專利名稱：記動物體內(nèi)鈣庫的方法及其物的制備方法
技術領域：
本發(fā)明屬于加速器質(zhì)譜(簡稱AMS)技術領域，具體涉及動物體內(nèi)鈣庫標記方法，以及標記所用的示蹤劑的制備方法。
背景技術：
鈣是人體中的重要元素，它對于維持人體各系統(tǒng)的正常功能具有重要作用。鈣的缺乏會嚴重危害人們生活質(zhì)量。宏觀上會引起多種疾病如骨質(zhì)疏松癥(0P)、高血壓、冠心病、手足抽搐癥等。微觀上Ca2+還作為重要的細胞信使(第二信使)，廣泛參與細胞的各種生理功能。如神經(jīng)、肌肉應激、神經(jīng)沖動傳遞等生理過程中，還參與細胞膜的通透性及細胞興奮性的控制、細胞代謝、細胞形態(tài)的維持、細胞周期的調(diào)控以及生殖細胞的成熟和受精等。細胞內(nèi)自由Ca"的分布與轉(zhuǎn)移是形成C浐信號的基礎，準確測定細胞內(nèi)鈣離子的濃度[Ca21及其變化規(guī)律具有非常重要的生物學意義。
迄今己有多種分析技術可用于細胞鈣離子的測定。如原子吸收分光光度法、焦銻酸鉀沉淀法和電子分光成像技術、電子探針X線微區(qū)分析法、膜片鉗技術、熒光法，其中熒光法具有實時觀測細胞內(nèi)鈣離子濃度動態(tài)變化的能力，已成為細胞鈣離子研究最常用的技術手段。但這些方法的最大缺陷是無法區(qū)分內(nèi)鈣和外鈣。
在研究鈣離子在細胞內(nèi)外的流向方面，鈣同位素示蹤法可以發(fā)揮獨特作用，該方法不像熒光法那樣需要將外鈣內(nèi)流和內(nèi)鈣釋放兩個過程分開研究。通常采用45Ca作為細胞實驗的示蹤核，方法可為攝取法或釋放法。攝取法主要是將正常組織或細胞放在含，a示蹤劑的緩沖液或培養(yǎng)基中，加入藥物或毒理刺激， 一定時間后檢測特定部位的45Ca含量。45Ca釋放法是將組織或細胞培養(yǎng)預培養(yǎng)在含45Ca示蹤劑的培養(yǎng)液中，培養(yǎng)一段時間，使45Ca在組織或細胞中達到一定的比例，然后用藥物刺激，測定，a釋放到緩沖體系的量以及組織或細胞中45Ca的剩余含
3量。對45Ca的測量一般采用液閃記數(shù)法和放射自顯影法。但"Ca是放射性核素，半衰期短，衰變時發(fā)射電子和Y射線，對生物體的細胞有一定損傷效應，也不易被實驗工作者接受。
另外，"Ca是一種長壽命半衰期為1.0xl0s年的長壽命放射性核素，自然界中"Ca的含量非常底。為了得到"Ca, —般通過核反應的方法制備，即利用反應堆照射"Ca、 "Ca、 46Ca、 "Ca得到，所得產(chǎn)品需要長時間冷卻才能使用。

發(fā)明內(nèi)容
(一) 發(fā)明目的
本發(fā)明針對現(xiàn)有技術所存在的缺陷，提供一種既能區(qū)分內(nèi)鈣和外鈣，同時對生物體細胞損傷較小的標記動物體內(nèi)鈣庫的方法，以及所用示蹤劑鈣-41的制備方法。
(二) 技術方案
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下技術方案。
一種標記動物體內(nèi)鈣庫方法，是將放射性示蹤劑通過肌肉注射或口服等方式注入動物體內(nèi)，達到平衡后，再服用補鈣制劑，代謝、收集待測樣品，測量樣品中示蹤劑量及總鈣重量，計算出補鈣制劑的凈鈣吸收率。關鍵在于，所用的示蹤劑是鈣-41，示蹤劑的測量采用AMS法。
用鈣-41作為示蹤跡劑時，其用量為每公斤動物體小于或等于60 ng "Ca。所述的鈣-41的制備方法是，利用反應堆照射4flCa豐度大于99%的4°CaC03,通過40Ca(n，Y)"Ca反應制得。
另外，為滿足AMS測定需要，對堆照后的CaC03進行逐級稀釋，制備成一系列"Ca標準樣品。具體步驟如下
① 在經(jīng)堆照后的標準"Ca樣品中加入精確定量的穩(wěn)定同位素Ca，首先用HC1將標準物質(zhì)(41CaC03)和穩(wěn)定CaC03溶解，混合，使之生成CaCl2溶液。
② 將過量的NaC03用水溶解，攪拌后倒入CaCl2溶液中，充分攪拌均勻，產(chǎn)生白色CaC03沉淀。
③ 將沉淀離心，棄去上清液，用水洗沉淀液，直至用少量AgN03溶液滴入洗滌液中無白色沉淀產(chǎn)生，此時表明洗滌液中已無cr離子。
④ 將沉淀過濾于定量濾紙上，在烘箱內(nèi)下烘干至恒重。稱重后，按所稱重量與理論計算重量之比計算產(chǎn)額。將烘干的CaC03粉末裝入塑料瓶中備用。通過以上過程，得到了 "Ca/Ca在10—"的系列標準樣品，用于"Ca的AMS測量方法的建立。(三)發(fā)明效果
"Ca是Ca的放射性同位素中的一種，其衰變方式為軌道電子俘獲，半衰期為L0xl05,據(jù)推算用于41Ca示蹤實驗所產(chǎn)生的放射性劑量遠底于環(huán)境當中的放射性計量，因此不用擔心生物輻射損傷和安全問題，由于其半衰期非常長，適于長期示蹤實驗，另外4'Ca在自然界中的含量非常低可以忽略不計，因此"Ca是非常理想的生物醫(yī)學示蹤劑。AMS方法因為具有排除同量異位素本底和分子本底干擾的能力，具有極高的測量靈敏度，所以成為測量"Ca的理想方法。"Ca-AMS技術的不斷發(fā)展為了解"Ca在生物體內(nèi)的吸收代謝以及Ca"離子在細胞內(nèi)的運動提供了一種有力手段。另外，用高純度的"Ca，通過"Ca(n,丫rCa反應制得"Ca，使用前所需的冷卻時間較短，方便使用。
具體實施例方式
下面結合附圖，對本發(fā)明的技術方案作進一步解釋。
"Ca是一種半衰期為1.0xl05年的長壽命放射性核素，自然界中4'Ca的含量非常底。為了得到"Ca，本發(fā)明通過核反應的方法制備，即利用反應堆照射4°Ca通過，a(n， "/)"Ca反應得到。具體方法是:取高純的4aCaC03(4flCa的豐度大于99%,本實施例豐度為99.7%) lg裝入石英瓶。在重水反應堆上照射約988小時，熱中子通量大約為4.9X10'3。 ，a的熱中子(n,Y)截面為0.41b，經(jīng)估算"Ca/Ca的比值大約在7x10—5左右。照射后的比活度約為2.22X105Bq。經(jīng)放置冷卻后，利用熱電離質(zhì)譜(T頂S)對樣品中"Ca/Ca的比值進行了精確測定，測量值為4'CarCa=(4.19±0.04) X1(T。
如

圖1所示，為滿足加速器質(zhì)譜測定需要，對堆照后的CaC03進行逐級稀釋，制備了一系列"Ca標準樣品。具體步驟如下
① 在經(jīng)堆照后的標準41Ca樣品中加入精確定量的穩(wěn)定同位素Ca，首先用1.8 2.2 Mol/L的HCl將標準物質(zhì)("CaC03)和穩(wěn)定CaC03溶解，混合，使之生成CaCl2溶液。
② 將過量的NaCOa用水溶解，攪拌后倒入CaCl2溶液中，充分攪拌均勻，產(chǎn)生白色CaC03沉淀。
③ 將沉淀離心，棄去上清液，用水洗沉淀液，直至用少量AgN03溶液滴入洗
滌液中無白色沉淀產(chǎn)生，此時表明洗滌液中已無cr離子。
④ 將沉淀過濾于定量濾紙上，在烘箱內(nèi)IOO'C下烘干至恒重。稱重后，按所稱重量與理論計算重量之比計算產(chǎn)額。將烘干的CaC03粉末裝入塑料瓶中備用。
利用"Ca標記雌性3月齡Wistar大鼠體內(nèi)鈣庫的方法如下。雌性3月齡Wistar大鼠，在動物房適應lw后，背側行雙側卵巢切除術，共20只，另設10只假手術對照組大鼠，僅切除卵巢周圍相同大小脂肪團。術后，將大鼠隨機分籠并給予常規(guī)詞料喂養(yǎng)，自由飲水。檢測動情周期lw，檢驗去勢手術成功與否。真手術組大鼠處于動情間期，假手術組大鼠則表現(xiàn)出規(guī)律的動情周期。術后90d每組各處死10只，分別進行股骨力學、骨密度等檢測。結果提示真手術組大鼠體重明顯增加，骨密度降低、股骨三點彎曲試驗脆性增加等骨質(zhì)疏松表現(xiàn)。骨質(zhì)疏松模型建立成功后，即術后90d左大腿內(nèi)側肌肉注射"CaCl2，"Ca的用量為每公斤動物體小于或等于60 ng "Ca。優(yōu)選范圍為40~50 ng "Ca，本實驗使用59.48 ng "Ca 。 250 u 1 "CaCl2貯備液(含1.416 mg Ca, 59.48 ng"Ca)，補鈳制劑灌胃為0.66g/kgbw (碳酸鈣元素鈣含量為304,31mg/g，灌胃共70mg元素鈣)，連續(xù)灌胃30d，同時改喂低鈣飼料，處死前24h進行代謝實驗，收集糞、尿和血漿，記錄食量。
化學提取糞、血漿中的鈣，制備成CaF2樣品。AMS測糞和血漿中的"Ca,Ca的峰度比值，再平行樣品測定糞中的總鈣重量(原子吸收法)。就可以計算出補鈣制劑的凈鈣吸收率。初步測量了某種市售鈣劑的凈吸收率為69 % (表1)。與目前常用的鈣平衡法和尿鈣法等相比，"Ca標記題給鈣庫與鈣平衡法結合，避免了鈣平衡法的不足且排除內(nèi)源性鈣的干擾，能夠較為精確的得到凈鈣吸收率；與雙同位素法相比，該法不受待檢測化合物中鈣的化學形式的限制，可以檢測單一成份，也可以檢測多種鈣成份。這是一種簡單、有效、準確的方法，只標記體內(nèi)鈣庫就可以得到各種不同鈣制劑的吸收率。這就為各種補鈣制劑和骨質(zhì)疏松治療藥物的評價提供了一種更為準確的方法。表l.利用AMS和FMS湖!l量的Ca和41Ca的結果以及計算得到的Ca的吸收率攝入Ca (mg)排泄Ca (mg)糞中"Ca/，a血漿中"Ca/，a (xl(T8)觀吸收率 (%)凈鈣吸收率 (%)
77. 25±1.9831. 56±4. 27(6. 24±0.21)(2, 54±0. 05)59. 1569. 18
顯然，本領域的技術人員可以對本發(fā)明進行各種改動和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，假若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權利要求及其等同技術的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動和變型在內(nèi)。
權利要求
1. 一種標記動物體內(nèi)鈣庫方法，是將放射性示蹤劑通過肌肉注射或口服等方式注入動物體內(nèi)，達到平衡后，再服用補鈣制劑，代謝、收集待測樣品，測量樣品中示蹤劑量及總鈣重量，計算出補鈣制劑的凈鈣吸收率，其特征在于所用的示蹤劑是鈣-41，示蹤劑的測量采用AMS法。
2. 根據(jù)權利要求1所述的標記動物體內(nèi)鈣庫方法，其特征在于用鈣-41 作為示蹤跡劑時，"Ca的用量為每公斤動物體小于或等于60 ng "Ca。
3. 制備權利要求1所示的鈣-41的方法是，其特征在于利用反應堆照射 4°Ca豐度大于99%的4flCaC03，通過4°Ca(n, Y)"Ca反應制得。
全文摘要
本發(fā)明屬于AMS技術領域，它公開了一種動物體內(nèi)鈣庫標記方法，以及標記所用的示蹤劑的制備方法。該方法所用的示蹤劑是鈣-41，示蹤劑的測量采用AMS法。鈣-41的制備方法是利用反應堆照射⁴⁰Ca豐度大于99％的⁴⁰CaCO₃，通過⁴⁰Ca(n，γ)⁴¹Ca反應制得。⁴¹Ca-AMS技術為了解⁴¹Ca在生物體內(nèi)的吸收代謝以及Ca²⁺離子在細胞內(nèi)的運動提供了一種有力手段。
文檔編號G01N21/31GK101504361SQ20091011950
公開日2009年8月12日 申請日期2009年3月12日 優(yōu)先權日2009年3月12日
發(fā)明者明 何, 山 姜, 米生權, 董克軍, 趙曉紅 申請人:中國原子能科學研究院