專利名稱：固相萃取-高效液相色譜法檢測(cè)生活污水中土霉素的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生活污水中土霉素的檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及固相萃取一高效液相色譜法檢測(cè) 生活污水中土霉素的方法。
背景技術(shù)：
近年來，環(huán)境中的微量污染物被不斷探測(cè)到，引起了人們的廣泛關(guān)注。抗生素被長(zhǎng)期 大量地用于人和動(dòng)物的疾病治療，并以亞治療劑量添加于動(dòng)物飼料長(zhǎng)期用于動(dòng)物疾病的預(yù) 防和促進(jìn)生長(zhǎng),大部分抗生素不能完全被機(jī)體吸收,而有高達(dá)85%以上抗生素以原形或代謝 物形式經(jīng)由病人和畜禽糞尿排入環(huán)境,經(jīng)不同途徑對(duì)土壤和水體造成污染。而抗生素的濫 用、大量耐藥性致病菌的出現(xiàn)使得抗生素在環(huán)境中的殘留、歸趨以及對(duì)環(huán)境的影響成為關(guān) 注焦點(diǎn)。我國(guó)是抗生素的生產(chǎn)和使用大國(guó)。在農(nóng)用抗生素中,土霉素和等四環(huán)素類抗生素是 應(yīng)用最廣泛、使用量最大的一類抗生素，2003年我國(guó)僅土霉素產(chǎn)量就達(dá)到了10000t,占世 界土霉素生產(chǎn)總量的65%。隨著環(huán)境中微量污染物問題被不斷提出，對(duì)這些抗生素的檢測(cè) 就越來越重要，而抗生素的檢測(cè)方法成為相關(guān)研究的重要因素。
通常的對(duì)水環(huán)境中的土霉素的液相色譜法測(cè)定中，由于在水中天然有機(jī)質(zhì)(主要為腐殖 酸)含量常常很高,對(duì)HPLC檢測(cè)有很大的影響。處理樣品時(shí)，如果只用HLB小柱純化和富集， HLB小柱在吸附土霉素的同時(shí)也會(huì)吸附大量的有機(jī)質(zhì)。在洗脫時(shí),由于洗脫液的洗脫性很強(qiáng)， 在完全洗脫土霉素的同時(shí),也會(huì)洗脫大量的其它有機(jī)物,導(dǎo)致色譜分離時(shí),有機(jī)質(zhì)的峰很高, 并形成拖尾。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供固相萃取一高效液相色譜法檢測(cè)生活污水中土霉 素的方法，該方法建立了一種串聯(lián)固相萃取一高效液相色譜的方法測(cè)定生活污水中痕量土 霉素含量的方法，方法先進(jìn)、準(zhǔn)確，并簡(jiǎn)化了樣品前處理過程。
本發(fā)明的固相萃取一高效液相色譜法檢測(cè)生活污水中土霉素的方法，包括
(1) 用0.1mol/L-0.5mol/L的鹽酸溶液溶解土霉素標(biāo)品，之后不斷稀釋，配制不同濃 度梯度在500嗎/L 10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；
(2) 制備待測(cè)樣品取生活污水在離心機(jī)上離心10 min，取上清液作為待下步處理
樣品；
(3) 使用包括二元泵、恒溫箱、紫外檢測(cè)器及化學(xué)工作站組成的HPLC儀，以超純 水/乙腈為流動(dòng)相，恒速洗脫，色譜條件如下vi. 色譜柱Eclipse XDB-C18 ;
vii. 流動(dòng)相水相A:超純水(pH調(diào)至2.1)
有機(jī)相B:乙腈(色譜純)
Viii. 洗脫方式恒速
ix. 檢測(cè)UV350nm;
x. 柱溫25-30°C
xi. 進(jìn)樣量25pL 、 20pL、 lO^L或5|aL
分別取0.45 u m針頭過濾器過濾后的系列標(biāo)準(zhǔn)夜進(jìn)行譜圖及回歸曲線的測(cè)定；
(4) 待測(cè)樣品在SPE裝置中真空負(fù)壓下過SAX-HLB固相萃取小柱，SAX及HLB固 相萃取小柱均需先經(jīng)過活化處理，即先用丙酮、甲醇和超純水預(yù)處理，濾液過柱流速 3-5mL/min;萃取完成后，移去SAX小柱，用5。/。的甲醇溶液淋洗HLB小柱，再用丙酮(含 5%甲醇)洗脫土霉素，將洗脫液水浴40'C下N2吹干，超純水溶解，0.45um針頭過濾器 過濾后在步驟(3)所述色譜條件下測(cè)定土霉素的含量；
(5) 依據(jù)色譜峰面積，利用外標(biāo)法由土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的回歸方程計(jì)算樣品中土霉素 的含量。
本發(fā)明中水相A和有機(jī)相B體積比為70: 30以流速1.5-3mL/min恒速洗脫。 本發(fā)明中采用SAX-HLB串聯(lián)小柱固相萃取水樣中土霉素物質(zhì)。 本發(fā)明中色譜柱為C18硅膠色譜柱，能在3min內(nèi)完成對(duì)一個(gè)水樣的出圖檢測(cè)。 在樣品制備時(shí)，本發(fā)明采用了離心分離法去除水樣中顆粒物，離心分離具有較高的分
離效果，能夠有效去除容易堵塞萃取柱的物質(zhì)。
在固相萃取過程中，本發(fā)明采用強(qiáng)陰離子交換柱與非極性萃取柱串聯(lián)的方法，水樣首
先通過SAX小柱時(shí)，生活污水中的有機(jī)酸類物質(zhì)都以陰離子形式存在,在通過SAX柱時(shí)可
以被去除,而土霉素可以通過SAX柱，在HLB小柱上被富集。這樣既可以去除有機(jī)質(zhì)的干
擾，又避免了水樣前處理的大量工作，很大程度的提高檢測(cè)效率。
本發(fā)明分別獲得了對(duì)測(cè)定生活污水中痕量土霉素含量的高效液相色譜法有重要影響
的幾個(gè)條件檢測(cè)波長(zhǎng)、柱溫、流動(dòng)相配比和流速等，并考察了回歸方程、相關(guān)系數(shù)及線
性范圍，獲得較好的精密度與加標(biāo)回收率。
有益效果
(1)本發(fā)明建立了一種串聯(lián)固相萃取一高效液相色譜的方法測(cè)定生活污水中痕量土 霉素含量的方法，方法先進(jìn)、準(zhǔn)確，并簡(jiǎn)化了樣品前處理過程；
4(2)通過對(duì)超純水pH與流動(dòng)相配比的調(diào)整，使分析方法中土霉素的色譜圖出峰穩(wěn)定， 峰形良好，出峰的拖尾現(xiàn)象消除，并能得到準(zhǔn)確的結(jié)果。


圖1為本發(fā)明實(shí)施例不同濃度土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖； 圖2為本發(fā)明實(shí)施例污水處理廠進(jìn)出水樣的色譜圖； 圖3為本發(fā)明實(shí)施例標(biāo)準(zhǔn)曲線。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而 不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人 員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定 的范圍。
實(shí)施例1
1. 不同濃度土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備
取純度2 99%的土霉素標(biāo)樣，用0.1mol/L的鹽酸溶液溶解少量土霉素標(biāo)品，之后不 斷稀釋，配制不同濃度梯度在50(Vg/L 10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；
2. 生活污水處理廠進(jìn)出水樣的前處理
取生活污水處理廠進(jìn)出水若干在離心機(jī)上轉(zhuǎn)速4500 r/min離心10 min，取上清液各 2L，在SPE裝置中真空負(fù)壓下過SAX-HLB固相萃取小柱，SAX及HLB固相萃取小柱均 需先經(jīng)過活化處理，即先用2mL丙酮、2mL甲醇、2mL超純水預(yù)處理，濾液過柱流速 3mL/min。萃取完成后，移去SAX小柱；用2mL5y。的甲醇溶液淋洗HLB小柱，再用3mL 丙酮(含5%甲醇)洗脫土霉素，將洗脫液水浴40'C下N2吹干，0.5mL超純水溶解；
3. 色譜條件
色譜柱Eclipse XDB-C18 (4.6Xi50mm， 5um);柱溫25°C;流速1.5mL/min;進(jìn)
樣量20nL;檢測(cè)器紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)355 nm。流動(dòng)相A:超純水(pH2.1)， 流動(dòng)相B:乙腈，體積比70: 30。
4. 分別取標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液和污水廠進(jìn)出水樣經(jīng)0.45nm針頭過濾器過濾后注入液相色譜 儀進(jìn)行分析測(cè)定，由化學(xué)工作站得到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程及樣品的色譜圖。標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的
色譜圖見圖l;生活污水廠進(jìn)出水色譜圖見圖2;標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖3;表1回歸方程及相關(guān)系數(shù)
樣品線性回歸方程相關(guān)系數(shù)線性范圍 (|ag/mL)
土霉素y= 10.331X-1.90570.9997O.l—ll
表2精密度及回收率加標(biāo)濃度 樣品 (ng/L)實(shí)測(cè)濃度 (ng/L)回收率 (%)平均回收率 (%)RSD (%)
176.8088.4
200160.79 169.43 152.2780.4 84.7 76.182.4±5.36.4
355.3388.8
土霉素 400367.94 329.21 360.2792.0 82.3 卯.l88.3±4.24.8
202.40101.2
600182.61 178.09 180.0291.3 89.0 卯.O92.9±5.66.0
權(quán)利要求
1.固相萃取-高效液相色譜法檢測(cè)生活污水中土霉素的方法，包括(1)用0.1mol/L-0.5mol/L的鹽酸溶液溶解土霉素標(biāo)品，配制濃度梯度在500μg/L～10mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液；(2)取生活污水在離心機(jī)上離心10min，取上清液；(3)使用HPLC儀，以超純水/乙腈為流動(dòng)相，恒速洗脫，色譜條件如下i.色譜柱Eclipse XDB-C18；ii.水相A超純水，pH調(diào)至2.1有機(jī)相B乙腈iii.檢測(cè)UV 350nm；iv.柱溫25-30℃v.進(jìn)樣量25μL、20μL、10μL或5μL過濾后的標(biāo)準(zhǔn)液進(jìn)行譜圖及回歸曲線的測(cè)定；(4)步驟(2)上清液在SPE裝置中真空負(fù)壓下過SAX-HLB固相萃取小柱，過濾后在步驟(3)所述色譜條件下測(cè)定土霉素的含量；(5)依據(jù)色譜峰面積，利用外標(biāo)法由土霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的回歸方程計(jì)算樣品中土霉素的含量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相萃取一高效液相色譜法檢測(cè)生活污水中土霉素的方法，其特 征在于所述步驟(3)水相A和有機(jī)相B體積比為70: 30以流速1.5-3mL/min恒速洗脫。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相萃取一高效液相色譜法檢測(cè)生活污水中土霉素的方法，其特 征在于所述步驟G)色譜柱為C18硅膠色譜柱。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的固相萃取一高效液相色譜法檢測(cè)生活污水中土霉素的方法，其特 征在于用于測(cè)定生活污水中的土霉素。
全文摘要
本發(fā)明涉及固相萃取-高效液相色譜法檢測(cè)生活污水中土霉素的方法，采用備有紫外檢測(cè)器的液相色譜儀和C₁₈反相硅膠色譜柱。采用了強(qiáng)陰離子交換柱和非極性萃取柱串聯(lián)的固相萃取方法。有機(jī)流動(dòng)相和調(diào)過pH值的超純水流動(dòng)相作為恒速洗脫劑。本發(fā)明建立了一種串聯(lián)固相萃取-高效液相色譜的方法測(cè)定生活污水中痕量土霉素含量的方法，方法先進(jìn)、準(zhǔn)確，并簡(jiǎn)化了樣品前處理過程。
文檔編號(hào)G01N30/00GK101561421SQ20091005185
公開日2009年10月21日 申請(qǐng)日期2009年5月22日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日
發(fā)明者吳雪峰, 張良亮, 楊煜東, 邱麗娟, 浩 閔, 亮 陳, 剛 陳, 陳東輝, 黃滿紅 申請(qǐng)人:東華大學(xué)