專利名稱：：一種利用電荷識(shí)別效應(yīng)測(cè)定多巴胺的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種利用電荷識(shí)別效應(yīng)測(cè)定多巴胺的方法，可用于人體血清樣品中多巴胺的測(cè)定。
背景技術(shù)：
：多巴胺(3，4-二羥基-P-苯乙胺，DA)是一種非常重要的神經(jīng)遞質(zhì)，且與帕金森病、亨丁頓舞蹈癥和多動(dòng)癥等病癥息息相關(guān)。目前，測(cè)量DA濃度的方法有很多，電化學(xué)方法因靈敏度高、選擇性好而廣泛應(yīng)用，尤其是電化學(xué)型生物傳感器能夠進(jìn)行活體分析，這一優(yōu)點(diǎn)是其他方法無(wú)法比擬的。金剛石電極、玻碳電極、鉑電極和金電極等裸電極都可以用來(lái)測(cè)DA，但抗壞血酸(AA)和尿酸(UA)因?yàn)檠趸€原電位與DA相近，從而干擾最終測(cè)定結(jié)果。為了解決這個(gè)問題，人們做出了很多努力，例如離子交換膜、離子液體-凝膠膜、聚合膜和自組裝膜等。離子交換膜中最典型的膜就是Nafion膜，但Nafion膜有常見的幾個(gè)缺點(diǎn)膜厚度不均一、重現(xiàn)性差、響應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)、價(jià)格昂貴，而自組裝能夠克服Nafion膜的這些缺點(diǎn)。二亞乙基三胺五乙酸(DTPA)是一個(gè)由五個(gè)羧基(pKa(電離平衡常數(shù))1.9，2.9，4.4，8.7，10.5)修飾二乙三胺的無(wú)機(jī)螯合物。目前還沒有文獻(xiàn)報(bào)道利用DTPA螯合物的靜電識(shí)別來(lái)測(cè)定DA。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供一種靈敏度高、選擇性好可以對(duì)人血清樣品中的多巴胺進(jìn)行測(cè)定的方法。構(gòu)思如下多巴胺在電極上明顯的氧化還原峰，但是與多巴胺一同存在于血液中的抗壞血酸也有明顯的氧化還原峰，且峰電位與多巴胺的峰電位相近。通過(guò)二亞乙基三胺五乙酸的電荷識(shí)別作用，多巴胺在電極上有響應(yīng)，而抗壞血酸和尿酸則幾乎沒有響應(yīng)，從而達(dá)到消除干擾的目的。其基本原理是在pH為7.4的磷酸緩沖溶液中，二亞乙基三胺五乙酸有五個(gè)羧基(pKa1.9，2.9，4.4，8.7,10.5)，易帶負(fù)電荷；多巴胺(pKa=8.87)易帶正電荷；而AA(pKa=4.1)易帶負(fù)電荷。根據(jù)電荷識(shí)別效應(yīng)，帶負(fù)電荷的二亞乙基三胺五乙酸吸引正電荷的多巴胺而排斥帶負(fù)電荷抗壞血酸，從而消除了抗壞血酸的干擾。具體步驟如下—、金電極的處理將金電極用氧化鋁粉拋光，依次在硝酸(體積比為1:1)、無(wú)水乙醇和純水泡洗，取出后超聲洗滌5min，即得到干凈的裸金電極。二、修飾電極的制備首先將金電極放入10-15mL含0.01mol/L半胱氨酸的0.lmol/L的HC1溶液中6h，即制得半胱氨酸修飾電極。然后電極再次在10-151^含有0.0211101/11-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和0.04mol/LN-羥基琥珀酰亞胺的0.05mol/L二亞乙基三3胺五乙酸的混合溶液中浸泡5h，即制得二亞乙基三胺五乙酸/半胱氨酸/金修飾電極。三、干擾實(shí)驗(yàn)相對(duì)于5X10—6mol/L的多巴胺、5X10—5mol/L的抗壞血酸和5X10—5mol/L尿酸分別使多巴胺的峰電流增大了0.2%和1.2%，表明5X10—5mol/L的抗壞血酸和5X10—5mol/L尿酸對(duì)5X10—6mol/L的多巴胺無(wú)明顯干擾，充分表明三胺五乙酸/半胱氨酸膜有良好的選擇性。四、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制取20mL小燒杯，加入含0.lmol/LKC1的0.2mol/L磷酸緩沖溶液10mL，逐次加入25iiL5.0X10—5、5.0X10—6mol/L多巴胺溶液，根據(jù)多巴胺濃度c與峰電流i寫出線性方程為i(iiA)=-3.8575c-0.8750X10—2，相關(guān)系數(shù)R為0.9971。五、人體血清樣品中多巴胺含量的測(cè)定將0.5mL除掉人血清白蛋白(HAS)后的血樣加入到4.5mL0.2mol/L的磷酸緩沖溶液中，用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)人血清樣品中多巴胺的濃度，并測(cè)量加標(biāo)回收率。本發(fā)明能夠用來(lái)測(cè)量血清中多巴胺的濃度，且制作簡(jiǎn)單，使用方便。圖1為本發(fā)明實(shí)施例修飾電極的安培i-t曲線，施加電位0.18V，磁力攪拌下連續(xù)加入5.0X10—5mol/L尿酸、5.0X10—5mol/L抗壞血酸禾口5.0X10—6mol/L多巴胺。圖2為本發(fā)明實(shí)施例修飾電極的安培i-t曲線，施加電位0.18V，磁力攪拌下連續(xù)加入5.0X10—5和5.0X10—6mol/L多巴胺。具體實(shí)施方式實(shí)施例將金電極依次用1.0iim、0.3iim禾P0.05iim的氧化鋁粉拋光，依次在硝酸(體積比為1:1)、無(wú)水乙醇和純水泡洗，取出后超聲洗滌5min。將裸金電極放入含O.01mol/L半胱氨酸的0.lmol/L的10mL的HC1溶液中6h，即制得半胱氨酸修飾電極。此裸金電極如果表面有其他雜質(zhì)，則半胱氨酸很難修飾至電極上。然后再將制得的半胱氨酸修飾電極在含有0.02mol/L1-乙基_(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和0.04mol/LN-羥基琥珀酰亞胺的O.05mol/L二亞乙基三胺五乙酸的10mL混合溶液中浸泡5h，即制得二亞乙基三胺五乙酸/半胱氨酸/金修飾電極。取20mL小燒杯，加入含0.lmol/LKC1的0.2mol/L磷酸緩沖溶液10mL，攪拌的情況下，逐次加入25iiL5.0X10—5、5.0X10—Smol/L多巴胺溶液，多巴胺濃度與峰電流的安培i-t曲線如圖2，在1.0X10—7-6.0X10—3mol/L范圍內(nèi)，多巴胺濃度與氧化峰電流之間的線性方程為i(iiA)=-3.8575c-0.8750X10—2，相關(guān)系數(shù)R為0.9971，檢出限(S/N=3)為3.0X10—8mol/L。用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)量人血清樣品中多巴胺的濃度，為了避免人血清白蛋白的干擾，將0.2克的三氯乙酸加入到lmL血樣中，在3000r/min的轉(zhuǎn)速下離心10min，除掉沉淀的蛋白質(zhì)，再取0.5mL清液轉(zhuǎn)至4.5mL0.2mol/L磷酸緩沖溶液中，利用伏安法對(duì)待測(cè)液進(jìn)行測(cè)量，掃描電壓-O.1V到0.6V。讀出峰電流值i。用i(iiA)=-3.8575C-0.8750X10—2計(jì)算出C。即可知此血樣中中所含多巴胺的量。lmin后，加入5.0X10—Smol/L多巴胺，測(cè)回收率。結(jié)果見表1。測(cè)定結(jié)果的回收率在99.6-100.8%之間，表明此方法可以用來(lái)準(zhǔn)確測(cè)量血清中多巴胺的含量。表l.人血清樣品中多巴胺的含量和回收率<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>權(quán)利要求一種利用電荷識(shí)別效應(yīng)測(cè)定多巴胺的方法，其特征在于具體步驟如下一、金電極的處理將金電極用氧化鋁粉拋光，依次在體積比為1∶1的硝酸、無(wú)水乙醇和純水泡洗，取出后超聲洗滌5min，即得到干凈的裸金電極；二、修飾電極的制備首先將金電極放入10-15mL含0.01mol/L半胱氨酸的0.1mol/L的HCl溶液中6h，即制得半胱氨酸修飾電極；然后電極再次在10-15mL含有0.02mol/L1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和0.04mol/LN-羥基琥珀酰亞胺的0.05mol/L二亞乙基三胺五乙酸的混合溶液中浸泡5h，即制得二亞乙基三胺五乙酸/半胱氨酸/金修飾電極；三、干擾實(shí)驗(yàn)相對(duì)于5×10-6mol/L的多巴胺、5×10-5mol/L的抗壞血酸和5×10-5mol/L尿酸分別使多巴胺的峰電流增大了0.2％和1.2％，表明5×10-5mol/L的抗壞血酸和5×10-5mol/L尿酸對(duì)5×10-6mol/L的多巴胺無(wú)明顯干擾，表明三胺五乙酸/半胱氨酸膜有良好的選擇性；四、標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制取20mL小燒杯，加入含0.1mol/LKCl的0.2mol/L磷酸緩沖溶液10mL，逐次加入25μL5.0×10-5、5.0×10-6mol/L多巴胺溶液，根據(jù)多巴胺濃度c與峰電流i寫出線性方程為i(μA)＝-3.8575c-0.8750×10-2，相關(guān)系數(shù)R為0.9971；五、人體血清樣品中多巴胺含量的測(cè)定將0.5mL除掉人血清白蛋白后的血樣加入到4.5mL0.2mol/L的磷酸緩沖溶液中，用標(biāo)準(zhǔn)加入法測(cè)人血清樣品中多巴胺的濃度，并測(cè)量加標(biāo)回收率。全文摘要本發(fā)明公開了一種利用電荷識(shí)別效應(yīng)測(cè)定多巴胺的方法。將金電極用氧化鋁粉拋光，依次在硝酸、無(wú)水乙醇和純水泡洗，取出后超聲洗滌5min，即得到干凈的裸金電極。將金電極放入10-15mL含0.01mol/L半胱氨酸的0.1mol/L的HCl溶液中6h，即制得半胱氨酸修飾電極。然后電極再次在10-15mL含有0.02mol/L1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽和0.04mol/LN-羥基琥珀酰亞胺的0.05mol/L二亞乙基三胺五乙酸的混合溶液中浸泡5h，即可制得二亞乙基三胺五乙酸/半胱氨酸/金修飾電極。對(duì)人體血清樣品DA的含量進(jìn)行檢測(cè)，常見的干擾物質(zhì)抗壞血酸、尿酸及其他氧化電位與DA相近的物質(zhì)未見有明顯的干擾。本發(fā)明能夠用來(lái)測(cè)量血清中多巴胺的濃度，制作簡(jiǎn)單，使用方便。文檔編號(hào)G01N27/48GK101710095SQ20091011454公開日2010年5月19日申請(qǐng)日期2009年11月10日優(yōu)先權(quán)日2009年11月10日發(fā)明者劉蓉,李建平,魏小平申請(qǐng)人:桂林理工大學(xué)