間產(chǎn)物0. 25g， 產(chǎn)率7. 8% ; 2)以二氯甲烷為溶齊U，加入摩爾比為i : 2 : 2 : o.2的上述中間產(chǎn)物
(0. 2mmol) 、4-氨基-2， 2， 6， 6-四甲基哌啶-1-氧自由基(0. 4mmo1) 、 二環(huán)己基碳二亞胺 (0. 4mmol)、4-二甲氨基吡啶(0. 04mmol)，反應(yīng)2h ;過濾，減壓蒸餾除去溶劑，用硅膠柱層析 得到熒光探針0. 020g，產(chǎn)率18.6%。
實(shí)施例2 i)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以二氯甲烷為溶劑，加入摩爾比為i : 2 : i的丁二酸酐
(10mmol)、2，4-二甲基妣咯(20mmol)、三氟化硼乙醚(lOmmol)，反應(yīng)12h ;在5 l(TC下依 次滴加三乙胺(50mmol)、三氟化硼乙醚(60mmol)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下繼續(xù)反應(yīng)24h ;用飽和食鹽水 洗2次，有機(jī)相用無水Na2S04干燥，減壓蒸餾除去溶劑，用硅膠柱層析得到中間產(chǎn)物0. 22g， 產(chǎn)率6. 8% ; 2)以二氯甲烷為溶齊U，加入摩爾比為i : i : i : o. i的上述中間產(chǎn)物(0. 2咖01)、4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-l-氧自由基(0. 2mmo1) 、 二環(huán)己基碳二亞胺 (0. 2mmo1) 、4-二甲氨基吡啶(0. 02mmo1)，反應(yīng)lh ;過濾，減壓蒸餾除去溶劑，用硅膠柱層析 得到熒光探針。最終得到中間產(chǎn)物0. 019g，產(chǎn)率18. 5% 。
實(shí)施例3 1)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以二氯甲烷為溶劑，加入摩爾比為1 : 2 : l的丁二酸酐、2， 4-二甲基吡咯、三氟化硼乙醚，反應(yīng)12h ;在5 1(TC下依次滴加三乙胺、三氟化硼乙醚，摩 爾比為5 : 6，氮?dú)獗Ｗo(hù)下繼續(xù)反應(yīng)24h;用飽和食鹽水洗2次，有機(jī)相用無水Na^04干燥， 減壓蒸餾除去溶劑，用硅膠柱層析得到中間產(chǎn)物； 2)以二氯甲烷為溶劑，加入摩爾比為i :i:i: o. i的上述中間產(chǎn)物、4-氨
基-2， 2， 6， 6-四甲基哌啶-1-氧自由基、二環(huán)己基碳二亞胺、4- 二甲氨基吡啶，反應(yīng)lh ;過
濾，減壓蒸餾除去溶劑，用硅膠柱層析得到熒光探針。
實(shí)施例4 i)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以二氯甲烷為溶劑，加入摩爾比為i : io : i的丁二酸酐、
吡咯、三氟化硼乙醚，反應(yīng)24h ;在5 1(TC下依次滴加三乙胺、三氟化硼乙醚，摩爾比為 5 : 8，氮?dú)獗Ｗo(hù)下繼續(xù)反應(yīng)36h;用飽和食鹽水洗3次，有機(jī)相用無水Na^(^干燥，減壓蒸 餾除去溶劑，用硅膠柱層析得到中間產(chǎn)物； 2)以二氯甲烷為溶劑，加入摩爾比為1 :2:2: O. 2的上述中間產(chǎn)物、4-氨 基-2， 2， 6， 6-四甲基哌啶-1-氧自由基、二環(huán)己基碳二亞胺、4- 二甲氨基吡啶，反應(yīng)2h ;過
濾，減壓蒸餾除去溶劑，用硅膠柱層析得到熒光探針。
實(shí)施例5 1)將丁二酸酐(10,1) 、2，4_ 二甲基妣咯(20,1) 、 BF3 0Et2(10,l)加入到 三頸燒瓶中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下注入100ml 二氯甲烷；攪拌反應(yīng)12小時(shí)后，在5 l(TC下依次小 心滴加三乙胺(50mmol)、三氟化硼乙醚(60mmo1)，氮?dú)獗Ｗo(hù)下繼續(xù)反應(yīng)36h ;反應(yīng)結(jié)束后， 反應(yīng)溶液用飽和食鹽水洗兩次(2X20mL)，有機(jī)相用無水硫酸鈉干燥，之后真空旋干有機(jī) 溶劑。得到的黑色油狀物用硅膠柱層析分離(洗脫劑選用石油醚乙酸乙酯=1:1)。 最終得到中間產(chǎn)物0. 32g，產(chǎn)率10%。 mp 190-192°C ,H NMR(400MHz， CDC13)6. 09 (s， 2H)， 3. 33 (t ， J = 8. 8Hz ， 2H) ， 2. 64 (t ， J = 8. 8Hz ， 2H) ， 2. 53 (s ， 6H) ， 2. 46 (s ， 6H) ; 13C NMR (100MHz ， CDC13) : S 173. 1， 154. 0， 144. 9， 141. 4， 131. 0， 122. 3，35. 3，23. 8， 16. 2， 14. 5 ;IR(film)v/ cm—1 :2913，1702，1549，1510，1475，1305，1199，1155，1076,974 ;MS(ESI) :m/z = 319.2; HRMS(ESI) :m/z calcd for (M-H) —319. 1435， found 319. 1433. 2)將上述中間產(chǎn)物(0.2mmol)、二環(huán)己基碳二亞胺(0. 2mmo1) 、4-二甲氨基吡 啶(0.02咖01)、4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-l-氧自由基溶解在干燥的二氯甲烷中 (10ml).室溫下攪拌反應(yīng)l小時(shí)。旋轉(zhuǎn)蒸干溶劑，硅膠柱層析分離，得最終產(chǎn)物21mg，產(chǎn)率 19%。 MS(ESI) :m/z = 475. 5
實(shí)施例6 探針被還原后的熒光變化情況。維生素C溶液用磷酸緩沖液PBS (pH7. 4)配制，終 濃度分別為0 ii M， 50 ii M， 100 ii M， 150 y M。加入探針，使其終濃度為5 y M。反應(yīng)5分鐘后紫 外光激發(fā)，拍設(shè)圖像。
實(shí)施例7
5
以氯化鈷處理的乏氧細(xì)胞模型為例，使用探針對(duì)乏氧細(xì)胞進(jìn)行成像。細(xì)胞用氯化 鈷(濃度50 M)處理24h， PBS洗后，加入探針溶液(濃度5 M) 。 15分鐘后在熒光顯微鏡 下拍攝。
權(quán)利要求
一種熒光探針，其特征在于該熒光探針具有如下結(jié)構(gòu)式F2009101571269C00011.tif
2. —種如權(quán)利要求1所述熒光探針的合成方法，其特征在于包括如下步驟1) 在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以二氯甲烷為溶劑，加入摩爾比為i : 2 io : l的丁二酸酐、2，4- 二甲基吡咯和三氟化硼乙醚，反應(yīng)12 24h ;在5 l(TC下依次滴加摩爾比為5 : 6 8的三乙胺和三氟化硼乙醚，，氮?dú)獗Ｗo(hù)下繼續(xù)反應(yīng)24 36h ;用飽和食鹽水洗2 3次，有 機(jī)相用無水Na2S04干燥，減壓蒸餾除去溶劑，用硅膠柱層析得到中間產(chǎn)物；2) 以二氯甲烷為溶齊U，加入摩爾比為i : i 2 : 1 2 : o. i o.2的上述中間產(chǎn)物、4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-l-氧自由基、二環(huán)己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶，反 應(yīng)1 2h ;過濾，減壓蒸餾除去溶劑，用硅膠柱層析得到熒光探針。
3. —種如權(quán)利要求1所述熒光探針的用途，其特征在于用于乏氧細(xì)胞的檢測分析。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于乏氧檢測的熒光探針及其合成方法和用途。合成方法包括如下步驟1)在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，以二氯甲烷為溶劑，加入摩爾比為1∶2～10∶1的丁二酸酐、2，4-二甲基吡咯、三氟化硼乙醚，反應(yīng)；依次滴加三乙胺、三氟化硼乙醚，摩爾比為5∶6～8，反應(yīng)；用飽和食鹽水洗，干燥，減壓蒸除溶劑，用硅膠柱層析得到中間產(chǎn)物；2)以二氯甲烷為溶劑，加入摩爾比為1∶1～2∶1～2∶0.1～0.2的上述中間產(chǎn)物、4-氨基-2，2，6，6-四甲基哌啶-1-氧自由基、二環(huán)己基碳二亞胺、4-二甲氨基吡啶，反應(yīng)；過濾，減壓蒸餾除去溶劑，用硅膠柱層析得到熒光探針。本發(fā)明的熒光探針的合成簡便，成本低廉，具有非常高的檢測靈敏度，在熒光分子成像領(lǐng)域有良好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N21/64GK101747355SQ20091015712
公開日2010年6月23日 申請(qǐng)日期2009年12月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月22日
發(fā)明者劉洋, 張宏, 王彥廣 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)