專利名稱：用于體內(nèi)基因輸送的自組裝膠束樣納米顆粒的制作方法
用于體內(nèi)基因輸送的自組裝膠束樣納米顆粒相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用本發(fā)明要求2007年11月9日提交的，名為基因輸送納米顆粒的美國臨時(shí)申請(qǐng) No. 61/002，626號(hào)的優(yōu)先權(quán)，該申請(qǐng)整體納入本文作為參考。關(guān)于聯(lián)邦政府資助研究或開發(fā)的聲明本發(fā)明的研究是使用國立衛(wèi)生研究院No. R01HL55519號(hào)撥款，在美國政府支持下 進(jìn)行的。因此，美國政府擁有本發(fā)明的某些權(quán)利。
背景技術(shù)：
體內(nèi)基因治療依賴于基于DNA的藥物的輸送，形式可以是將寡核苷酸(反義寡聚 脫氧核苷酸(ODN)SiRNA)或者整個(gè)基因(質(zhì)粒DNA)輸送進(jìn)入其在細(xì)胞內(nèi)起作用的位置。除 了少數(shù)可以局部施藥的例外情況，基因治療的廣泛臨床應(yīng)用還需要發(fā)展非侵入性的輸送方 法。非病毒系統(tǒng)是一種理想的DNA載體，因?yàn)槠洳僮靼踩?、簡單，而且費(fèi)用低于病毒系統(tǒng)。在非病毒基因輸送系統(tǒng)中，已經(jīng)研究了基于聚合物的復(fù)合物和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)， 脂質(zhì)體復(fù)合物或包載DNA脂質(zhì)體，但其在臨床應(yīng)用中顯示出局限性。這主要是由于其缺乏 體內(nèi)穩(wěn)定性以致不能在治療水平上輸送基因治療劑到達(dá)靶位置。結(jié)合了基于聚合物的系統(tǒng) 和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)的三級(jí)脂質(zhì)體系統(tǒng)也已經(jīng)被研究。其中，包封了 PEI/DNA復(fù)合物的脂質(zhì) 體納米顆粒，如bioPSL或pSPLP，已經(jīng)被計(jì)劃和測試在體內(nèi)應(yīng)用，得到結(jié)果是有希望的。然 而，盡管在體內(nèi)穩(wěn)定而且達(dá)到靶位置的循環(huán)時(shí)間長，組合系統(tǒng)包括復(fù)雜耗時(shí)的制備步驟而 且承載能力低。陽離子聚合物聚乙烯亞胺(聚乙烯亞胺，PEI)及其衍生物已經(jīng)被廣泛的研究應(yīng)用 于基因輸送[1-5]。PEI具有獨(dú)特的優(yōu)勢，其在合成的聚陽離子中有最高的正電荷密度，使 其可以在靜電作用下與DNA有效凝聚。PEI還有一種內(nèi)在機(jī)制，通過所謂的“質(zhì)子海綿”機(jī)制 [1,2]和核定位[6]調(diào)節(jié)“內(nèi)體逃逸”，這使其具有高轉(zhuǎn)染效率。在分子量從約1到SOOkDa的 寬范圍內(nèi)，線性或分支狀形式的，低分子量PEI已經(jīng)被證明有良好的耐受性和低毒性[7]。然而，由于在循環(huán)過程中的快速清除和RES(網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng))中的積累，PEI/DNA復(fù) 合物形式的PEI在體內(nèi)沒有顯示出顯著的療效。這主要?dú)w因于復(fù)合物整體的正電荷。盡管 復(fù)合物的正電荷與細(xì)胞膜帶負(fù)電的成分相互作用促進(jìn)了復(fù)合物的吸收，它們也會(huì)與血液成 分發(fā)生相互作用和調(diào)理作用，使復(fù)合物在血液循環(huán)中被快速清除。結(jié)果是，已有的PEI/DNA 復(fù)合物幾分鐘內(nèi)就會(huì)被從血液循環(huán)中清除，主要積累在RES器官中，例如肝和脾[8]。當(dāng)注 入身體時(shí)，這些PEI/DNA復(fù)合物在生理環(huán)境中還會(huì)發(fā)生DNA解離和聚合，這些因素限制了已 知的PEI /DNA復(fù)合物的體內(nèi)應(yīng)用。曾經(jīng)嘗試過幾種方法以改進(jìn)PEI/DNA復(fù)合物的體內(nèi)穩(wěn)定性[3，5，9]。如在其他納 米顆粒系統(tǒng)[10]中一樣，已經(jīng)使用聚(乙二醇)(PEG)來提高此類復(fù)合物的體內(nèi)穩(wěn)定性并 延長其循環(huán)時(shí)間。為此目的，已經(jīng)將PEG共價(jià)連接到制備好的PEI/DNA復(fù)合物上[11]，或使 用連接了 PEG的PEI與DNA形成復(fù)合物[12]。制備好的PEI/DNA復(fù)合物也可以使用陰離子 肽和PEG的共聚物包被上PEG[13]。在結(jié)合PEI和脂質(zhì)體的技術(shù)中，連接了脂質(zhì)的PEI如軟 質(zhì)酸酯PEI [14]和膽固醇PEI [15]已經(jīng)被用于制備裝載DNA的聚陽離子脂質(zhì)體(PCL)。也已將制備好的PEI/DNA復(fù)合物包封在PEG穩(wěn)定化的脂質(zhì)體中，制成所謂的“預(yù)濃縮穩(wěn)定質(zhì)粒 脂質(zhì)顆?！?PSPLP) [16]。然而，很明顯還需要其他的方式提高體內(nèi)基因治療的成功率。在非病毒基因輸送系統(tǒng)中，已經(jīng)研究了基于聚合物的復(fù)合物和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)， 脂質(zhì)體復(fù)合物或包載DNA脂質(zhì)體，但其在臨床應(yīng)用中顯示出局限性。這主要是由于其缺乏 體內(nèi)穩(wěn)定性以致不能在治療水平上輸送基因治療劑到達(dá)靶位置。結(jié)合了基于聚合物的系統(tǒng) 和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)的三級(jí)脂質(zhì)體復(fù)合物也已經(jīng)被研究。其中，包封了 PEI/DNA復(fù)合物的脂 質(zhì)體納米顆粒，如bioPSL或pSPLP，已經(jīng)被計(jì)劃和測試在體內(nèi)應(yīng)用，得到結(jié)果是有希望的。 然而，盡管在體內(nèi)穩(wěn)定而且達(dá)到靶位置的循環(huán)時(shí)間長，組合系統(tǒng)包括復(fù)雜耗時(shí)的制備步驟 而且承載能力低。發(fā)明簡述為滿足這樣的需求，開發(fā)了一種裝載了核酸，如質(zhì)粒DNA或SiRNA的新型膠束狀納 米顆粒(MNP)，以及一種構(gòu)建輸送基因的納米顆粒的新方法。首先將陽離子聚合物，如聚乙 烯亞胺(PEI)，結(jié)合到磷脂烷基或?；湹哪┒?，產(chǎn)生磷脂-聚乙烯亞胺(PLPEI)綴合物。 隨后將PLPEI與核酸，如質(zhì)粒DNA、寡核苷酸(如反義寡核苷酸)、RNA或核酶混合，以形成 大小在納米尺度上并具有PEI/核酸(PEI/NA)復(fù)合物核心和磷脂單層(即單分子層)外膜 結(jié)構(gòu)的復(fù)合物。PLPEI的帶陽離子的PEI基團(tuán)和帶陰離子的核酸之間的靜電相互作用提供 了形成納米顆粒的驅(qū)動(dòng)力。PLPEI綴合物的磷脂基團(tuán)在疏水相互作用下排列成單分子層。 將非修飾的(即非綴合的)磷脂如P0PC，膽固醇添加到PLPEI/核酸復(fù)合物中以補(bǔ)充環(huán)繞 PEI/核酸核心的脂質(zhì)單分子層。還加入了 PEG-PE以提供納米顆粒立構(gòu)穩(wěn)化。非修飾的脂 質(zhì)和PEG-PE通過疏水相互作用被納入單分子層中。最終的結(jié)構(gòu)是空間穩(wěn)定的膠束樣納米 顆粒，。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的納米顆?；诹字途垡蚁﹣啺?PLPEI)之間的 共價(jià)綴合物，PEG-PE以及脂質(zhì)的組合。磷脂-聚乙烯亞胺綴合物在質(zhì)粒DNA、非修飾的脂質(zhì) 和PEG-PE存在的情況下會(huì)自組裝成由脂質(zhì)單層包裹硬核的膠束樣納米顆粒，所得到納米 顆粒的結(jié)構(gòu)、性質(zhì)適于體內(nèi)應(yīng)用。本發(fā)明的納米顆粒，一種新的基因輸送結(jié)構(gòu)，是無毒，可長期循環(huán)的，并且能夠在 體內(nèi)有效的向RES位置和其他器官轉(zhuǎn)染治療核酸。本發(fā)明結(jié)合了基于聚合物的基因輸送系 統(tǒng)和基于脂質(zhì)的基因輸送系統(tǒng)，得到了一種磷脂和聚合物的化學(xué)綴合物的新用法。將聚乙 烯亞胺(PEI)綴合在磷脂烷基鏈的末端0產(chǎn)生了一種新的化學(xué)物質(zhì)，磷脂-聚乙烯亞胺 (PLPEI)綴合物。PLPEI的兩個(gè)功能區(qū)域，i)DNA結(jié)合區(qū)和ii)膜形成區(qū)，分別由PEI和PL 基團(tuán)形成。在DNA存在的情況下，PLPEI通過聚陽離子PEI和聚陰離子DNA間的靜電相互作 用自組裝成納米顆粒。脂質(zhì)基團(tuán)間的疏水相互作用也促進(jìn)了自組裝過程。自組裝的納米顆 粒具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu)，其中PEI/NA復(fù)合物核心和脂質(zhì)單層外膜由化學(xué)鍵連接。本發(fā)明納米顆 粒不同于脂質(zhì)體納米顆粒等，脂質(zhì)體納米顆粒中，脂質(zhì)形成雙分子層而非單分子層。本發(fā)明 納米顆粒也不同于膠束，膠束完全由疏水相互作用組裝而成，并有“臨界膠態(tài)粒子濃度”的 限制。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提供了簡單的、可重復(fù)的一步制備方法以及相對(duì)于其他包封 PEI/DNA復(fù)合物的脂質(zhì)體納米顆粒如bioPSL和pSPLP，更高的承載能力。本發(fā)明的納米顆 粒還提供了約25% (w/w)的高DNA承載能力，大約是文獻(xiàn)已經(jīng)報(bào)道的其他系統(tǒng)值的10倍。此處使用的“DNA承載能力，，或“核酸承載能力，，是指能包含入本發(fā)明的納米顆粒的DNA或 其他核酸的量。附圖簡述本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點(diǎn)在下文結(jié)合附圖的優(yōu)選實(shí)施方案以及權(quán)利要求中展示。

圖1顯示PEI/DNA核心為磷脂單層所包圍的膠束樣納米顆粒(MNP)自組裝過程的 示意圖。通過DNA和磷脂-聚乙烯亞胺綴合物(PLPEI)形成復(fù)合物，隨后用脂質(zhì)單層包封 該復(fù)合物，MNP在水介質(zhì)中自發(fā)形成。PLPEI的PEI基團(tuán)與DNA致密結(jié)合，得到一個(gè)疏水核 心，而PLPEI的磷脂基團(tuán)與非修飾的脂以及PEG-PE形成環(huán)繞PEI/DNA核心的脂質(zhì)單層。結(jié) 合了 PEG-PE的脂質(zhì)單層也提供了體內(nèi)穩(wěn)定性。圖2a_2b顯示對(duì)MNP形成的分析。(圖2a)不同N/P比率下，PLPEI/DNA復(fù)合物對(duì) 比PEI/DNA復(fù)合物的瓊脂糖凝膠電泳。沒有DNA遷移到膠中說明復(fù)合物形成。在N/P彡6 時(shí)，DNA完全與PLPEI結(jié)合。PLPEI顯示出的結(jié)合能力與非修飾PEI相當(dāng)。(圖2b)MNP的冷 凍斷裂電子顯微鏡(ffTEM)分析。MNP顯示為平均直徑50nm、大小分散范圍窄、成型良好的 球形顆粒。所有顆粒都顯示出結(jié)構(gòu)背后的陰影，證實(shí)了膠束樣“核”和“單分子層”的構(gòu)造。 比例尺表示50nm。圖3a_3b顯示了 MNP的穩(wěn)定性分析。(圖3a)MNP對(duì)抗鹽誘導(dǎo)的聚集的膠體穩(wěn)定性。 監(jiān)測了加入鹽(0. 15M NaCl)前后的流體力學(xué)直徑(hydrodynamic diameter)。加鹽后，MNP 保持穩(wěn)定而PEI/DNA迅速聚集。數(shù)據(jù)以平均士 s. e. m表示(η = 3)。(圖3b)對(duì)MNP中所攜 帶DNA的抗酶解保護(hù)。攜帶DNA的MNP和PEI/DNA復(fù)合物在經(jīng)DNAase I處理后，在0. 8 % 的預(yù)制瓊脂糖凝膠上進(jìn)行分析，MNP中的DNA完全被保護(hù)而未被酶解。泳道1，DNA ；泳道2， DNA, DNase ；泳道 3，PEI/DNA ；泳道 4，PEI/DNA, DNase ；泳道 5，MNP ；泳道 6，MNP, DNase ；泳 道7，100堿基對(duì)的標(biāo)記物。圖4顯示了 MNP對(duì)NIH/3T3細(xì)胞的毒性。成纖維細(xì)胞NIH/3T3用不同PEI濃度的 攜帶了 DNA的MNP或PEI/DNA復(fù)合物處理。相對(duì)細(xì)胞存活率表示為相對(duì)于以培養(yǎng)基處理的 對(duì)照細(xì)胞的百分比。相比PEI/DNA復(fù)合物，4小時(shí)的處理后再經(jīng)24小時(shí)溫育，MNP沒有顯示
出毒性。圖5a_5b顯示了裝載了 DNA的MNP和PEI/DNA復(fù)合物在小鼠中的體內(nèi)表現(xiàn)靜脈 (i. v.)注射攜有mIn-標(biāo)記的DNA的藥劑后，(a)血液濃度-時(shí)間曲線(注意對(duì)數(shù)尺度)，和 (b)DNA在器官中的積累情況。注射后不同的時(shí)間采集血樣，在最后一次采血后采集主要器 官。血液和器官樣品的放射性使用伽瑪計(jì)量器來測量，并表示為相對(duì)于每毫升血液或每克 器官注射劑量的百分比表示(％ ID/ml或％ ID/g)。相比PEI/DNA復(fù)合物，MNP顯示出更長 的血液循環(huán)時(shí)間和更低的RES吸收。ρ值是先用雙向方差分析(ANOVA)然后用Bonferroni post-hoc檢驗(yàn)測定的。圖6a_6b顯示了攜帶pGFP的MNP在鼠異種移植物模型中的體內(nèi)轉(zhuǎn)染結(jié)果?；糒LC 腫瘤的鼠靜脈注射攜帶PGFP的MNP。注射后48小時(shí)，檢測GFP在腫瘤中的表達(dá)。圖中顯示 了體內(nèi)生長的LLC腫瘤冷凍切片的熒光顯微鏡圖像。(a)未經(jīng)處理的動(dòng)物的腫瘤切片(背 景圖案)；(b)注射了攜帶pGFP的MNP的動(dòng)物的腫瘤切片。靜脈注射攜帶pGFP的MNP使末 端的腫瘤出現(xiàn)明亮的熒光。由于注射相同DNA含量的PEI/DNA復(fù)合物后動(dòng)物很快死亡，沒 有檢測接受PEI/DNA復(fù)合物注射的動(dòng)物的腫瘤組織中的GFP表達(dá)。
發(fā)明詳述發(fā)明人開發(fā)了一種適合體內(nèi)應(yīng)用的新型基因輸送載體。該載體可通過在烷基鏈末 端化學(xué)綴合磷脂和聚陽離子，如聚乙烯亞胺(PLPEI)來構(gòu)建。受聚陽離子PEI基團(tuán)和DNA 間的靜電相互作用力驅(qū)動(dòng)形成了致密的PEI/DNA復(fù)合物核心，同時(shí)，兩親性的磷脂基團(tuán)與 選擇性加入的非修飾游離磷脂和連接了 PEG的磷脂(如PEG-PE) —起形成環(huán)繞復(fù)合物核心 的脂質(zhì)單層外膜，由此形成攜帶有DNA的膠束樣納米顆粒，該納米顆粒具有PEG鏈的空間位 阻和脂質(zhì)單層外膜的膜樣屏障提供的穩(wěn)定性。與取得了巨大成功的空間穩(wěn)化(steric stabilization)脂質(zhì)體不同[20]，聚乙 二醇(PEG)賦予復(fù)合物的立構(gòu)穩(wěn)化沒能提供足夠的循環(huán)時(shí)間和體內(nèi)穩(wěn)定性[8]。而本發(fā)明 通過交聯(lián)聚合物/DNA復(fù)合物(polyplexes)的表面[9]將空間穩(wěn)定與“側(cè)向穩(wěn)定(lateral stabilization) ”相結(jié)合，取得了重大的改進(jìn)。這表明立構(gòu)穩(wěn)化對(duì)聚合物/DNA復(fù)合物的體 內(nèi)穩(wěn)定作用有限，需要其他穩(wěn)定機(jī)制來加強(qiáng)復(fù)合物的體內(nèi)穩(wěn)定性。其他穩(wěn)化作用可以通過用脂質(zhì)屏障包封聚合物/DNA復(fù)合物來實(shí)現(xiàn)，因?yàn)辂}不能 透過脂質(zhì)屏障，從而保護(hù)了復(fù)合物不會(huì)因受到鹽的影響而不穩(wěn)定。在血液循環(huán)中，由于復(fù)合 物核心與生物環(huán)境相隔離，此類系統(tǒng)的體內(nèi)表現(xiàn)主要取決于脂質(zhì)屏障。脂質(zhì)屏障的立構(gòu)穩(wěn) 化作用延長了有載復(fù)合物的循環(huán)時(shí)間，并使復(fù)合物能夠通過Era機(jī)制被輸送RES之外的其 他靶器官。此外，被細(xì)胞吸收后，PEI仍將發(fā)揮其良好的功能，例如滲透活性和抗胞質(zhì)核酸 酶保護(hù)，從而改進(jìn)DNA分子的細(xì)胞內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)特性。此外，膠束樣納米顆粒還受到來自脂質(zhì)單層外膜的穩(wěn)定化作用，該脂質(zhì)單層受到 PLPEI以及自由脂質(zhì)和PEG-脂質(zhì)中脂質(zhì)基團(tuán)之間疏水相互作用的驅(qū)動(dòng)自動(dòng)組裝而成。MNP 對(duì)鹽引起的聚集和酶消化的強(qiáng)抵抗力證實(shí)了這樣的脂質(zhì)單分子層屏障的存在。生理環(huán)境的 高鹽是引起PEI/DNA復(fù)合物在體內(nèi)不穩(wěn)定的機(jī)制之一 [8]。這些復(fù)合物通過聚陽離子PEI 和聚陰離子DNA之間的強(qiáng)靜電相互作用形成，并且由顆粒間的靜電斥力穩(wěn)定在膠態(tài)。然而， 在生理環(huán)境中，升高的鹽濃度會(huì)引起復(fù)合物顆粒聚集，原因在于聚合物/DNA復(fù)合物顆粒間 的靜電斥力被破壞，同時(shí)，由于聚陽離子和聚陰離子DNA之間的靜電相互吸引被破壞，復(fù)合 物顆粒發(fā)生解離[21]。盡管PEG鏈的立構(gòu)穩(wěn)化作用降低了 PEG接枝PEI/DNA復(fù)合物對(duì)鹽 引發(fā)的聚集的敏感度，復(fù)合物穩(wěn)定性一般表明單純的立構(gòu)穩(wěn)化作用有限，還需要其他穩(wěn)定 機(jī)制來防止復(fù)合物聚集[12，22-24]。不能鹽不透性脂質(zhì)屏障的存在提高了高鹽環(huán)境中MNP 的穩(wěn)定性。脂質(zhì)單層屏障，與脂質(zhì)體一樣，阻止了外環(huán)境中的鹽進(jìn)到復(fù)合物核心，由此提供 了抗鹽引起的聚集的保護(hù)，否則，聚合物/DNA復(fù)合物將是不穩(wěn)定的。沒有游離脂質(zhì)的中間 產(chǎn)物PLPEI/DNA復(fù)合物發(fā)生的中等程度聚集表明僅靠PLPEI綴合物的磷脂基團(tuán)提供的脂 質(zhì)屏障似乎不及補(bǔ)充了非綴合脂質(zhì)的輟合磷脂所提供的那樣完全。選擇PEG-脂質(zhì)如PEG-PE的合適的量以促進(jìn)游離脂質(zhì)進(jìn)入已制備好的復(fù)合物并提 供對(duì)最終構(gòu)造物的立構(gòu)穩(wěn)化作用?？紤]到隨著混合物中PEG-PE含量增加(膠束形成始于 約5mol % )，PEG-PE與磷脂的混合物從膠束相轉(zhuǎn)變?yōu)閷訝钕郲25，26]，游離脂質(zhì)混合物水懸 浮液的PEG-PE濃度為10mol%有利于膠束相轉(zhuǎn)變?yōu)閷訝钕?。與已制備好的PLPEI/DNA復(fù)合 物共同溫育后，包括游離脂質(zhì)和綴合脂質(zhì)在內(nèi)總脂質(zhì)中的PEG-PE含量下降至4. 3mol%，在 此濃度傾向于形成層狀相。本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)，膠束相中的PEG-PE分子會(huì)通過所謂的“膠束轉(zhuǎn) 移” [27]自發(fā)進(jìn)入已制備好的磷脂囊泡表面?？梢哉J(rèn)為，游離脂質(zhì)會(huì)與PLPEI/DNA復(fù)合物的疏水脂質(zhì)區(qū)相互作用，解離成單體后自發(fā)進(jìn)入已制備好的復(fù)合物的脂質(zhì)層，從而與PLPEI 綴合物提供的磷脂基團(tuán)一起形成環(huán)繞復(fù)合物核心的脂質(zhì)單層外膜。最終結(jié)構(gòu)是一種具有 PEI/DNA復(fù)合物核心和脂質(zhì)單層外膜的，經(jīng)立構(gòu)穩(wěn)化的膠束樣硬核顆粒。Pluronic P123-接枝的PEI/DNA復(fù)合物系統(tǒng)被認(rèn)為具有類似的基于疏水相互作 用的穩(wěn)定機(jī)制[28，29]，在該復(fù)合物系統(tǒng)中，Pluronic P123-接枝PEI的兩親Pluronic P123鏈形成環(huán)繞聚合物/DNA復(fù)合物核心的膠束樣結(jié)構(gòu)，非修飾的Pluronic P123則通過與 Pluronic P123-接枝PEI綴合物的疏水相互作用填充到復(fù)合物中，從而優(yōu)化膠束樣結(jié)構(gòu)的 穩(wěn)定性。膠束樣納米顆粒，在一定意義上，類似于將聚賴氨酸/DNA包封在靶向葉酸的陰離 子脂質(zhì)體中的所謂的“脂質(zhì)體包封的聚陽離子凝縮DNA顆?！?LDP II) [30]，或?qū)EI/DNA 復(fù)合物包封在已制備好的陰離子脂質(zhì)體中的“人造病毒樣顆?！?[31-33]，或?qū)EI/DNA復(fù) 合物包封在由外部PEG層穩(wěn)定的脂質(zhì)雙層(即雙分子層)中構(gòu)成的“預(yù)凝縮穩(wěn)定質(zhì)粒脂質(zhì) 顆?！?pSPLP) [16]。特別是，pSPLP表現(xiàn)出了將聚合物/DNA復(fù)合物包封在穩(wěn)定化脂質(zhì)體中 的優(yōu)點(diǎn)，即由于循環(huán)時(shí)間延長得以實(shí)現(xiàn)PEI/DNA復(fù)合物向腫瘤全身性的有效輸送，以及PEI 溶內(nèi)體(endosomolytic)活性帶來的轉(zhuǎn)染效力提高。然而，pSPLP的制備包括將已制備好 的聚合物/DNA復(fù)合物與脂質(zhì)在乙醇(有機(jī)溶劑)中進(jìn)行溫育，這一步具有潛在的破壞性， 因而需要多個(gè)步驟的濃縮和透析。膠束樣納米顆粒的優(yōu)點(diǎn)在于將脂質(zhì)體和經(jīng)立構(gòu)穩(wěn)化的脂質(zhì)膜結(jié)合，盡管此處的脂 質(zhì)膜為單層膜。PLPEI綴合物促成了由同時(shí)發(fā)生的DNA凝縮和脂質(zhì)膜形成共同完成的攜帶 DNA的MNP的自組裝過程。與脂質(zhì)體包封的DNA-PEI復(fù)合物相比，MNP提供了效率100%的 更方便的一步法DNA加載，還提供了高于各種將DNA包封入脂質(zhì)體之類其他方法[34]的承 載能力(高達(dá)530 μ gDNA/ μ mol總脂，或總顆粒質(zhì)量的30%為核酸)。本發(fā)明的膠束樣納米顆粒10包括一個(gè)包封在脂質(zhì)單層中的核心復(fù)合物(見圖1)。 核心復(fù)合物20含有一個(gè)或多個(gè)核酸分子30，核酸分子與一個(gè)或多個(gè)陽離子聚合物分子40 如PEI靜電結(jié)合。陽離子聚合物與脂質(zhì)單層外膜上的脂分子50共價(jià)綴合。一方面，陽離子 聚合物結(jié)合和包裹核酸從而形成納米顆粒的核心復(fù)合物。另一方面，陽離子聚合物與脂質(zhì) 分子一優(yōu)選磷脂一的疏水區(qū)域的共價(jià)連接60使得復(fù)合物核心被脂質(zhì)單分子層70所包封， 提高了穩(wěn)定性以及與細(xì)胞膜融合的能力。膠束樣納米顆粒的平均直徑可以從約IOnm至約lOOOnm，優(yōu)選約IOnm至約500nm， 更優(yōu)選約IOnm至約200nm，再優(yōu)選約40nm至約IOOnm或從約50nm至約70nm。MNP的大小 適于其進(jìn)入細(xì)胞并將其所帶的核酸成分轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中。陽離子聚合物可以是任何人造的或者天然的聚合物，每分子具有至少兩個(gè)正電 荷，并有足夠的電荷密度和分子大小從而能夠在生理?xiàng)l件下(即，體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)可能遇到 的PH和鹽環(huán)境)與核酸結(jié)合。適合的陽離子聚合物包括，例如，聚乙烯亞胺、聚鳥氨酸、聚 精氨酸、聚賴氨酸、聚烯丙胺和氨基葡聚糖。陽離子聚合物可以是直鏈或分支的，可以是均 聚物或共聚物，包含的氨基酸可以是L或D型，也可以是這些特征的任意組合。優(yōu)選的，陽 離子聚合物分子足夠柔韌使其可以與一個(gè)或多個(gè)核酸分子形成緊密的復(fù)合物。與陽離子聚合物綴合的脂質(zhì)分子在此處被稱為“第一脂質(zhì)”、“第一磷脂”、“綴合的 脂質(zhì)”或“綴合的磷脂”。適合的脂質(zhì)包括任何如下所述天然的或合成的雙親(amphipathic)
8脂(也被稱為兩親(amphiphilic)脂)能夠與其他雙親脂一起穩(wěn)定的形成或進(jìn)入質(zhì)脂單 層或雙層。脂質(zhì)的疏水基團(tuán)與脂質(zhì)單層或雙層的疏水區(qū)域相接觸，其極性頭部指向外部的 水相，脂質(zhì)單層或雙層的極性表面，并且，在此情況下，朝向納米顆粒的外表面。雙親脂的親 水性源于極性或帶電基團(tuán)的存在，如碳水化合物、磷酸基、羧基、硫酸根、氨基、巰基，硝基， 羥基之類。兩親脂的疏水部分可以來自其包含的非極性基團(tuán)，包括長鏈飽和或不飽和脂族 烴基以及被一個(gè)或多個(gè)芳烴、脂族環(huán)或雜環(huán)基取代的此類基團(tuán)。兩親脂的例子包括但不限 于，天然或合成的磷脂、糖脂、氨基脂、鞘脂、長鏈脂肪酸和留醇。磷脂的代表性的例子包括， 但不僅限于，卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸、磷酸肌醇、磷脂酸、軟質(zhì)酰油酰、卵磷 脂、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、二棕櫚酰磷脂酰膽堿、二油酸磷酯酰膽堿、二硬脂酰卵 磷脂和二亞油酰磷脂酰膽堿。缺乏磷的其他化合物，如鞘脂、糖鞘脂、甘油二酯和?；?含氧酸也可以用作兩親脂。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的納米顆粒包含未與陽離子聚合物綴合的其他脂質(zhì) (“非綴合的脂質(zhì)”或“法綴合的磷脂”)。這些非綴合的其他脂質(zhì)具有穩(wěn)定和完善脂質(zhì)單層 外膜的作用，并看作為穩(wěn)定基團(tuán)(如PEG)或靶向基團(tuán)的連接位點(diǎn)。非綴合的脂可以是上面 記載的兩親脂，如磷脂，也可以包含如甘油三酯和留醇等其他脂(如膽固醇)。納米顆粒中 綴合的和非綴合的脂質(zhì)中至少一種是形成脂質(zhì)雙層的脂質(zhì)，如磷脂。在優(yōu)選的實(shí)施方案中， 納米顆粒的脂質(zhì)單層包含綴合脂質(zhì)作為第一部分，非綴合脂質(zhì)作為第二部分和膽固醇作為 第三部分。每部分的相對(duì)含量可以不同，但優(yōu)選每種綴合脂質(zhì)和非綴合脂質(zhì)占單層脂質(zhì)的 摩爾分?jǐn)?shù)約為10到70%，膽固醇占單層脂質(zhì)的摩爾分?jǐn)?shù)約為1到30%或5% -20%。例如， 在一個(gè)實(shí)施方案中，脂質(zhì)單層包含綴合的脂、非綴合的脂和膽固醇，比例為4 3 3。MNP的脂質(zhì)單層還可以包含多種其他分子組分，用于例如穩(wěn)定或標(biāo)記顆?；蚴蛊?具有靶向功能。這些組分包括肽、蛋白質(zhì)、去垢劑、脂質(zhì)衍生物，特別是PEG-脂質(zhì)衍生物， 如連接了二烷基氧丙基、甘油二酯、磷脂酰乙醇胺和神經(jīng)酰胺結(jié)合的PEG(見，如美國專利 No. 5，885，613，通過引用將其納入本文)。在某些實(shí)施方案中，納米顆粒基本上不含去垢劑。 脂質(zhì)單層加有PEG-脂時(shí)，PEG-脂的量優(yōu)選占脂質(zhì)單層重量的約0. 5到20%，更優(yōu)約1到 10%,再優(yōu)選約2到5%。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施例中，納米顆粒的脂質(zhì)單層包含綴合的脂、非綴 合的脂、膽固醇和PEG-PE，摩爾比為4 3 3 0.3?？捎糜趯㈦幕虻鞍踪|(zhì)連接到納米顆粒上的一種脂質(zhì)衍生物為對(duì)硝基苯羰基 PEG-PE (pNP-PEG-PE)。游離氨基，如抗體或其它蛋白質(zhì)分子上的游離氨基，可以與pNP 基團(tuán)反應(yīng)，從而將靶向基團(tuán)共價(jià)結(jié)合到納米顆粒上。見，例如Liposomes :A Practical Approach, V. P. Torchelin and V. ffeissig, Oxford University Press, 2003,通過弓|用將其 納入本文。納米顆粒中央的核心復(fù)合物除陽離子聚合物，還包括一個(gè)或多個(gè)核酸分子。這些 核酸分子用于轉(zhuǎn)移入活細(xì)胞或組織內(nèi)并在其中發(fā)揮其生物學(xué)作用。術(shù)語“核酸”指脫氧核 苷酸或核苷酸以及它們單鏈或雙鏈形式的聚合物(DNA或RNA)。該術(shù)語的核酸包括含有已 知核苷酸類似物、修飾骨架殘基或修飾連接的核酸，可以是合成的或天然存在的。類似物的 例子包括但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺、甲基膦酸酯、手性甲基膦酸酯，2-0-甲基核苷酸 和肽_核酸(PNAs)。DNA可以是反義DNA、質(zhì)粒DNA、部分質(zhì)粒DNA、預(yù)凝縮DNA、聚合酶鏈?zhǔn)?反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物、載體$1、？々(、84(、￥4(、人工染色體)、表達(dá)盒、嵌合序列、染色體0嫩、或這些物質(zhì)的衍生物。術(shù)語核酸可以與術(shù)語基因、cDNA、基因編碼的mRNA和干擾RNA分子交 換使用。術(shù)語“基因”指包括生產(chǎn)多肽或多肽前體所需的部分或全長編碼序列的核酸(如 DNA或RNA)序列。術(shù)語“RNAi ”指能夠減少或抑制靶基因表達(dá)的雙鏈RNA，當(dāng)干擾RNA與靶基因處于 同一細(xì)胞中時(shí)，干擾RNA會(huì)引起與干擾RNA序列互補(bǔ)的mRNA的降解。因此RNAi指由兩條 互補(bǔ)鏈或一條自我互補(bǔ)的單鏈形成的雙鏈RNA。RNAi與靶基因通常基本上或完全一致。干 擾RNA的序列可以對(duì)應(yīng)靶基因的全長序列或其子序列。RNAi包括小干擾RNA或“ siRNA”。 siRNA 長度約 15-60、15-50、15-50、或 15-40 個(gè)堿基對(duì)，更常見的約 15-30、15-25 或 19-25 個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選長約20-24或約21-22或21-23個(gè)堿基對(duì)。siRNA雙鏈體可能具有約1到4 個(gè)核苷酸的3’端突出，優(yōu)選約2到3個(gè)核苷酸，還可能具有5’磷酸末端。siRNA可以是化 學(xué)合成的或質(zhì)粒編碼的。siRNA也可以由較長的dsDNA剪切而來。優(yōu)選的，dsDNA長度至少 約100、200、300、400或500個(gè)核苷酸。dsDNA可能長達(dá)1000、1500,2000,5000個(gè)核苷酸或 更長。dsDNA可以編碼整個(gè)基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物或部分基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。應(yīng)調(diào)整組裝本發(fā)明納米顆粒的陽離子聚合物與核酸的比率以確保所有的核酸都 形成復(fù)合物。下面的實(shí)施例中描述了使用凝膠電泳的方法實(shí)現(xiàn)這一目標(biāo)。一般來說，胺和磷 的比率(N/P)以約1到20為宜。優(yōu)選約10的比率。單個(gè)MNP的核酸裝載量范圍較寬。組 裝完成后MNP的核酸含量以重量計(jì)可以高達(dá)40%，這大大高于此前的含核酸納米顆粒所能 攜帶的量。對(duì)于某些技術(shù)，可能僅需要非常少量的核酸，甚至不需要核酸(如，對(duì)照顆粒)， 在這樣的情況下，一部分陽離子聚合物可以與陰離子聚合物(如，羥甲基纖維素)復(fù)合形成 穩(wěn)定的核心。陽離子聚合物中帶電基團(tuán)和核酸的比例根據(jù)兩者共處所在溶液的PH值而不 同?？梢栽O(shè)計(jì)聚合物以使預(yù)定比例的可離子化基團(tuán)帶電以與核酸結(jié)合。例如，在某些實(shí)施 方案中，至少約10%的基團(tuán)帶電，而在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在形成過程中以及在完成后的核 心復(fù)合物中，聚合物約50到100%的基團(tuán)帶電。通常，本發(fā)明的MNPs用于下調(diào)或消除目的基因產(chǎn)物的表達(dá)?；蛘?，可以將治療基 因輸送到特定細(xì)胞內(nèi)替換有缺陷的基因，增加基因產(chǎn)物的表達(dá)，或調(diào)節(jié)其他基因的表達(dá)。許 多適合本發(fā)明MNPs的靶基因產(chǎn)物是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。這些產(chǎn)物包括但不限于與病 毒感染和恢復(fù)相關(guān)的基因、與代謝疾病和紊亂相關(guān)的基因、與腫瘤的發(fā)生和細(xì)胞轉(zhuǎn)化相關(guān) 的基因、血管新生基因、免疫調(diào)節(jié)基因如那些與炎癥和自身免疫反應(yīng)相關(guān)的基因、配體受體 基因、以及與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的基因?？捎墒褂谜邅磉x擇適合的目標(biāo)，使用者可以按照 常規(guī)選擇適合的RNAi或治療基因。本發(fā)明還提供了一種包括上述納米顆粒的非病毒載體。該載體具有含核酸-陽離 子聚合復(fù)合物的核心復(fù)合物以及含有第一磷脂且該第一磷脂在末端(疏水性)與陽離子聚 合物綴合的脂質(zhì)單層外膜，并且，該載體適合將核酸從核心復(fù)合物中轉(zhuǎn)送到細(xì)胞內(nèi)。這可以 通過多種機(jī)制實(shí)現(xiàn)，例如，在脂質(zhì)單層中加入促進(jìn)膜融合的脂或蛋白，或加入能夠結(jié)合靶細(xì) 胞表面受體的一種或多種靶向物質(zhì)，如配體或抗體。并且，本發(fā)明載體可以包括設(shè)計(jì)用于促 進(jìn)或調(diào)節(jié)該載體內(nèi)其他核酸序列的表達(dá)或進(jìn)入基因組的核酸序列。為將本發(fā)明納米顆粒和非病毒載體送至靶細(xì)胞并將其所含核酸轉(zhuǎn)移給靶細(xì)胞，可 以在其形成過程中，向納米顆粒表面加入靶向物質(zhì)或靶向基團(tuán)。這很容易做到，可以利用靶 向基團(tuán)的脂衍生物將靶向物質(zhì)包含在非綴合脂質(zhì)中來完成。例如，許多靶向物質(zhì)是肽或蛋白，它們可以通過化學(xué)側(cè)鏈與脂質(zhì)綴合(如，靶向物質(zhì)上的氨基與PNP-PEG-PE反應(yīng))。適 合的靶向物質(zhì)是本領(lǐng)域公知的，包括但不限于自然存在或工程設(shè)計(jì)的抗體或其抗原結(jié)合片 段、域抗體或單鏈抗體、細(xì)胞表面受體的配體、生物素等。本發(fā)明的另一項(xiàng)內(nèi)容是一種制備膠束樣納米顆粒的方法，所述膠束樣納米顆粒包 含被脂質(zhì)單層包被的核心復(fù)合物。一個(gè)或多個(gè)核酸分子在適合形成納米顆粒核心復(fù)合物的 條件下與前文所述的陽離子聚合物-脂綴合物相接觸。帶負(fù)電荷的核酸與綴合物的陽離子 聚合物部分靜電結(jié)合，形成穩(wěn)定的核心復(fù)合物。然后向所得核心復(fù)合物供給一種或多種非 綴合脂質(zhì)以形成包裹該核心復(fù)合物的脂質(zhì)單層。本發(fā)明還包括一種用膠束裝納米顆粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法。在適合載體內(nèi)核酸分子向 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)移的條件下，使細(xì)胞與前文所述的非病毒載體相接觸。本發(fā)明的納米顆粒和非病毒載體可以單獨(dú)使用，也可以與藥用載體配制成藥物組 合物來使用，所述藥物載體可按照給藥途徑和醫(yī)藥界標(biāo)準(zhǔn)實(shí)踐來選擇，例如生理鹽水或磷 酸緩沖液。藥用載體通常在顆粒形成后加入。藥物制劑中顆粒的濃度范圍很寬，按重量計(jì)， 可以小于約0. 05%或約2. 5%，也可以高達(dá)10%至30%。本發(fā)明的藥物組合物可采用傳統(tǒng)的、公知的消毒技術(shù)消毒?？蓪⑺芤喊b以供 使用，或?qū)⑺芤涸跓o菌條件下過濾后凍干，臨用前將凍干制劑與無菌水混合。組合物可以 包含接近生理?xiàng)l件所需的藥學(xué)上可接受的輔料，例如PH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑、張度tonicity調(diào) 節(jié)劑等，例如醋酸鈉、乳酸鈉、氯化鈉、氯化鉀和氯化鈣。此外，顆粒懸液可以包含在儲(chǔ)存期 間保護(hù)脂質(zhì)免受自由基損害和脂質(zhì)過氧化損害的脂質(zhì)保護(hù)劑。例如，可以使用親脂性自由 基淬滅劑，如α-生育酚。本發(fā)明的納米顆粒和非病毒載體可以用于將核酸導(dǎo)入細(xì)胞，例如用于治療或預(yù)防 與靶基因表達(dá)相關(guān)的疾病或紊亂。因此，本發(fā)明還提供將核酸(如RNAi或治療基因)導(dǎo)入 細(xì)胞的方法。在治療有疾病或醫(yī)學(xué)癥狀的對(duì)象或預(yù)防對(duì)象的疾病或醫(yī)學(xué)癥狀的方法中，本 發(fā)明的非病毒載體在體內(nèi)或體外與一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞相接觸。這些細(xì)胞可以是對(duì)象的細(xì)胞， 也可以是捐贈(zèng)者的細(xì)胞。將細(xì)胞與載體接觸的結(jié)果是，載體攜帶的一個(gè)或多個(gè)核酸被轉(zhuǎn)移 到對(duì)象的細(xì)胞中，從而治療或預(yù)防疾病或醫(yī)學(xué)癥狀。在某些實(shí)施方案中，細(xì)胞與載體在體外 接觸，隨后將細(xì)胞作為治療劑或預(yù)防劑的一部分給予對(duì)象。如前文所述形成適合的膠束樣 顆粒。然后將顆粒與適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞接觸一段時(shí)間，接觸時(shí)間需足以發(fā)生核酸轉(zhuǎn)移。本發(fā)明的 納米顆?？晌降脚c之混合或接觸的幾乎所有類型的細(xì)胞上。一旦吸附，顆粒可以通過細(xì) 胞內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，與細(xì)胞表面膜上的脂質(zhì)交換，或者與靶細(xì)胞融合，從而使得顆粒內(nèi)的 核酸轉(zhuǎn)移或進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)。核酸細(xì)胞內(nèi)輸送最常見的靶細(xì)胞類型中之一是贅生neoplastic 細(xì)胞(腫瘤細(xì)胞)。其他還有造血前體細(xì)胞或干細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、角質(zhì)形成細(xì)胞、肝細(xì)胞、 內(nèi)皮細(xì)胞、骨骼和平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)元、靜態(tài)淋巴細(xì)胞、末端分化細(xì)胞、淋巴細(xì)胞， 上皮細(xì)胞、骨細(xì)胞等等。對(duì)于體外應(yīng)用，本發(fā)明納米顆粒的核酸輸送可以輸送到任何源于植物或動(dòng)物的、 脊椎動(dòng)物或無脊椎動(dòng)物的、來自任何組織的在培養(yǎng)基中生長的細(xì)胞中。細(xì)胞和納米顆粒的 體外接觸在生物相容的介質(zhì)中進(jìn)行。納米顆粒的濃度可以依據(jù)特定的應(yīng)用而變化。使用納 米顆粒的體外細(xì)胞治療通常在生理溫度下進(jìn)行(約37°C )，時(shí)間約1到48小時(shí)，優(yōu)選約2 到4小時(shí)。
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本發(fā)明提供了抑制細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)的方法。該方法包括使細(xì)胞與膠束樣納米顆粒 接觸，所述納米顆粒的核心復(fù)合物含有siRNA或RNAi或者在靶細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生RNAi或siRNA 的核酸。通過已知的方法針對(duì)靶基因?qū)ｉT設(shè)計(jì)siRNA或RNAi，將其轉(zhuǎn)入細(xì)胞能抑制靶基因 的表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，納米顆?？梢杂糜谠隗w內(nèi)向動(dòng)物，如犬類動(dòng)物、貓類動(dòng)物、馬 類動(dòng)物、牛類動(dòng)物、綿羊類動(dòng)物、山羊類動(dòng)物、鼠類或靈長類動(dòng)物，包括人類輸送核酸，如 siRNA或治療基因。體內(nèi)輸送可以是局部的，即直接輸送到靶位置，或全身的。已經(jīng)用核 酸_脂質(zhì)顆粒系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了以體內(nèi)基因治療為目的全身性輸送，即通過如血液循環(huán)等身體系 統(tǒng)將治療核酸輸送到較遠(yuǎn)的靶細(xì)胞，這可以參照以下文獻(xiàn)完成PCT申請(qǐng)W096/40964，美國 專利Nos. 5，705，385,5, 976，567,5, 981，501和6，410，328，通過引用將這些文獻(xiàn)納入本文。本發(fā)明還提供了試劑盒形式的膠束樣顆粒。試劑盒通常包括容器以及一種或多種 本發(fā)明的組合物，附帶它們的使用和給藥說明。在某些實(shí)施方案中，納米顆粒具有已經(jīng)附著 在其表面的靶向基團(tuán)，而在其他實(shí)施方案中，試劑盒包括能夠與使用者選擇的靶向基團(tuán)反 應(yīng)的納米顆粒。使靶向基團(tuán)(如抗體、蛋白質(zhì))附著到外膜單層的脂質(zhì)上的方法是本領(lǐng)域 技術(shù)人員所公知的，試劑盒可以提供這些方法的說明。本發(fā)明的還包括一種化學(xué)綴合物，其包含共價(jià)結(jié)合于脂質(zhì)?；溁蛲榛溎┒说?陽離子聚合物。這樣的綴合物被用于制備MNP以及其他用途，例如制備用在藥品、化妝品、 食品、診斷工具、醫(yī)療設(shè)備及其外包物、以及生物傳感器等商品上的含膠束樣、單層或雙層 結(jié)構(gòu)?；瘜W(xué)綴合物包括一個(gè)或多個(gè)前文所述的陽離子聚合物，如聚乙烯亞胺，所述陽離子聚 合物化學(xué)綴合到兩親脂質(zhì)分子的疏水性末端部分。所述的化學(xué)綴合是共價(jià)鍵，在某些實(shí)施 例中，這樣的鍵在一定條件下，如酸性PH或酶作用下，可以被切斷。例如，綴合物可以通過 1-棕櫚酰-2-壬二酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿與聚乙烯亞胺反應(yīng)制得?；瘜W(xué)綴合物可以與 一個(gè)或多個(gè)核酸分子結(jié)合以形成核酸-聚陽離子_脂質(zhì)復(fù)合物。以下實(shí)施例是為了展示本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)并幫助普通技術(shù)人員制造和使用本發(fā)明。這 些實(shí)施例未計(jì)劃以任何其他方式限制公開的范圍。材料和方法材料除另有說明外，所有材料均購自Sigma-Aldrich。編碼綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì) 粒 DNA(pDNA)終濃度 1 μ g/μ 1，從 Elim Biopharmaceuticals (Hayward, CA)購買。羅丹明 標(biāo)記的 pGFP(pGeneGrip 羅丹明/GFP)從 Genlantis (San Diego, CA)購買。如有必要，根 據(jù)已知方法[17]，用 111In(PerkinElmer Life and Analytical Sciences, MA)放射性標(biāo)記 DNA至0. 1 μ Ci/ μ gDNA。使用0. 8%的瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)濃度和純度。1-棕櫚酰-2-油 酰-sn-甘油-3-磷酸膽堿(POPC) ,1,2- 二硬脂酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺_N_[甲氧基 (聚乙二醇)-2000] (PEG-PE)、膽固醇和氧化的磷脂、1-棕櫚酰-2-壬二酰-sn-甘油-3-磷 酸膽堿(AzPC Ester)從 Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL)購買。分子量 1. 8kDa 的分 支 PEI(bPEI)從 Polysciences，Inc. (Warrington, PA)購買并溶于水中至終濃度 1. 0 μ g/ μ I。磷脂-聚乙烯亞胺綴合物(PLPEI)的合成將12毫克分支PEI (7 μ mol)溶解于0. 5ml氯仿，并與溶解在Iml氯仿中的5毫克
12氧化PC (AzPC Ester 7ymol)混合。推定bPEI的伯仲叔胺的比率為1:2: 1，反應(yīng)混 合物的酸與伯氨之摩爾比為1 10，即包含過量反應(yīng)胺。向上述溶液中加入半毫克N，N-羰 基二咪唑(⑶Ι，3μπι01)以通過形成咪唑衍生物來活化酸。反應(yīng)混合物同IOyLTEA(三乙 胺)一起在室溫下攪拌溫育24小時(shí)。隨后用氮?dú)饬髑宄确拢Ｓ辔镔|(zhì)懸浮在2ml蒸餾水 中。用蒸餾水透析純化(MWC02，000)純化產(chǎn)物，凍干后通過1H-NMR(⑶Cl3，300MHz)確認(rèn)結(jié) 構(gòu)。從匪Ri普(δ 0. 9 2. 7Η, δ 1. 3 :17· 6Η, δ 1. 6 :5· 4Η, δ 2. 4-2. 8 :96· 0Η, δ 3. 3 :12· 8Η, δ 3. 6 :1. 58Η, δ 4. 0-4. 6 :5· 43Η)上 PEI 主鏈的亞乙基(-CH2CH2-)信號(hào)(2. 4-2. 8ppm)與 磷脂頭部的甲基("CH3)信號(hào)(3. 4ppm)之比確定，綴合程度為=PEI對(duì)脂質(zhì)摩爾比，1 1 0。 PLPEI綴合物以1. 5 μ g/ μ 1的濃度溶于水中(PEI為1. 0 μ g/ μ 1)。質(zhì)粒DNA與PLPEI的結(jié)合固定量的質(zhì)粒DNA(100 μ g)與不同量的PLPEI分別溶解在HBG中(lOmMHEPES，5% d-葡萄糖，pH 7. 4)至終體積250 μ L。PLPEI溶液隨后在漩渦攪拌中被快速加入到DNA溶 液中。得到的聚合物/DNA復(fù)合物在E-凝膠電泳系統(tǒng)(Invitrogen Life Technologies) 中使用瓊脂糖凝膠電泳分析。預(yù)制的0. 8%的E-凝膠板在60V，500mA下預(yù)電泳2分鐘，隨 后加入IygW PDNA。推定PEI每個(gè)含有一個(gè)氨基的重復(fù)單元為43. lg/mol,DNA每個(gè)含有 一個(gè)磷酸的重復(fù)單元為330g/mol，計(jì)算所需氨基/磷酸比(N/P)。包被DNA的膠束樣納米顆粒(MNP)的制備使用PLPEI POPC 膽固醇PEG_PE(4 3 3 0. 3，mol/mol)和 pDNA 構(gòu)建 MNP。首先，N/P比為10的PLPEI (PEI 130 μ g)和質(zhì)粒DNA (100 μ g)分別溶解在HBG中至 終體積250 μ L0 PLPEI溶液隨后在漩渦攪拌中被快速加入到DNA溶液中。另外由P0PC，膽 固醇和PEG-PE (42 μ g，21 μ g，15 μ g 3:3: 0. 3mol/mol)的混合物制備干燥的脂質(zhì)膜，然 后用500 μ LHBG水合。所得脂質(zhì)懸液與制備好的PLPEI/DNA復(fù)合物在室溫下溫育24小時(shí)。 也可將PLPEI/DNA復(fù)合物直接加入脂膜中。得到的MNP懸液4°C保存?zhèn)溆?。大小禾?zeta電位將MNP溶解在HBG中至最佳的散射強(qiáng)度。流體力學(xué)直徑和zeta電位使用Zeta Plus Particle Analyzer (Brookhaven Instruments Corp, Santa Barbara, CA) ffliiill電H^l寸 法測定。散射光在23°C下以90度角測定。數(shù)據(jù)分析采用0. 933mPa的粘度值和1. 333的折 射率。該儀器用乳膠微球懸浮液(0. 09μπι，0. 26μπι ;Duke Scientific Corp，Palo Alto, CA, USA)進(jìn)行常規(guī)校準(zhǔn)。冷凍斷裂電子顯微鏡MNP使用三明治技術(shù)和液氮冷卻的丙烷冷激斷裂。冷卻速度為10，000K/sec,以避 免冰晶形成和其他冷凍固定過程中的人工假象artifacts)。斷裂過程在JEOL JED-9000 冷凍蝕刻機(jī)上進(jìn)行，暴露的斷裂面以25-35度角噴鍍鉬30秒，噴鍍碳35秒[2kV，60_70mA， IxlO^torrdtorr = 133Pa)]。復(fù)膜(replicas)用發(fā)煙硝酸清洗24-36小時(shí)，然后與新鮮 的氯仿/甲醇[1 1 (vol/vol)]重復(fù)攪拌至少5次，使用JEOL 100CX電子顯微鏡觀察?？果}誘導(dǎo)的聚集的穩(wěn)定性通過測定MNP的大小(流體動(dòng)力學(xué)直徑)來研究MNP顆粒對(duì)抗鹽誘導(dǎo)的聚集的膠 體穩(wěn)定性。按前文所述方法測定大小，向MNP的HBG溶液中加入NaCl (5M)至終濃度0. 15M。核酸酶耐受性
通過在37°C下使用 50 單位的 DnaseI (Promega Corp.，Madison, WI)處理樣品 30 分鐘測定MNP顆粒中DNA分子的核酸酶耐受性。使用終濃度5mM的EGTA和EDTA來終止反 應(yīng)。使用肝素(50單位/ygDNA)37°C下解離DNA，30分鐘，產(chǎn)物在0.8%的預(yù)制瓊脂糖凝膠 上進(jìn)行分析。毒性檢測成纖維細(xì)胞NIH/3T3在96孔板中用添加了 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。通過換 之以不含血清的、包含直至最高IOOyg. ml PEI的梯度稀釋培養(yǎng)基替(100 μ 1)來處理細(xì) 胞。溫育4小時(shí)后，使用PBS清洗細(xì)胞兩次并將細(xì)胞再置于完全培養(yǎng)基中(100 μ 1)。溫育 24 小時(shí)后，向每個(gè)孑L中力口入 20 μ 1 CellTiter 96 Aqueous One solution 溶液(Promega, Madison, WI)，并將平板再溫育2小時(shí)。使用96孔板讀取器(Multiscan MCC/340, Fisher Scientific Co)讀取490nm處每個(gè)孔的光吸收。將只用培養(yǎng)基處理的細(xì)胞作為對(duì)照計(jì)算相 對(duì)細(xì)胞存活率。藥代動(dòng)力學(xué)特征和生物學(xué)分布根據(jù)東北大學(xué)(Northeastern University)的教研用動(dòng)物護(hù)理和使用管理委員 ^ (the Institutional Animal Care and Use Committee) fttif 白勺力胃，H個(gè)生 balb/c/]、H (20-30g)使用氯胺酮/ 二甲苯胺噻嗪(lmg/0. 2mg/每只動(dòng)物)保持麻醉狀態(tài)，用PE-10通 過右側(cè)頸動(dòng)脈逆行插管。通過尾靜脈注入攜帶111In-DNA( 2yCimIn，20ygDNA)的MNP。 通過頸總動(dòng)脈插管，在靜脈推注后1、2、5、10、30、60分鐘采集血液樣品(30 μ 1)。根據(jù)取樣 量給動(dòng)物回補(bǔ)同體積的含肝素的PBS(10U/ml)。在第60分鐘的最后一次采血后，采用頸椎 脫位法處死動(dòng)物并進(jìn)行器官(肺、肝、脾、腎、肌肉、皮膚)取樣。使用Y-計(jì)數(shù)器測量血液和 器官樣品的放射性。用相對(duì)于注射劑量的百分?jǐn)?shù)來表示放射性(器官％ ID/g，血液％ ID/ ml)。根據(jù)對(duì)應(yīng)器官的血流量修正器官分布值。將血液“濃度對(duì)時(shí)間”數(shù)據(jù)擬合入雙指數(shù)等 式(c(t) = A*e_°t+B*e_et)測定藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。體內(nèi)基因表達(dá)根據(jù)東北大學(xué)教研用動(dòng)物護(hù)理和使用管理委員會(huì)批準(zhǔn)的方案，實(shí)驗(yàn)前14天，雄性 C57BL/6小鼠(Charles River Laboratories)在左肋下皮下接種1 X IO6LLC腫瘤細(xì)胞。通 過尾靜脈注射200 μ 1含40 μ g的pGFP的MNP。將有同樣大小腫瘤的未接受注射的小鼠作 為陰性對(duì)照。被麻醉的小鼠在48小時(shí)后頸椎脫位處死，切下的腫瘤馬上冷凍在Tissue-Tek OCT 4583 compound (Sakura Finetek, CA)中，不固定，用恒冷切片機(jī)制成8 μ m厚的切片。 使用熒光顯微鏡(Olympus BX51)觀察GFP熒光。實(shí)施例1膠束樣納米顆粒(MNP)的制備制備膠束樣納米顆粒(MNP)將質(zhì)粒DNA和PLPEI形成復(fù)合物，而后用包含PEG-磷 脂酰膽堿綴合物(PEG-PE)的脂質(zhì)單層包裹以上已制備好的復(fù)合物(圖1)。對(duì)于形成復(fù)合 物的過程，由于復(fù)合物的形成將阻止DNA的遷移，將其保留在孔中，PLPEI與DNA的最佳比 率根據(jù)完全抑制DNA在瓊脂糖凝膠上遷移所需的胺量來確定。一定量的質(zhì)粒DNA與不同胺 /磷比(N/P)的PLPEI混合，并以瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。被結(jié)合DNA的比率隨著N/P 比的升高而上升，N/P比高于6時(shí)，絕大多數(shù)DNA被結(jié)合。對(duì)比PLPEI的復(fù)合情況和非修飾 PEI的可見，與脂綴合沒有降低PEI結(jié)合DNA的能力(圖2a)。選擇所有DNA都與復(fù)合物結(jié)
14合的N/P比10用于下面的步驟。包被PLPEI/DNA 復(fù)合物時(shí)，包括 P0PC、膽固醇、PEG-PE(3 3 0. 3mol/mol)的 游離脂質(zhì)混合物單獨(dú)制備成水懸液。該脂質(zhì)懸液隨后與制備好的PLPEI/DNA復(fù)合物一起溫 浴，在PLPEI脂質(zhì)基團(tuán)和游離脂質(zhì)間的疏水相互作用的驅(qū)動(dòng)下自發(fā)形成外膜，通常是單分 子層。游離脂質(zhì)的最佳量根據(jù)能為制備好的PLPEI/DNA復(fù)合物提供完整脂質(zhì)單層外膜所 需脂分子數(shù)量來估算。推定直徑約50nm的雙層脂質(zhì)體包含約25，000個(gè)脂分子[18，19]， PLPEI/DNA核心的質(zhì)量/體積比為lg/ml，計(jì)算出約需要總量0. 2 μ mol的脂質(zhì)來覆蓋直徑 50nm、總質(zhì)量230 μ g的核心顆粒的整個(gè)表面，即需要總量1 μ mol的脂質(zhì)來覆蓋總質(zhì)量1毫 克的核心顆粒的整個(gè)表面。因此，除非另外說明，100μ gDNA與對(duì)應(yīng)于131 μ g(0. 08 μ mol) PEI 和 49 μ g (0· 08 μ mol) PL 的 180 μ gPLPEI 形成復(fù)合物，隨后與 42 μ g (0. 055 μ mol) POPC, 21 μ g(0. 055 μ mol)膽固醇和 15μ g(0. 005 μ mol)PEG-PE —起溫浴。在熒光顯微鏡下，熒光標(biāo)記的DNA(Rh-DNA)和熒光標(biāo)記的游離脂質(zhì)(CF-PEG-PE) 同址定位證實(shí)游離脂質(zhì)與PLPEI/DNA復(fù)合物相互作用并進(jìn)入其中(未顯示)。冷凍斷裂透 射電子顯微鏡(fTTEM)清楚地確認(rèn)了特征性的硬核帶單分子層外膜結(jié)構(gòu)0。fTTEM顯示平 均直徑50nm的良好的球形顆粒(圖2b)。所有顆粒顯示出含“硬核”顆粒膠束典型的結(jié)構(gòu) 后方陰影。這種表現(xiàn)與雙分子層結(jié)構(gòu)如脂質(zhì)體的斷裂表現(xiàn)不同，雙分子層結(jié)構(gòu)顯示出凹凸 斷裂面(陰影分別在結(jié)構(gòu)前方和后方)。實(shí)施例2MNP的理化特征傳統(tǒng)的PEI/DNA復(fù)合物在高鹽生理?xiàng)l件下傾向于快速聚集[8]。為展示脂質(zhì)外膜 對(duì)抗鹽導(dǎo)致的聚集的穩(wěn)定效果，向復(fù)合物制劑中加入NaCl至終濃度0. 15M，監(jiān)測流體力學(xué) 直徑。一如所料，加入NaCl后PEI/DNA復(fù)合物迅速聚集，24小時(shí)內(nèi)流體力學(xué)直徑持續(xù)增加 至近20倍。不含游離脂質(zhì)和PEG-PE的PLPEI/DNA復(fù)合物中間體在加入NaCl后，直徑迅速 增加2倍，而后在24小時(shí)內(nèi)保持相對(duì)恒定。與之相比，加入鹽后，MNP保持穩(wěn)定，24小時(shí)內(nèi) 沒有明顯的聚集(圖3a)。Zeta電位測量顯示，MNP有一個(gè)-2. 1 士0. 86mV (平均士 s. e. m.，η = 5)的有利的 中性表面電荷0，而PEI/DNA復(fù)合物有一個(gè)20. 2士1.38mV(平均士s. e.m.，n = 5)的更有 毒性的正表面電荷()。MNP的中性表面電荷也表明了脂質(zhì)層的存在，該脂質(zhì)層為無該脂質(zhì) 層時(shí)呈正電的PEI/DNA核心提供了電荷屏蔽保護(hù)。所帶DNA被完全保護(hù)而未受酶降解的作用進(jìn)一步表明了脂質(zhì)層的存在。游離DNA 完全被酶處理降解，而PEI/DNA或MNP中的DNA保持完整?？赡苁怯捎诿傅母蓴_，酶處理后， 完整DNA的遷移被輕度阻滯。完整DNA的定量分析(Image，NIH)顯示，從MNP回收了 93% 的所帶DNA，相比之下，從PEI/DNA中僅可以回收70 %，證明DNA被完全包封在脂質(zhì)膜內(nèi)(圖 3b)。我們還評(píng)估了 MNP對(duì)NIH/3T3細(xì)胞的毒性。PEI濃度100 μ g/ml時(shí)，處理4小時(shí)后 溫育24小時(shí)，MNP表現(xiàn)為無毒，與之對(duì)比鮮明的是，在PEI濃度15 μ g/ml時(shí)，PEI/DNA復(fù)合 物就表現(xiàn)為高毒性(圖4)。由于數(shù)據(jù)顯示了相比PEI/DNA復(fù)合物表面的強(qiáng)正電荷，MNP帶 中性表面電荷，這個(gè)結(jié)果看起來相當(dāng)容易理解。實(shí)施例3
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體內(nèi)生物分布和基因表達(dá)為顯示MNP在血液中延長的循環(huán)時(shí)間以及由此帶來的將其輸送到靶器官如腫瘤 的更高的可行性，在小鼠中用攜帶111In-DNA的MNP進(jìn)行了藥代動(dòng)力學(xué)和生物分布的研究。 靜脈推注攜帶111In-DNA的MNP后，測量了主要器官的放射性并與對(duì)照PEI/mIn-DNA進(jìn)行對(duì) 比。10分鐘后，多達(dá)30% ID/ml的MNP仍在血液中，相比之下，PEI/DNA約10% ID/ml。注 射后1小時(shí)，約20% ID/ml的MNP仍在血液中，而在循環(huán)中僅能檢測到約5% ID/ml的PEI/ DNA (圖 5A)。相對(duì)于PEI/DNA，MNP包裹DNA較慢的清除以及由此帶來的循環(huán)時(shí)間延長還得到了 藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)的確認(rèn)。通過將收集至60分鐘的血液濃度數(shù)據(jù)導(dǎo)入二室模型計(jì)算半衰期 (t1/2e)，發(fā)現(xiàn)半衰期約為239分鐘，PEI/DNA復(fù)合物則為33分鐘。從“濃度對(duì)時(shí)間”曲線得 到的曲線下面積(AUC)也說明了相比PEI/DNA復(fù)合物，MNP包裹質(zhì)粒DNA的全身性利用率 增加(1404% ID · min/ml對(duì)530% ID · min/ml)。循環(huán)時(shí)間延長的原因是RES吸收導(dǎo)致的 清除減少。對(duì)照復(fù)合物中DNA主要積累在RES器官中(肝40% ID/g和脾30% ID/g)，MNP 中的DNA繞過了 RES器官，在其中的積累明顯減少(肝和脾少于5% ID/g)(圖5b)。兩者 合計(jì)，長循環(huán)時(shí)間和RES位置的低積累使MNP適合體內(nèi)應(yīng)用。用LLC腫瘤小鼠表明了增強(qiáng)的基因輸送以及轉(zhuǎn)染體內(nèi)目標(biāo)(如腫瘤)的能力，這 是長循環(huán)藥物納米載體由通透性和保留增強(qiáng)(EPR)介導(dǎo)的被動(dòng)積累的適宜特征。靜脈注射 攜帶編碼綠色熒光蛋白(GFP)的質(zhì)粒DNA的MNP后，觀察腫瘤組織中的基因表達(dá)。注射后 48小時(shí)，使用MNP處理過的動(dòng)物的腫瘤中觀察到明亮的熒光，而對(duì)照小鼠的腫瘤中沒有觀 察到熒光(圖6)。由于動(dòng)物存活時(shí)間短，沒有觀察注射PEI/DNA復(fù)合物的動(dòng)物的腫瘤組織 中的基因表達(dá)。靜脈注射可比劑量的PEI/DNA復(fù)合物后，動(dòng)物在30分鐘內(nèi)由于呼吸衰竭死 亡，進(jìn)一步確認(rèn)了 MNP明顯降低的毒性。綜合來看，血液循環(huán)時(shí)間延長和RES位置的低積累使得MNP在腫瘤部位顯著積累， 引起報(bào)告基因的強(qiáng)表達(dá)。MNP的這些特性使其適用于體內(nèi)基因治療。實(shí)施例4攜帶siRNA的MNP的制備制備攜帶siRNA的MNP像制備含DNA的MNP —樣，與DNA相同，siRNA首先以相同 的N/P比10與PLPEI結(jié)合。選定量的siRNA與N/P比達(dá)10所需量的PLPEI混合。注意， 可以用等量的反義寡核苷酸替代siRNA以制備攜帶反義核酸的MNP。由此形成的siRNA/ PLPEI復(fù)合物被用于以下步驟。包括P0PC、膽固醇、PEG2000-DSPE(3 3 0. 3mol/mol)的游離脂質(zhì)混合物被單 獨(dú)制備成水懸液。游離脂懸液隨后與制備好的PLPEI/DNA復(fù)合物一起溫浴。推定siRNA/ PEI復(fù)合物核心的質(zhì)量/體積比為lg/ml，約需要總量0. 2μπι01的脂質(zhì)以覆蓋直徑50nm、總 質(zhì)量230 μ g的核心顆粒的整個(gè)表面，即需要總量1 μ mol的脂質(zhì)以覆蓋總質(zhì)量1毫克的核 心顆粒的整個(gè)表面。選擇PEG-PE的量，即，IOmol %游離脂質(zhì)和4. 3mol%磷脂，以促進(jìn)游離脂質(zhì)進(jìn)入制 備好的復(fù)合物并為最終結(jié)構(gòu)提供立構(gòu)穩(wěn)化作用。與制備好的PLPEI/DNA復(fù)合物共同溫浴 時(shí)，包括游離脂和綴合脂的總脂中PEG-PE含量降至4. 3mol%，此時(shí)以層狀相為主。最終的 結(jié)構(gòu)是空間穩(wěn)定的膠束樣硬核顆粒，具有一個(gè)siRNA/PEI復(fù)合物核心和脂質(zhì)單層外膜。
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使用熒光顯微鏡，根據(jù)熒光標(biāo)記游離脂(CF-PEG2000-DSPE)和熒光標(biāo)記的 siRNA(Cy5-siRNA)的同址定位確認(rèn)游離脂與siRNA/PLPEI復(fù)合物相互作用并進(jìn)入其中。通 過冷凍斷裂透射電子顯微鏡(ffTEM)確認(rèn)了特征性的帶脂質(zhì)單層包被的硬核結(jié)構(gòu)。參考文獻(xiàn)[1]0. Boussif,F. Lezoualc' h,M. A. Zanta,M. D. Mergny,D. Scherman,B. Demeneix, J.P.Behr, A versatile vector for gene and oligonucleotide transfer into cells in culture and in vivo :polyethylenimine (在培養(yǎng)物和活體內(nèi)轉(zhuǎn)移基因和寡核苷 酸的多功能載體聚乙醇胺).Proc Natl Acad Sci U S(美國科學(xué)院院刊)A 92(16) (1995)7297-7301.[2] A. Akinc , M. Thomas , Α. Μ. Kl ibanov , R. Langer , Exploring ροlyethylenimine-mediated DNA transfection and the proton sponge hypothesis (石if 究聚乙醇胺介導(dǎo)的DNA轉(zhuǎn)染和質(zhì)子海綿機(jī)制).J Gene Med (基因醫(yī)學(xué)期刊)7 (5) (2005)657-663.[3]R. Kircheis, L. ffightman, E. Wagner, Design and gene delivery activity of modified polyethylenimines (修飾的聚乙醇胺的設(shè)計(jì)及其基因轉(zhuǎn)移活性).Adv Drug Deliv Rev (先進(jìn)藥物輸送系統(tǒng)評(píng)價(jià))53 (3) (2001)341-358.[4] S. V. Vinogradov, Ε. V. Batrakova, Α. V. Kabanoν, Nanogels for oligonucleotide delivery to the brain(將寡核苷酸輸送至腦部的納米凝 膠)· Bioconjug Chem (生物結(jié)合化學(xué))15(1) (2004)50-60.[5]A. Kichler, Gene transfer with modified polyethylenimines (使用修飾的 聚乙醇胺的基因轉(zhuǎn)移).J Gene Med(基因醫(yī)學(xué)期刊)6 Suppll (2004) S3-I0.[6]S. Brunner, E. Furtbauer, T. Sauer, M. Kursa, E. Wagner, Overcoming the nuclear barrier :cell cycle independent nonviral gene transfer with linear polyethylenimine or electroporation(克服核酸障礙使用線性聚乙醇胺或電穿孔進(jìn)行 的獨(dú)立于細(xì)胞周期的基因轉(zhuǎn)移).Mol Ther (分子治療)5(1) (2002)80-86.[7]T. Merdan,J. Kopecek,T. Kissel,Prospects for cationic polymers in gene and oligonucleotide therapy against cancer (陽離子聚合物在基因禾口寡核昔酸抗癌治 療中的前景).Adv Drug Deliv Rev (先進(jìn)藥物輸送系統(tǒng)評(píng)價(jià))54 (5) (2002)715-758.[8] M. Neu, D. Fischer, Τ. Kissel, Recent advances in rational gene transfervector design based on poly (ethylene imine)and its derivatives (基 于聚乙醇胺及其衍生物的基因轉(zhuǎn)移載體設(shè)計(jì)進(jìn)展).J Gene Med (基因醫(yī)學(xué)期刊)7 (8) (2005)992-1009.[9]D. Oupicky, M.Ogris, L. W. Seymour, Development of long-circulating polyelectrolyte complexes for systemic delivery ofgenes (用于基因全身輸送的長循 環(huán)聚電解質(zhì)復(fù)合物的發(fā)展).J Drug Target (藥物靶向期刊)10(2) (2002)93-98.[10] S. M. Moghimi, A. C. Hunter, J. C. Murray, Long-circulating and target-specific nanoparticles :theory to practice (長循環(huán)禾口革巴特異性的納米顆粒 從理論到實(shí)踐)· Pharmacol Rev (藥理學(xué)評(píng)價(jià))53 (2) (2001) 283-318.[11]M. Ogris, S. Brunner, S. Schuller, R. Kircheis, Ε. Wagner, PEGylatedDNA/
17transferrin-PEI complexes :reduced interaction with blood components, extended circulation in blood and potential for systemic gene delivery (PEG化DNA/轉(zhuǎn)鐵蛋 白復(fù)合物減少與血液組分的相互作用，延長在血液中的循環(huán)時(shí)間并具有全身基因輸送的 潛力)· Gene Ther (基因治療)6 (4) (1999) 595-605.[12]H. Petersen, P. Μ. Fechner, A. L. Martin, K. Kunath, S. Stolnik, C. J. Roberts, D. Fischer, Μ. C. Davies, Τ. Kissel, Polyethylenimine-graft-poly (ethylene glycol) copolymers influence of copolymer block structure on DNA complexationand biological activities as gene delivery system(聚乙酉享胺-接-聚(乙二酉享)共聚物 共聚物阻塞DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)的影響以及作為基因輸送系統(tǒng)的生物活性).Bioconjug Chem (生 物結(jié)合化學(xué))13 (4) (2002) 845-854.[13] D. Finsinger, J. S. Remy, P. Erbacher, C. Koch, C. Plank, Protective copolymers for nonviral gene vectors -synthesis， vector characterization and application in gene delivery (用于非病毒基因載體的保護(hù)性共聚物合成，載體特征和 在基因傳遞中的應(yīng)用).Gene Ther (基因治療)7 (14) (2000) 1183-1192.[14] Y. Yamazaki, M. Nango, M. Matsuura, Y. Hasegawa, M. Hasegawa, N. Oku, Polycation liposomes, a novel nonviral gene transfer system, constructed from cetylated polyethylenimine (聚陽離子脂質(zhì)體一種由軟脂酸聚乙醇胺構(gòu)建的新型非病 毒基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)).Gene Ther (基因治療)7 (13) (2000) 1148-1155.[15]D. A. Wang, Α. S. Narang, Μ. Kotb, Α. 0. Gaber, D. D. Miller, S. W. Kim, R. I.Mahato, Novel branched poly (ethylenimine)-cholesterol water-soluble lipopolymers for gene delivery (用于基因轉(zhuǎn)移的新型分枝狀聚(乙醇胺)-膽固醇水溶 性脂質(zhì)聚合物).Biomacromolecules (生物大分子)3 (6) (2002) 1197-1207.[16] J. Heyes, L Palmer，K. Chan，C. Giesbrecht，L Jeffs，I. MacLachlan，Lipid encapsulation enables the effective systemic delivery of polyPlex plasmid DNA(脂質(zhì)包埋使質(zhì)粒DNA多聚物有效的進(jìn)行全身傳遞).Mol Ther (分子治療)15 (4) (2007)713-720.[17]M. Nishikawa, Τ. Nakano, Τ. Okabe, N. Hamaguchi, Y. Yamasaki, Y. Takakura, F. Yamashita, Μ. Hashida, Residualizing indium-lll—radiolabel forplasmid DNA and its application to tissue distribution study (剩余化質(zhì)粒 DNA 銦-111-放射性標(biāo) 記·及其在組織分布中的應(yīng)用).Bioconjug Chem(結(jié)合化學(xué))14(5) (2003)955-961.[18]F. J. Hutchinson, S. Ε. Francis, IG. Lyle, Μ. N. Jones, The characterisation of liposomes with covalently attached proteins (共價(jià)連接蛋白的月旨質(zhì)體的特 性).Biochim Biophys Acta (生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào))978 (1) (1989) 17-24.[19] C. B. Hansen, G. Y. Kao, Ε. H. Moase, S. Zalipsky, Τ. Μ. Allen, Attachment of antibodies to stericaly stabilized liposomes !evaluation, comparision and optimization of coupling procedures (將抗體連接到空間穩(wěn)定化的脂質(zhì)體上評(píng)價(jià)、 比較和連接過程的優(yōu)化).Biochimica et biophysica Acta(生物化學(xué)與生物物理學(xué) 報(bào))1239 (2) (1995) 133-144.[20]M. C. ffoodle,D. D. Lasic, Sterically stabilized liposomes (空間穩(wěn)定化的脂質(zhì)體).Biochim Biophys Acta (生物化學(xué)與生物物理學(xué)報(bào))1113 (2) (1992) 171-199.[21]T. Reschel, C. Konak, D. Oupicky, L. W. Seymour, K. Ulbrich, Physical properties and in vitro transfection efficiency of gene delivery vectors based oncomplexes of DNA with synthetic polycations (基于 DNA 禾口合成聚陽離子復(fù)合物的 基因轉(zhuǎn)移載體的物理特征以及體外轉(zhuǎn)染效率).J Control Release (控釋學(xué)期刊)81 (1_2) (2002)201-217.[22]D. Fischer, B. Osburg, H. Petersen, Τ. Kissel, U. Bickel, Effect of poly (ethylene imine)molecular weight and pegylation on organ distribution and pharmacokinetics of polyplexes with oligodeoxynucleotides in mice(聚(乙酉享胺) 分子量和PEG化在器官分布中的效果以及與寡聚脫氧核苷酸形成的多聚物在小鼠中的藥 物動(dòng)力學(xué)).Drug Metab Dispos (藥物代謝和處置)32 (9) (2004)983-992.[23]K. Kunath, A. von Harpe, H. Petersen, D. Fischer, K. Voigt, Τ. Kissel, U.Bickel，The structure of PEG-modified poly (ethylene imines)influences biodistribution and pharmacokinetics of their complexes with NF—kappaB decoy in mice(PEG修飾的聚(乙醇胺)的結(jié)構(gòu)影響與NF-kappaB decoy形成的復(fù)合物在小鼠中 的生物分布和藥物動(dòng)力學(xué)).Pharm Res (藥物研究)19 (6) (2002)810-817.[24]M. Neu, 0. Germershaus，M.Behe，Τ. Kissel, Bioreversibly crosslinked polyplexes of PEI and high molecular weight PEG show extended circulation times in vivo (和高分子量PEG生物可逆交聯(lián)多聚物顯示出延長的體內(nèi)循環(huán)時(shí)間).JControl Release (控釋學(xué)期刊)124 (1-2) (2007) 69-80.[25]M. Johnsson, K. Edwards, Liposomes, disks，and spherical micelles aggregate structure in mixtures of gel phase phosphatidylcholines and poly (ethylene glycol)-phospholipids (脂質(zhì)體、盤和球狀膠束膠相軟磷脂和聚(乙二 醇)混合物中的聚集結(jié)構(gòu)).Biophys J (生物物理學(xué)期刊)85 (6) (2003)3839-3847·[26]G. Montesano, R. B artucci，S. B elsito，D. Marsh, L. Sportelli, Lipid membrane expansion and micelle formation by polymer—grafted lipids scaling with polymer length studied by spin-label electron spin resonance (通過連接聚合物月旨 質(zhì)的脂質(zhì)膜擴(kuò)展和膠束形成通過旋轉(zhuǎn)標(biāo)記電子自旋共旋研究測量聚合物長度).Biophys J (生物物理學(xué)期刊)80(3) (2001) 1372-1383.[ 2 7 ] K. Sou，T. Endo，S. Takeoka，E . Tsuchida，Poly (ethylene glycol)-modification of the phospholipid vesicles by using the spontaneous incorporation of poly (ethylene glycol) -lipid into the vesicles (使用自發(fā)納入聚 (乙二醇)進(jìn)行的磷脂質(zhì)泡囊的聚(乙二醇)修飾).BiOCOnjUg Chem(生物結(jié)合化學(xué))11(3) (2000)372-379.[28] C. L. Gebhart，S. Sriadibhatla，S. Vinogradov , P. Lemieux， V-Alakhov, Α.V.Kabanov, Design and formulation of polyplexes based onpluronic-polyethyleneimine conjugates for gene transfer (基于普、流尼克—聚 乙烯亞胺結(jié)合物的用于基因轉(zhuǎn)移的多聚物的設(shè)計(jì)和形成).Bioconjug Chem(生物結(jié)合化 學(xué))13(5) (2002)937-944.
[29]A. V. Kabanov, Ε. V. Batrakova, V. Y. Alakhov, Pluronic block copolymers as novel polymer therapeutics for drug and gene delivery (作為新型藥物禾口基因 傳遞聚合物治療載體的普流尼克阻滯共聚物)· J Control Release (控釋學(xué)期刊)82 (2-3) (2002)189-212.[30] R. J. Lee, L. Huang, Fo late-targe ted, Anionic Lipo some-en trapped PoIyIysine-condensed DNA for Tumor Cell-specific Gene Transfer(用于月中瘤細(xì)胞 特異性基因轉(zhuǎn)移的葉酸靶向的陰離子脂質(zhì)體包埋的聚賴氨酸-濃縮DNA). Journal of Biological Chemistry (生物化學(xué)期刊)271 (14) (1996)8481-8487.[31]K. Muller, Τ. Nahde, Α. Fahr, R. Muller, S. Brusselbach, Highly efficient transduction of endothelial cells by targeted artificial virus一like particles (通過靶向人工病毒樣顆粒的內(nèi)皮細(xì)胞的高效轉(zhuǎn)導(dǎo)).Cancer Gene Therapy (癌 癥基因治療)8 (2) (2001) 107-117.[32]P. Bandyopadhyay, X. Ma, C. L. Stieers, B. T. Kren, C. J. Steer, Nucleotide Exchange in Genomic DNA of Rat Hepatocytes Using RNA/DNA Oligonucleotides (使 用RNA/DNA寡核苷酸的小鼠肝細(xì)胞染色體DNA核苷酸交換).Journal of Biological Chemistry (生物化學(xué)期刊)274 (15) (1999) 10163-10172.[33] J. J. Wheeler, L. Palmer, M. Ossanlou, I. MacLachlan, R. W. Graham, Y. P. Zhang, M.J. Hope, P.Scherrer, P. R. Cullis, Stabilized plasmid-lipid particles construction and characterization (穩(wěn)定的質(zhì)粒-脂質(zhì)顆粒結(jié)構(gòu)和特征).Gene Ther (基因治療)6 (2) (1999) 271-281.[34] I. MacLachlan, P. Cullis, R.W.Graham, Progress towards a synthetic virus for systemic gene therapy (用于全身基因治療的合成病毒的進(jìn)展)· Curr Opin Mol Ther (分子治療流行觀點(diǎn))1 (2) (1999) 252-259.盡管已經(jīng)結(jié)合優(yōu)選實(shí)施方案描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在閱讀前面的說 明后，能夠?qū)Ρ疚奶岢龅慕M分和方法做出不同的改變、等同形式的替代以及其他變化。因 此，此后專利證書許可的保護(hù)僅由附帶的權(quán)利要求書和其等同形式來限定。
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權(quán)利要求
一種納米顆粒，包含為脂質(zhì)單層所包裹的核心復(fù)合物，所述核心復(fù)合物包含與一個(gè)或多個(gè)陽離子聚合物分子靜電結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)核酸分子，所述陽離子聚合物與脂質(zhì)單層內(nèi)的第一脂質(zhì)共價(jià)綴合。
2.如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中的陽離子聚合物包含直鏈或分支聚乙烯亞胺、 聚鳥氨酸、聚精氨酸、聚賴氨酸、聚丙烯胺、氨基葡聚糖、或它們的任意組合。
3.如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中的第一脂質(zhì)選自由天然的或合成的磷脂、糖脂、 氨基脂、鞘脂、長鏈脂肪酸和留醇組成的組。
4.如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中的脂質(zhì)單層還包含一種或多種非綴合的脂。
5.如權(quán)利要求4所述的納米顆粒，所述一種或多種非綴合磷脂分子選自由天然的或合 成的磷脂、糖脂、氨基脂、鞘脂、長鏈脂肪酸和留醇組成的組。
6.如權(quán)利要求4所述的納米顆粒，其中，一部分非綴合磷脂分子是PEG化的。
7.如權(quán)利要求6所述的納米顆粒，其中的脂質(zhì)單層包含PEG-磷脂酰乙醇胺或 pNP-PEG-PE。
8.如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中的脂質(zhì)單層還包含膽固醇。
9.如權(quán)利要求8所述的納米顆粒，其中脂質(zhì)單層包含摩爾比率為4 3 3的綴合的 第一脂質(zhì)、非綴合的脂和膽固醇。
10.如權(quán)利要求8所述的納米顆粒，還包含PEG-磷脂酰乙醇胺，其中脂質(zhì)單層包含摩爾 比為4 3 3 0.3的綴合的第一脂質(zhì)、非綴合的脂、膽固醇和磷脂酰乙醇胺。
11.如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，所述一個(gè)或多個(gè)核酸分子包括寡核苷酸、DNA分子、 RNA分子或它們的任意組合。
12.如權(quán)利要求11所述的納米顆粒，所述一個(gè)或多個(gè)核酸分子包括質(zhì)粒DNA、RNAi, siRNA、反義寡核苷酸或核酶。
13.如權(quán)利要求11所述的納米顆粒，其中的一個(gè)或多個(gè)核酸分子包括治療性基因。
14.如權(quán)利要求13所述的納米顆粒，其中的治療性基因是細(xì)胞毒性基因或自殺基因。
15.如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中的一個(gè)或多個(gè)核酸分子占所述顆粒重量的最 多 40%。
16.如權(quán)利要求15所述的納米顆粒，其中的一個(gè)或多個(gè)核酸分子約占所述顆粒重量的 25%。
17.如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中的陽離子聚合物共價(jià)連接到所述第一脂質(zhì)的 烷基鏈或?；湹哪┒?br> 18.如權(quán)利要求1所述的納米顆粒，所述顆粒直徑約50nm。
19.包含權(quán)利要求1所述顆粒的非病毒載體。
20.如權(quán)利要求19所述的載體，還包含靶向劑。
21.如權(quán)利要求20所述的載體，其中的靶向劑選自抗體或其抗原結(jié)合片段、單鏈抗體、 域抗體、細(xì)胞表面受體的配體、和生物素組成的組。
22.如權(quán)利要求21所述的載體，其中的靶向劑通過可斷裂的鍵與所述載體相連。
23.如權(quán)利要求22所述的載體，其中可斷裂的鍵在低pH下斷裂。
24.如權(quán)利要求23所述的載體，其中可斷裂的鍵是腙鍵。
25.如權(quán)利要求22所述的載體，其中可斷裂的鍵是連接陽離子聚合物和第一脂質(zhì)分子的鍵。
26.制備權(quán)利要求1所述納米顆粒的方法，所述納米顆粒包含為脂質(zhì)單層所包裹的核 心復(fù)合物，該方法包括(a)提供核酸、陽離子聚合物-脂質(zhì)共價(jià)綴合物和一種或多種非綴合脂質(zhì)；(b)在適合形成核心復(fù)合物的條件下使核酸分子與陽離子聚合物_脂綴合物相接觸， 所述核心復(fù)合物包含與綴合物的陽離子聚合物部分靜電結(jié)合的核酸；和(c)使核心復(fù)合物與非綴合脂質(zhì)接觸以形成脂質(zhì)單分子層。
27.如權(quán)利要求26所述的方法，在步驟(b)中，核酸和陽離子聚合物-脂綴合物在溶液 中相接觸以形成核心復(fù)合物。
28.如權(quán)利要求26所述的方法，其中，提供的非綴合脂質(zhì)呈干燥膜的形式，在步驟(c) 前該干燥膜水合。
29.如權(quán)利要求27所述的方法，其中，提供的非綴合脂質(zhì)呈干燥膜的形式，在步驟(c) 中用步驟(b)得到的水懸液使該干燥膜水合。
30.如權(quán)利要求26所述的方法，還包括在步驟(c)前向非綴合脂質(zhì)中加入一種選自由 中性脂質(zhì)、糖脂、PEG化脂質(zhì)、生物素化脂質(zhì)、?；鞍踪|(zhì)或糖蛋白、與脂質(zhì)綴合的蛋白或糖 蛋白、抗體或其抗原結(jié)合片段、單鏈抗體、域抗體、以及細(xì)胞表面受體的配體組成的組的成 分。
31.如權(quán)利要求30所述的方法，其中，加入了中性脂質(zhì)，該中性脂質(zhì)為膽固醇。
32.如權(quán)利要求30所述的方法，其中，加入了PEG化的脂質(zhì)，PEG化的脂質(zhì)是PEG-磷酸 乙醇胺或pNP-PEG-PE。
33.如權(quán)利要求32所述的方法，其中加入了中性脂質(zhì)，所述中性脂質(zhì)為膽固醇，聚合 物-脂質(zhì)綴合物、非綴合脂質(zhì)、膽固醇和PEG-磷酸乙醇胺的摩爾比為4 3 3 0.3。
34.轉(zhuǎn)染細(xì)胞的方法，該方法包括將細(xì)胞與權(quán)利要求19所述的非病毒載體相接觸，載 體的核酸分子被轉(zhuǎn)入細(xì)胞。
35.抑制細(xì)胞中基因表達(dá)的方法，該方法包括使細(xì)胞與權(quán)利要求1所述的納米顆粒相 接觸，所述納米顆粒中包含siRNA或RNAi，所述siRNA或RNAi被轉(zhuǎn)入細(xì)胞并抑制基因表達(dá)。
36.治療有疾病或癥狀的對(duì)象的方法，該方法包括給予對(duì)象權(quán)利要求19所述的非病毒 載體，其中的核酸被轉(zhuǎn)入對(duì)象的細(xì)胞，以此治療疾病或癥狀。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其中的疾病是癌癥。
38.如權(quán)利要求37所述的方法，其中的載體被靶向腫瘤。
39.一種化學(xué)綴合物，包含與脂質(zhì)的?；溁蛲榛溎┒斯矁r(jià)結(jié)合的陽離子聚合物。
40.如權(quán)利要求39所述的化學(xué)綴合物，包含聚乙烯亞胺。
41.如權(quán)利要求40所述的化學(xué)綴合物，其由1-棕櫚酰-2-壬二酰-sn-甘油-3-磷酸 膽堿與分支聚乙烯亞胺反應(yīng)形成。
42.權(quán)利要求39所述化學(xué)綴合物與核酸的復(fù)合物。
43.一種膠束、脂質(zhì)單層或脂質(zhì)雙層結(jié)構(gòu)，包含權(quán)利要求39所述的綴合物。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含核酸并適合用作體內(nèi)核酸輸送劑的納米顆粒。本發(fā)明納米顆粒使用如聚乙烯和磷脂等聚陽離子共價(jià)綴合物。最終的包含DNA的納米顆粒具有泡狀結(jié)構(gòu)，復(fù)合物核心被混合的脂質(zhì)/PEI-脂質(zhì)單層包裹，其制備簡單，承載能力高，在體內(nèi)穩(wěn)定。本發(fā)明納米顆粒有良好的體內(nèi)穩(wěn)定性和延長的血液循環(huán)時(shí)間，能夠有效地將基因輸送到生物靶位處，如腫瘤。
文檔編號(hào)G01N33/553GK101970687SQ200880115447
公開日2011年2月9日 申請(qǐng)日期2008年11月10日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月9日
發(fā)明者A·凱勒, V·P·托奇林, Y·T·高 申請(qǐng)人:東北大學(xué)