專利名稱：一種利用分子印跡免疫傳感器測定微量土霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種利用分子印跡技術(shù)與免疫技術(shù)聯(lián)用的電化學(xué)免疫傳感器快速測
定微量土霉素的方法。
背景技術(shù)：
土霉素為四環(huán)素類抗生素類藥，是生產(chǎn)和臨床應(yīng)用最久的抗生素之一，其化學(xué)結(jié)構(gòu)屬氫化并四苯環(huán)衍生物，口服吸收良好，在體內(nèi)分布廣泛，可在肝組織中富集，造成肝損傷。土霉素常被添加到動(dòng)物飼料中，以促進(jìn)動(dòng)物的生長以及防治各種疾病，如果不能嚴(yán)格控制停藥期，很容易造成在動(dòng)物肉和組織中殘留，給人體健康帶來危害，因此世界各國對畜禽肉中的四環(huán)素族殘留都有嚴(yán)格的限量要求，因此研究對土霉素具有高選擇性的檢測方法很有意義。分子印跡是近年來發(fā)展起來的一種對印跡分子具有選擇性的聚合物合成方法。已報(bào)道的印跡傳感器用于莠去津、敵草凈、草甘膦、對硫磷、氯霉素等十幾種農(nóng)藥的檢測，但利用免疫技術(shù)與分子印跡結(jié)合的土霉素分子印跡免疫傳感器檢測微量土霉素的研究未見報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種利用分子印跡技術(shù)與免疫技術(shù)聯(lián)用的電化學(xué)免疫傳感器快速測定微量土霉素的方法。 構(gòu)思如下我們發(fā)現(xiàn)對苯二酚可以作為離子探針，當(dāng)土霉素分子印跡膜在金電極表面形成、和土霉素分子作用的時(shí)候，它在金電極上的電化學(xué)信號(hào)發(fā)生變化，當(dāng)檢測體系里面存在雙氧水的和辣根過氧化酶的時(shí)候，電化學(xué)信號(hào)變化更加顯著。利用待測溶液中的土霉素競爭取代分子印跡膜上原有的辣根過氧化酶標(biāo)記的土霉素的時(shí)候，電化學(xué)信號(hào)會(huì)隨著未標(biāo)記的土霉素濃度增加而線性減小，故可以用來檢測土霉素的含量。 本發(fā)明涉及分子印跡技術(shù)免疫酶標(biāo)增敏技術(shù)。當(dāng)待測分子土霉素與土霉素分子印跡膜上辣根過氧化酶標(biāo)記的土霉素發(fā)生競爭取代時(shí)，對苯二酚金電極上的電化學(xué)信號(hào)發(fā)生變化，峰電流與待測土霉素的濃度在0mol/L 8X 10—8mol/L范圍內(nèi)呈線性關(guān)系。
具體步驟為
—、金電極的處理 將金電極依次用1.0iim、0. 3iim和0.05iim的氧化鋁粉拋光，依次在體積比為1 : 1的硝酸、無水乙醇和純水泡洗，取出后超聲洗滌5min ;
二、土霉素分子印跡免疫傳感器的制備 分別量取0. 5mL 2X 10—4mol/L 8X 10—4mol/L的鄰苯二酚和2. 5mL 8X 10—5mol/L 3. 5X 10—4mol/L的土霉素溶液加入到7mL pH = 5. 2濃度為0. lmol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，充分?jǐn)嚢杌靹蚝笤?到0. 8V之間以50mV/s的速度用循環(huán)伏安法連續(xù)掃描30到60圈，即可制得土霉素分子印跡免疫傳感器；
三、檢測方法
3
取15mL小燒杯，加入10mL 0. lmol/L含有3 X 10—6mol/L 8 X 10—6mol/L對苯二酚 的磷酸鹽緩沖溶液；將已在辣根過氧化酶標(biāo)記土霉素溶液中充分吸附后的土霉素分子印跡 免疫傳感器浸入10mL IX 10—5mol/L 3X 10—3mol/L的土霉素溶液中競爭吸附3到10分 鐘，接入檢測體系，滴加20ii L 5X 10—4mol/L 3X 10—3mol/L的雙氧水；用電化學(xué)工作站中 的差分脈沖伏安法對待測液進(jìn)行掃描，掃描電壓-0. 6V到0. 8V ;
四、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制 取15mL小燒杯，加入10mL 0. lmol/L含有3X 10—6mol/L 到8X 10—6mol/L對苯 二酚的磷酸鹽緩沖溶液；將已在辣根過氧化酶標(biāo)記土霉素溶液中充分吸附后的土霉素分子 印跡免疫傳感器逐次浸入10mL 1 X 10—5mol/L 3X 10—3mol/L 土霉素溶液中競爭吸附3到 10分鐘，滴加20 ii L 5X 10—4mol/L 3X 10—3mol/L的雙氧水，差分脈沖伏安法掃描，掃描電 壓-0. 6V到0. 8V ;土霉素在Omol/L 8X 10—8mol/L濃度范圍內(nèi)與峰電流值i呈良好的線 性關(guān)系，線性方程:i = 24. 07921-2. 27396XC，相關(guān)系數(shù)R為0. 99973 ;
五、待測土霉素含量的測定 取15mL小燒杯，加入10mL 0. lmol/L含有3X 10—6mol/L 到8X 10—6mol/L對苯 二酚的磷酸鹽緩沖溶液；將已在辣根過氧化酶標(biāo)記土霉素溶液中充分吸附后的土霉素分子 印跡免疫傳感器逐次浸入10mL 1 X 10—5mol/L 3X 10—3mol/L 土霉素溶液中競爭吸附3到 10分鐘，滴加20 ii L 5X 10—4mol/L 3X 10—3mol/L的雙氧水，差分脈沖伏安法掃描，掃描電 壓-0. 6V到0. 8V ;讀出峰電流值i ;根據(jù)校正曲線計(jì)算出C ;即可知此lOmL待測溶液中所含 土霉素的量。 本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)存在過于復(fù)雜等諸多缺點(diǎn)，靈敏度高，對于濃度10—8mol/L 以上的土霉素的檢測易于自動(dòng)化。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例金電極上土霉素分子印跡膜在5X 10—^01/L鐵氰化鉀溶液中 的循環(huán)伏安圖。
圖中標(biāo)記a-裸金電極的循環(huán)伏安圖；b-聚合后未洗脫的分子印跡免疫傳感器的
循環(huán)伏安圖；c-洗脫后的分子印跡免疫傳感器的循環(huán)伏安圖。 圖2為本發(fā)明實(shí)施例土霉素含量與差分脈沖伏安法峰電流的關(guān)系圖。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例 —、金電極的處理 將金電極依次用1.0iim、0. 3iim和0.05iim的氧化鋁粉拋光，依次在體積比為 1 : 1的硝酸、無水乙醇、純水泡洗，取出后超聲洗滌5min。
二、土霉素分子印跡免疫傳感器的制備 分別量取0. 5mL 7X 10—4mol/L的鄰苯二酚、2. 5mL 3X 10—4mol/L的土霉素溶液和 7mL pH = 5. 2濃度為0. lmol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液，充分?jǐn)嚢杌靹蚝笤?到0. 8V之 間以50mV/s的速度用循環(huán)伏安法連續(xù)掃描30圈，即可制得土霉素分子印跡免疫傳感器。
三、檢測方法
取15mL小燒杯，加入10mL 0. lmol/L含5X 10—4mol/L對苯二酚的磷酸鹽緩沖 溶液。將已在辣根過氧化酶標(biāo)記土霉素溶液中充分吸附后的土霉素分子印跡免疫傳感 器浸入10mL 3X10—5mol/L的土霉素溶液中競爭吸附5分鐘，接入檢測體系，滴加20 y L IX 10—3mol/L的雙氧水。選用CHI660型電化學(xué)工作站中的差分脈沖伏安法對待測液進(jìn)行 掃描，掃描電壓-0. 6V到0. 8V。
四、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制 取15mL小燒杯，加入10mL 0. lmol/L含5 X 10—4mol/L對苯二酚的磷酸鹽緩 沖溶液。將已在辣根過氧化酶標(biāo)記土霉素溶液中充分吸附后的土霉素分子印跡免疫 傳感器逐次浸入10mL 3X10—Smol/L土霉素溶液中競爭吸附5分鐘，接入檢測體系，滴 加20iiL 1X10—3mol/L的雙氧水。選用CHI660型電化學(xué)工作站中的差分脈沖伏安法 對待測液進(jìn)行掃描，掃描電壓-0. 6V到0. 8V。 土霉素含量與峰電流關(guān)系如圖2， 土霉素 在0mol/L 8X 10—8mol/L濃度范圍內(nèi)與峰電流值i呈良好的線性關(guān)系，線性方程i = 24. 07921-2. 27396 XC，相關(guān)系數(shù)R為0. 99973。
五、樣品中土霉素含量的測定 取牛奶樣品進(jìn)行了測定，但是未檢出土霉素，故采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí) 驗(yàn)。取15mL小燒杯，加入10mL 0. lmol/L含5X 10—4mol/L對苯二酚的磷酸鹽緩沖溶液。將 已在辣根過氧化酶標(biāo)記土霉素溶液中充分吸附后的土霉素分子印跡免疫傳感器浸入10mL 土霉素溶液中競爭吸附5分鐘，接入檢測體系，滴加20iiL 1X10—3mol/L的雙氧水。選用 CHI660型電化學(xué)工作站中的差分脈沖伏安法對待測液進(jìn)行掃描，掃描電壓-0. 6V到0. 8V。 讀出峰電流值i。根據(jù)校正曲線計(jì)算出C。平行測定三次，計(jì)算回收率，結(jié)果如表l所示。
表1加標(biāo)回收試驗(yàn)數(shù)據(jù)
樣'
測得量 mol/X
加入土霉素
mol/L
測出土霉素總量 mol/L
回收率
1
2
3
未檢出 未才企出 未氺全出
3. 00 x 10—8 5. 00 x 10-8 7. 00 x 10—8
3. 04 x 10—
4. 93 x 10— 7. 16 x 10—
101. 3 98. 6
102. 權(quán)利要求
一種利用分子印跡免疫傳感器測定微量土霉素的方法，其特征在于具體步驟為一、金電極的處理將金電極依次用1.0μm、0.3μm和0.05μm的氧化鋁粉拋光，依次在體積比為1∶1的硝酸、無水乙醇和純水泡洗，取出后超聲洗滌5min；二、土霉素分子印跡免疫傳感器的制備分別量取0.5mL 2×10-4mol/L～8×10-4mol/L的鄰苯二酚和2.5mL 8×10-5mol/L～3.5×10-4mol/L的土霉素溶液加入到7mL pH＝5.2濃度為0.1mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中，充分?jǐn)嚢杌靹蚝笤?到0.8V之間以50mV/s的速度用循環(huán)伏安法連續(xù)掃描30到60圈，即可制得土霉素分子印跡免疫傳感器；三、檢測方法取15mL小燒杯，加入10mL 0.1mol/L含有3×10-6mo l/L～8×10-6mol/L對苯二酚的磷酸鹽緩沖溶液；將已在辣根過氧化酶標(biāo)記土霉素溶液中充分吸附后的土霉素分子印跡免疫傳感器浸入10mL1×10-5mol/L～3×10-3mol/L的土霉素溶液中競爭吸附3到10分鐘，接入檢測體系，滴加20μL 5×10-4mol/L～3×10-3mol/L的雙氧水；用電化學(xué)工作站中的差分脈沖伏安法對待測液進(jìn)行掃描，掃描電壓-0.6V到0.8V；四、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制取15mL小燒杯，加入10mL 0.1mol/L含有3×10-6mol/L～到8×10-6mol/L對苯二酚的磷酸鹽緩沖溶液；將已在辣根過氧化酶標(biāo)記土霉素溶液中充分吸附后的土霉素分子印跡免疫傳感器逐次浸入10mL 1×10-5mol/L～3×10-3mol/L土霉素溶液中競爭吸附3到10分鐘，滴加20μL 5×10-4mol/L～3×10-3mol/L的雙氧水，差分脈沖伏安法掃描，掃描電壓-0.6V到0.8V；土霉素在0mol/L～8×10-8mol/L濃度范圍內(nèi)與峰電流值i呈良好的線性關(guān)系，線性方程i＝24.07921-2.27396×C，相關(guān)系數(shù)R為0.99973；五、待測土霉素含量的測定取15mL小燒杯，加入10mL 0.1mol/L含有3×10-6mol/L～到8×10-6mol/L對苯二酚的磷酸鹽緩沖溶液；將已在辣根過氧化酶標(biāo)記土霉素溶液中充分吸附后的土霉素分子印跡免疫傳感器逐次浸入10mL 1×10-5mol/L～3×10-3mol/L土霉素溶液中競爭吸附3到10分鐘，滴加20μL 5×10-4mol/L～3×10-3mol/L的雙氧水，差分脈沖伏安法掃描，掃描電壓-0.6V到0.8V；讀出峰電流值i；根據(jù)校正曲線計(jì)算出C；即可知此10mL待測溶液中所含土霉素的量。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用分子印跡免疫傳感器測定微量土霉素的方法。當(dāng)土霉素分子印跡膜在金電極表面形成、和土霉素分子作用的時(shí)候，對苯二酚在金電極上的電化學(xué)信號(hào)發(fā)生變化，當(dāng)檢測體系里面存在雙氧水的和辣根過氧化酶的時(shí)候，電化學(xué)信號(hào)變化更加顯著。利用待測溶液中的土霉素競爭取代分子印跡膜上原有的辣根過氧化酶標(biāo)記的土霉素的時(shí)候，電化學(xué)信號(hào)會(huì)隨著未標(biāo)記的土霉素濃度增加而線性減小，據(jù)此建立了一種測定痕量土霉素的電化學(xué)分析方法。差分脈沖伏安法法對待測液進(jìn)行掃描，掃描電壓-0.6V到0.8V，土霉素在0mol/L～8×10-8mol/L濃度范圍內(nèi)與峰電流值i呈良好的線性關(guān)系。本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)存在過于復(fù)雜等諸多缺點(diǎn)，土霉素的檢測限達(dá)到10-9mol/L。
文檔編號(hào)G01N27/27GK101710116SQ20091011454
公開日2010年5月19日 申請日期2009年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日
發(fā)明者李建平, 蔣復(fù)陽, 魏小平 申請人:桂林理工大學(xué)