專利名稱：用于聚集顆粒的系統(tǒng)和方法
用于聚集顆粒的系統(tǒng)和方法 相關串i青 本申請要求2008年6月7日提交的美國臨時專利申請第60/924， 998號的優(yōu)先權。
發(fā)明的領域和背景 在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明涉及流式細胞術，更具體但不排他地涉及熒 光激活細胞分選(FACS)。 流式細胞術是用于同時多參數(shù)分析單個細胞的物理和/或化學特征的一種技術。 流式細胞術允許對細胞(或其它微觀顆粒)進行計數(shù)、檢查和分選，并提供單個顆粒的物理 和/或化學特征的多參數(shù)分析。所要分析的細胞向檢查點流動，且該流動被設計成使得顆 粒依次運動到達檢查點，所以每一顆粒被單獨地分析。 —種特定的流式細胞術被稱為熒光激活細胞分選(FACS)。 FACS根據(jù)每一個細胞 的具體光散射和熒光特征，將生物細胞或其它顆粒的多相混合物分選到兩個或更多個容器 中，每一次一個細胞。它是一種有用的科學儀器，因為它提供了來自單個細胞的熒光信號的 快速、客觀且定量的記錄以及有特定興趣的細胞的物理分離。 該技術在許多領域中具有應用，包括分子生物學、病理學、免疫學、植物生物學和 海洋生物學。 例如，在細胞生物學和免疫學的領域中，它與熒光標記抗體一起使用，該熒光標記 抗體與特異性靶細胞結合，并允許定量分析血細胞計數(shù)器中的抗原。該方法廣泛用于研究 蛋白質(zhì)表達和蛋白質(zhì)定位、細胞表面抗原定量(在不同臨床病變例如白血病中的血液細胞 上的CD標記物)、細胞內(nèi)抗原和核抗原(調(diào)節(jié)性T細胞中的轉錄因子如FoxP3的激活)、細 胞活力(通過Annexin/PI染色來定量凋亡細胞)以及其它。 流式細胞術和FACS在醫(yī)學中也具有廣泛應用，尤其是在移植、血液學、腫瘤免疫 學和化療、遺傳學和體外受精(IVF)中的精子分選。 —般，在流動血細胞計數(shù)器中，光束指向流體流，其中顆粒在該流體中一個接一個 排列。許多檢測器指向流體流通過光束的位點。通過光束的每一個懸浮的顆粒以某種方式 (例如散射光)與所述光相互作用，且來自所述顆粒的光被所述檢測器拾取。檢測到的光被 分析，以提供關于每一單個顆粒的物理和化學結構的各種類型的信息。
流動血細胞計數(shù)器通常具有5個主要組件 流動池，其中液體流運載和排列所述細胞，使得它們依次運動通過用于感測的光 束；光源；
檢測器；
放大系統(tǒng)；以及 用于分析放大的檢測信號的計算機。 在流動池中排列顆粒通過將外力施加于顆粒來實現(xiàn)。在市場上可獲得的流動血細 胞計數(shù)器中所使用的施加外力的一種方法在本領域中稱為"鞘流"。其它方法包括將光和超 聲施加于顆粒。
發(fā)明概述 在一些實施方案中，本發(fā)明涉及流式細胞術，更具體但不排他地涉及熒光激活的細胞分選(FACS)。 本發(fā)明的一些實施方案的一個方面涉及排列顆粒，以便它們依次運動例如通過流動血細胞計數(shù)器的光束。 因此，本發(fā)明的一些實施方案的一個方面涉及聚集顆粒的方法，該方法包括 提供顆粒在第一懸浮介質(zhì)中的懸浮液；以及 使該懸浮液沿著具有至少一種小于100 m的截面尺寸的通道流動； 其中所述第一懸浮介質(zhì)具有這樣的粘彈性，以使得所述懸浮液在所述通道中的流
動增加了顆粒在所述通道內(nèi)的聚集區(qū)域中的濃度。 在示例性實施方案中，聚集區(qū)域是在通道的高度的一半處。 在一些實施方案中，所述聚集區(qū)域具有與通道的長度垂直的截面，所述截面具有
與在相同位置的通道的截面相同的形狀，但更小。 可選擇地，所述聚集區(qū)域與所述通道同軸。 在本發(fā)明的一些示例性實施方案中，所述懸浮液包括多種尺寸的顆粒；以及 所述粘彈性使得懸浮液在所述通道中的流動優(yōu)先將較大的顆粒向所述聚集區(qū)域引導。 可選擇地，提供懸浮液包括 獲得所述顆粒在第二懸浮介質(zhì)中的懸浮液；以及 將所述第二懸浮介質(zhì)與所述第一懸浮介質(zhì)交換。 可選擇地，提供懸浮液包括 提供具有各種粘彈性的多種懸浮介質(zhì)； 響應所述介質(zhì)的粘彈性，從所述多種懸浮介質(zhì)中選擇所述第一懸浮介質(zhì)；以及 將顆粒懸浮于所選擇的懸浮介質(zhì)中。 在一些實施方案中，選擇包括響應所述顆粒的尺寸來選擇。 在示例性實施方案中，提供懸浮液包括 將顆粒懸浮于試驗懸浮介質(zhì)中； 使該懸浮液沿著微通道流動，使得該流動懸浮液具有至少一種小于100 m的尺寸； 估計聚集質(zhì)量；以及 改變所述試驗懸浮介質(zhì)的粘彈性，以改進聚集質(zhì)量。 可選擇地，該方法包括 使該懸浮液以一定流速流動； 估計聚集質(zhì)量；以及 增大所述流速以改進聚集質(zhì)量。 可選擇地，增大所述試驗懸浮介質(zhì)的粘彈性包括將高分子量聚合物添加到該懸浮液中。 可選擇地，該通道的深度小于100 ii m。 可選擇地，該通道的寬度小于100 ii m。
可選擇地，該通道具有各自小于100 ii m的深度和寬度。 在一些示例性實施方案中，所述顆粒是細胞。 在一些示例性實施方案中，第二懸浮介質(zhì)包括血清。 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的另一個方面，還提供了用于聚集流動顆粒的系統(tǒng)， 該系統(tǒng)包括 通道，其具有壁和壁之間的底部； 流體源，其包括樣品流體；以及 流體引導系統(tǒng)(fluid direction system)，其被配置成將所述樣品流體從所述流 體源通過入口弓I導入所述通道中， 其中所述樣品流體包括懸浮于液體中的顆粒，所述液體具有粘彈性，該粘彈性減 輕了施加外力場以在聚集區(qū)域聚集顆粒的需要。 在示例性實施方案中，所述聚集區(qū)域是在所述通道的高度的一半處。 根據(jù)一些示例性實施方案，該系統(tǒng)包括 光源，其在所述入口的下游的檢查區(qū)提供與所述聚集區(qū)域傳感連通(sensory communication)的探測光束；以及 檢測器，其被配置成使用探測光束檢測所述檢查區(qū)中的顆粒。 可選擇地，所述顆粒包括細胞。 在一些實施方案中，所述通道具有在5iim和100iim之間的至少一種截面尺寸。 可選擇地，所述至少一種截面尺寸包括與所述通道的底部垂直的截面的尺寸。 可選擇地，所述通道具有底部和壁，且在所述壁之間的距離大于100 iim。 可選擇地，所述系統(tǒng)包括各自具有不同粘彈性的多種流體以及使用每一種流體來
聚集不同尺寸的顆粒的說明書。 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案，提供了一種試劑盒，其包括 多種流體，各自獨立地被包裝在帶有尺寸范圍指示的包裝物中；以及 說明書，其使用所述多種流體中的每一種來聚集指定尺寸范圍的顆粒。 本發(fā)明的一些實施方案的一個方面涉及評價液體的彈性的方法，該方法包括 向介質(zhì)中添加單分散粒度分布的顆粒以獲得懸浮液； 使該懸浮液在具有至少一種100 ii m或更小的截面尺寸的通道中流動； 在顆粒在通道中流經(jīng)給定距離之后獲得顆粒的空間分布；以及 分析所述空間分布以獲得介質(zhì)的彈性。 可選擇地，分析包括響應介質(zhì)的粘度進行分析，且所述方法包括獲得介質(zhì)的粘度。 可選擇地，獲得所述介質(zhì)的粘度包括測定所述介質(zhì)的粘度。 在一些實施方案中，所述顆粒在獲得的懸浮液中的體積分數(shù)是在0.001%和1% 之間。 可選擇地，獲得的懸浮液的體積分數(shù)是0. 1 % 。 根據(jù)本發(fā)明的一些實施方案的一個方面，還提供了一種評價顆粒和粘合劑之間的 相互作用的方法，其包括 將所述顆粒聚集在通道的底部以上的層；以及
使所述聚集的顆粒在固定于所述底部的粘合劑以上流動。 可選擇地，將所述顆粒聚集，使得至少90%的顆粒的中心是在具有小于通道的高 度的一半的厚度的層中。 在一些實施方案中，聚集顆粒包括在根據(jù)本發(fā)明的實施方案的方法中聚集。
在一些實施方案中，評價顆粒和粘合劑之間的相互作用包括進行多次以上方法， 每次用不同深度的通道。 本發(fā)明的一些實施方案的一個方面涉及用于評價顆粒和粘合劑之間的相互作用 的裝置，該裝置包括 多個系統(tǒng)，各自根據(jù)本發(fā)明的實施方案，且所述系統(tǒng)中的至少一個具有通道，該通 道具有固定于所述通道的底部的至少一部分之處的粘合劑。
可選擇地，所述多個系統(tǒng)具有共同的流體源。
可選擇地，所述多個系統(tǒng)具有共同的流體引導系統(tǒng)。 可選擇地，該裝置具有控制器，所述控制器用于在與其它系統(tǒng)獨立的各系統(tǒng)中控 制流體進入通道的流速。 可選擇地，并非所有的通道都具有相同深度。 可選擇地，通道中的每一個具有與所有其它通道不同的深度。 在一些實施方案中，該裝置被配置成在所有的通道中以相同聚集質(zhì)量聚集顆粒。 除非另有規(guī)定，本文所使用的所有技術術語和/或科學術語具有與本發(fā)明所述領
域普通技術人員所普遍理解的含義相同的含義。雖然類似或等同于文中所述的方法和材料
的方法和材料可以用于實施或試驗本發(fā)明的實施方案，但在以下描述了示例性方法和/或
材料。在沖突的情況下，將以包括定義在內(nèi)的專利說明書為準。另外，材料、方法和實施例
僅是示例性的，而不期望必定是限制性的。 附圖簡述 在這里僅僅作為例子參考附圖描述了本發(fā)明的一些實施方案?，F(xiàn)在詳細地具體參 考附圖，強調(diào)所顯示的細節(jié)作為例子，用于示例性論述本發(fā)明的實施方案。在這方面，參考 附圖的說明使本領域技術人員清楚本發(fā)明的實施方案如何實施。
在附圖中

圖1是根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案的聚集顆粒的方法中采取的操作的流 程圖。 圖2A是根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案的用于聚集流動顆粒的系統(tǒng)的示意 圖。 圖2B是根據(jù)本發(fā)明的該實施方案的通道的示意圖。
圖3是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的試劑盒的圖示描述。
圖4A是根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的FACS儀器的示意圖。 圖4B是根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案的測定介質(zhì)的流變性質(zhì)的方法中采取 的操作的流程圖。 圖4C是根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案的研究顆粒_粘合劑相互作用的裝置 的示意圖。 圖5A是顯示8 ii m直徑聚苯乙烯微球在甘油溶液中的PDF(粒度分布函數(shù))實驗值與垂直偏心距離的關系曲線的圖?？招姆枮閷嶒灲Y果。 圖5B是顯示在與圖5A中所述的實驗類似、但用聚乙烯吡咯烷酮(PVP)溶液的實驗中獲得的實驗結果的圖?？招姆枮閷嶒灲Y果。實線是對實驗結果的高斯擬合。
圖6是顯示在雙對數(shù)坐標圖上聚合物溶液PVP (頭朝上三角)和PAA (頭朝下三角)的剛性模量G'與振蕩頻率co的關系曲線的圖。插圖顯示了聚合物溶液的剪切粘度n(方
形)和復數(shù)粘度l*n I (△, V)(三角，如上)分別與Y和"的關系曲線。 圖7是顯示實驗結果(空心符號)和理論預測(實曲線)之間的對比的圖8 m顆粒，PVP溶液(△ ) ;8 ii m顆粒，PAA溶液()；5 ii m顆粒，PAA溶液( )。對應于PAA溶液的理論曲線沒有可調(diào)節(jié)的參數(shù)。 圖8A和8B是顯示懸浮于PAA溶液中的PS微球的PDF與垂直偏心位置的關系曲線的圖?？招姆枮閷嶒灲Y果。圖8A顯示了8iim直徑顆粒的結果；以及圖8B顯示了5iim直徑顆粒的結果。實線用于引導眼睛。 圖9A是在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的給定流動系統(tǒng)中預測給定懸浮介質(zhì)的聚集質(zhì)量的方法900中采取的操作的流程圖。 圖9B是在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的給定流動系統(tǒng)中預測給定懸浮介質(zhì)的聚集質(zhì)量的簡化方法900'中采取的操作的流程圖。
發(fā)明的具體實施方案的描述
綜述 在本發(fā)明的一些實施方案中，本發(fā)明涉及流式細胞術，更具體但不排他地涉及熒光激活細胞分選(FACS)。 —些實施方案提供了使用微觀流體流的顆粒聚集的方法或裝置。 本發(fā)明的一些實施方案可以用一般不認為是微觀流體的通道來實施。用任何給定
尺寸的通道在離開入口的距離x/d可以獲得相同的聚集質(zhì)量，只要以下表達式保持其值 其中a為顆粒的半徑，d為通道最小尺寸的一半，D是流速，以及13和n表示懸浮介質(zhì)的粘彈性。鑒于上述情況，關于放大的可能性的進一步的細節(jié)從以下在標題"理論指導"下提供的理論分析可以清楚看出。 在示例性實施方案中，聚集包括使顆粒在具有減輕對顆粒施加外場以使之聚集的需要的這種粘彈性的懸浮介質(zhì)中流動。 在一些示例性實施方案中，所述顆粒包括細胞，例如血細胞、細菌和/或癌細胞?？蛇x擇地，所述顆粒包括用對可溶性因子如配體、成形受體、抗原和抗體特異的抗體包覆的大分子、囊泡、微珠。盡管如此，術語'顆粒'不必限于這些例子。 在一些示例性實施方案中，所述顆粒在通道內(nèi)部在懸浮介質(zhì)中流動，并且在通道的一定部分中濃縮，這里稱為"聚集區(qū)域"。可選擇地，聚集區(qū)域是在通道的中心，例如在底部的中心從通道垂直延伸的容積中。 應該注意，術語"通道"在這里用于表示具有至少一種小于100iim的尺寸且具有遠遠大于100iim例如lmm、10mm、50mm、100mm、1000mm或任何中間值或長度的長度的任何結
構。在一些實施方案中，通道是在實心體的上表面上的溝槽。在一些實施方案中，通道是管。與通道的長度垂直的通道的截面可選擇地是長方形、正方形、圓形或球形。 長方形或正方形截面的通道可選擇地使用石印術例如軟石印術
(softlithogr即hy)和光刻法來獲得。這類制造方法允許容易且以精確質(zhì)量制造帶有微通
道的實體，例如實驗室芯片(lab-on-chip)。 如果該通道類似地較長且顆粒類似地較大，則聚集質(zhì)量可選擇地用具有較大的最 小尺寸的通道來獲得。如果該通道具有大于lOOym的最小尺寸和顆粒是大約1-10 ym，則
聚集質(zhì)量降低。 在幾個方面，在通道的中心處聚集可以比在通道的其它區(qū)域聚集更有優(yōu)勢。例如， 在通道的中心，流速高于偏心處。因此，在通道的中心處聚集的顆粒流動更快，且可以在更 高的生產(chǎn)量下處理。在另一個例子中，當處理的顆粒為小布朗顆粒，例如小于lPm時，它 們趨向于在流動方向上垂直擴散，且橫向擴散性通過剪切(本領域中被稱為泰勒分散的效 應)來增強。該趨勢在其中剪切速率最小的通道的中心處是最小的，且因此，由于橫向剪切 增強的擴散，顆粒沿著流動方向的更快運動可以用最小的樣品寬度增寬來實現(xiàn)。在另一個 例子中，如果顆粒具有吸附到通道的壁上的趨勢，那么在中心聚集顆粒將它們與壁的相互 作用最小化且降低了吸附/粘附現(xiàn)象。 在本發(fā)明的一些實施方案中，聚集是水平的，S卩，顆粒聚集在接近通道深度的一半 的有限深度的水平區(qū)域。水平聚集可以是有利的，例如，當顆粒要可選地用定位在通道以 上的光學裝置進行光學分析時。在這些情況下，水平聚集可以使得所有顆粒處在光學分析 儀的焦點內(nèi)，這允許與顆粒垂直聚集的情況所允許的相比更快地分析顆粒。本發(fā)明的一些 實施方案實際上與重力無關。雖然如此，因為在一些實施方案中顆粒使用光束分析，把術語 "水平"和"垂直"解釋為表示與光束成直線是方便的，例如界定光束沿著垂直方向到達。
當通道的垂直尺寸(即通道的高度)為100i!m或更小時，可選擇地獲得了水平聚 集。 在一些實施方案中，聚集是在垂直方向上，S卩，顆粒在與通道的底部垂直、在通道 的寬度的大約一半的聚集區(qū)域中濃縮。當通道的水平尺寸(即通道的寬度)為大約lOOym 或更小時，可選擇地獲得了垂直聚集。 在一些實施方案中，在顆粒流動離開通道的底部和上壁以及也流動離開通道壁、 并且在不延伸至接觸任何通道壁的容積中濃縮的意義上，發(fā)生了三維(3-D)聚集。用具有 大約100 ii m或更小的高度和寬度的通道可選擇地獲得了二維聚集。 可選擇地，在其一維中用100iim或更小的通道獲得三維聚集，在另一維中聚集通 過其它方法獲得，所述其它方法同樣不必按照本發(fā)明的實施方案，例如鞘流聚集，也稱為流 體動力聚集(hydrodyn咖ic focusing)。 可選擇地，鞘流聚集或其它已知的聚集方法與粘彈性聚集結合使用。 在一些實施方案中，聚集的顆粒排成一行，任選一個接一個，使得顆粒的很大一部
分的中心是在具有大約與所述顆粒的典型半徑相同的半徑的圓柱體內(nèi)。在一些實施方案
中，這種聚集明顯減小了顆粒的縱向彌散且獲得了更高生產(chǎn)量。改進的生產(chǎn)量可能是因為
顆粒聚集在中心，其中壓力驅(qū)動的流動的速度預計是最大的。 可選擇地，所述很大一部分是顆粒的90%或更高，可選擇地超過95%，可選擇地 超過99%。
可選擇地，圓柱體的半徑小于顆粒典型半徑的120% 。 在非球形顆粒的情況下，所述顆粒典型尺寸對應顆粒的最小尺寸。例如，具有l(wèi)ym 直徑的底部和10ym高度的圓柱形顆粒與liim直徑的球形顆粒類似地聚集。
在本發(fā)明的示例性實施方案中，聚集顆粒的方法包括使所述顆粒的懸浮液在具有 至少一種小于lOOym的尺寸的長通道中流動。 可選擇地，在使所述顆粒向前流動相對短的距離之后發(fā)生了顯著的聚集。例如，在 使顆粒向前流動10cm或更小例如在5cm、2cm或lcm之后，能夠發(fā)生90%的顆粒聚集在在具 有比所述顆粒半徑大20 %的半徑的圓柱體內(nèi)。 在一個示例性實施方案中，該懸浮液包括顆粒和懸浮介質(zhì)，且該懸浮介質(zhì)被選擇 和/或控制為具有導致所需聚集的粘彈性，并減輕對流動懸浮液施加外場以獲得聚集的需 要。 在本發(fā)明的一些示例性實施方案中，該懸浮介質(zhì)在通道內(nèi)的所有地方具有相同的 密度?？蛇x擇地，聚集不需要密度梯度。 控制懸浮介質(zhì)的粘彈性任選包括將改性劑添加到該懸浮介質(zhì)中，所述改性劑改變 該懸浮液的粘彈性?？蛇x擇地，所述改性劑是高分子量聚合物，例如具有在大約50千道爾 頓和大約1000千道爾頓之間的分子量的聚合物。優(yōu)選地，所述改性劑以可溶于分散介質(zhì)的 量添加?？蛇x擇地，所述改性劑是生物相容的。當顆粒包括生物材料例如活細胞或微珠時， 該選擇可以是有利的。 可用于各種實施方案的一些改性劑的例子包括但不限于聚丙烯酰胺(PAA)、聚
乙二醇(PEG)、聚蔗醣(Ficoir)、聚葡萄糖(葡聚糖)、甲基纖維素和黃原膠。 可能影響聚集的一些粘彈性包括粘度、彈性、以及在懸浮介質(zhì)不是牛頓性的情況
下所述介質(zhì)的剪切稀化。 粘度可選擇地以帕斯卡_秒或泊來測量。 一般，較高的粘度導致了較低效率的聚 集。 彈性可選擇地通過第一法向應力差來定義，通常表示為N1Q K與可使用可商業(yè)上 獲得的流變儀實驗測定的儲能模量或彈性模量G'相關。通常，較高的彈性導致了更有效的 聚集。 剪切稀化是響應剪切速率的改變的粘度改變。通常，較高剪切稀化導致了更有效 的聚集。 用具有減輕了使用外力場來獲得聚集的需要的這種粘彈性的懸浮介質(zhì)進行的顆 粒聚集在本文稱為"粘彈性聚集"。 在一些實施方案中，聚集受管內(nèi)的懸浮液的流速的影B向。 一般，較高的流速導致更 有效的聚集。然而，在一些其它實施方案中，聚集幾乎獨立于流速。在聚集獨立于流速的情 況下，減輕了精確控制流速的需要，且利用獨立于流速的聚集的系統(tǒng)可以比使用依賴于流 速的聚集的實施方案制作得更簡單和更穩(wěn)健。例如，在獨立于流速的實施方案中，流速能夠 具有小得多的精確性。用于獲得獨立于流速的聚集的條件在圖9A的上下文和在"理論指 導"下進行了論述。 在詳細說明本發(fā)明的至少一個實施方案之前，應該理解的是，本發(fā)明在其應用上 不必限于在以下描述中闡述和/或在附圖和/或?qū)嵤├惺纠慕M分和/或方法的構造和布置的細節(jié)。本發(fā)明能夠包括其它實施方案或能夠以多種方式實踐和/或?qū)嵤?現(xiàn)在參照附圖，圖1是在根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案的聚集顆粒的方法
(2)中所采取的操作的流程圖。 操作4包括提供顆粒在懸浮介質(zhì)中的懸浮液。該懸浮介質(zhì)具有當該懸浮液在適當尺寸的通道中流動時使得至少一些顆粒被引向所述通道內(nèi)的聚集區(qū)域的這種粘彈性。
在一些實施方案中，與通道的長度垂直的聚集區(qū)域截面具有基本上等于所述通道的寬度的寬度，以及比所述通道的深度小得多的長度。在這些情況下，聚集在這里被稱為"水平的"。 在一些實施方案中，與通道的長度垂直的聚集區(qū)域截面具有基本上等于所述通道的深度的深度，以及比所述通道的寬度小得多的寬度。在這些情況下，聚集在這里被稱為"垂直的"。 在一些實施方案中，與通道的長度垂直的聚集區(qū)域截面具有基本上小于所述通道的深度的高度，以及比所述通道的寬度小得多的寬度。在這些情況下，所述聚集在這里被稱為3-D。 在本發(fā)明的一個示例性實施方案中，所述通道的深度小于100iim，具有更淺的通
道，允許更容易的聚集(在其它類似條件下)。限制所述通道的深度的兩個因素是通道太小
而堵塞的趨勢，以及為了在較小通道內(nèi)使流體流動所需的較高入口壓力。 可選擇地，所述通道還具有小于lOOym的寬度，在該情況下，獲得了 2-D聚集，并
且顆粒離開通道的底壁和頂壁以及還離開通道的垂直壁而聚集。在3-D聚集中，所述聚集
區(qū)域可選擇地具有與通道的截面類似但更小的截面。可選擇地，3-D聚集區(qū)域與所述通道同軸。 操作6包括使所述懸浮液沿著通道流動。 在一些示例性實施方案中，方法2導致了將所述顆粒一個接一個排列，允許在流動血細胞計數(shù)器中檢查它們。 在一些實施方案中，所述懸浮液包括多種尺寸的顆粒，且所述懸浮液體的粘彈性使得懸浮液在通道中流動選擇性地將給定尺寸的顆粒向所述聚集區(qū)域引導。例如，在以下關于圖5A和圖5B所述的一些實施方案中，95% -99%的8 ii m直徑的顆粒被引向所述聚集區(qū)域，而僅僅35% -40%的5 ii m直徑的顆粒被引向相同的聚集區(qū)域。
提供懸浮介質(zhì)的示例性方式 在一些實施方案中，所述顆粒是干燥的，且懸浮于根據(jù)介質(zhì)粘彈性選擇的懸浮介質(zhì)中。 在一些實施方案中，所述顆粒在懸浮于不適合的介質(zhì)中時提供。 可選擇地，添加過量的適合的懸浮介質(zhì)，以便控制或消除所提供的懸浮介質(zhì)的不
適合的粘彈性的效果。 可選擇地或另外地，所述懸浮介質(zhì)與具有適合的粘彈性的另一懸浮介質(zhì)交換。
例如，在許多實施方案中，血液被處理，且要分選的顆粒為血細胞，提供為懸浮于血清中。 在一些實施方案中，將鹽水加入到血液中?？蛇x擇地，所添加的血清的量是血液量的大約15倍、20倍或25倍。
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在一些實施方案中，血清與鹽水交換。可選擇地，這種交換包括離心血液樣品、提 取血漿、以及用鹽水懸浮該提取的血漿。 在一些實施方案中，用于替換血清的鹽水和/或加到血清中的鹽水包括如上所述 的改性劑。 在一些實施方案中，提供了多種可選擇的懸浮介質(zhì)，且根據(jù)懸浮介質(zhì)粘彈性和應 該被聚集或分選的顆粒的性質(zhì)例如顆粒的尺寸來選擇它們中的一種。 可選擇地，響應顆粒的尺寸和變形性來選擇所述懸浮介質(zhì)。可選擇地，使用變形性
來定義有效半徑，且響應定義的有效半徑來選擇所述懸浮介質(zhì)。 可選擇地，對于不同尺寸和變形性的顆粒提供不同的懸浮介質(zhì)。 在一些實施方案中，首先使用試驗性懸浮介質(zhì)，且使得所述顆粒沿著某些路徑在
試驗性懸浮介質(zhì)中在微通道中流動，并評價聚集質(zhì)量。聚集質(zhì)量可選擇地被定義為在以給
定流速在通道中流動給定距離之后聚集在給定尺寸的聚集區(qū)域的顆粒的百分率。 如果聚集不充分，可選擇地改良所述懸浮介質(zhì)。可選擇地，所述懸浮介質(zhì)通過將改
性劑添加到其中來改良，所述改性劑改變所述懸浮介質(zhì)的粘彈性?？蛇x擇地，所述改性劑包
括會提高溶解了它的液體的彈性的高分子量聚合物如聚丙烯酰胺(PAA)?？蛇x擇地或另外，
所述改性劑包括已知會改變?nèi)芙饬怂囊后w的粘度的高分子量聚合物，例如甘油。可選擇
地， 一種聚合物同時改變粘度和彈性?？蛇x擇地， 一種或多種聚合物用于改變彈性，且一種
或多種聚合物用于改變粘度。 在本發(fā)明的一個示例性實施方案中，聚集質(zhì)量根據(jù)95 %的聚集顆粒的中心所位于 的最薄層的寬度來估計?？蛇x擇地，該層越薄，聚集越好。可選擇地，聚集質(zhì)量根據(jù)其中心 位于給定厚度的層內(nèi)的聚集顆粒的百分率來估計。 另外地或可選擇地，聚集質(zhì)量根據(jù)顆粒在通道中行進以聚集到一定程度的路徑的 長度來估計。例如，在一個實施方案中，如果95%的顆粒濃集在離開入口 20mm的2iim厚的 層中，則認為該聚集優(yōu)于如果顆粒濃集在離開入口 50mm的2iim厚的層中。
示例性系統(tǒng) 圖2A是根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案的用于聚集流動的顆粒的系統(tǒng)100的 示意圖。該圖顯示了通過流體引導系統(tǒng)145與流體源125流體連通的通道(105)。提供了 流體引導系統(tǒng)145，用于通過入口 127將樣品流體從流體源125引導入通道105并引導向檢 查區(qū)128。可選擇地，流體引導系統(tǒng)145包括注射泵，它的活塞以恒定和受控制的速率被推 動?？缮虡I(yè)上獲得的適合的流體引導系統(tǒng)的例子是KD Scientific Inc.(美國)的KDS210 Scientific。 圖2B是通道105的示意圖。該圖顯示通道105具有壁110和115、底部120和頂 壁122。 樣品流體130包括懸浮于懸浮介質(zhì)中的顆粒135。該懸浮介質(zhì)具有有利于顆粒130 在通道105的一部分140中聚集的粘彈性，且減輕施加外場以獲得聚集的需要。雖然如此， 在一些實施方案中，如本領域已知的那樣施加外場，可選擇地，以便增強聚集，可選擇地或 另外地以便沿著其它方向聚集所述顆粒。 在操作中，流體130通過流體引導系統(tǒng)145被引導至105，且顆粒135被引導至包 封在通道105中的聚集區(qū)域140。
通道105是微通道，具有與底部120垂直的高度h以及在壁110和115之間的寬度w。高度h和寬度w的至少一個小于100iim，可選擇地在約5iim和約100iim之間，例如10iim、20iim、50iim、80iim或100iim?？蛇x擇地，在壁110和115之間的距離w也小于100iim?？蛇x擇地，h或w的一個大于100iim。在一個示例性實施方案中，w為lmm且h為50 ii m。 可選擇地，系統(tǒng)100還包括圖3中所圖示的試劑盒200。試劑盒200包括多個包裝物205，其在圖示的實施方案中為瓶，且各個包裝物含有懸浮介質(zhì)210，所述懸浮介質(zhì)210具有適合于聚集給定尺寸的顆粒的粘彈性。各個瓶205帶有標記215 ，指示了要被懸浮在其中以便用系統(tǒng)IOO聚集的顆粒的尺寸?？蛇x擇地，該標記指示了用于不同流速的不同粒度?？蛇x擇地，該標記指示了對于不同尺寸的系統(tǒng)的不同粒度。可選擇地，試劑盒200 (和/或系統(tǒng)100)還包括哪些顆粒應該用什么懸浮介質(zhì)聚集的說明書?？蛇x擇地，該指示提到了粒度。另外地或可選擇地，該指示提到了某些類型的細胞，例如紅細胞、白細胞、癌細胞和/或細菌。
示例性懸浮介質(zhì) 在本發(fā)明的一些實施方案中，用嘗試法選擇或挑選懸浮介質(zhì)。 例如，磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)的粘彈性可以通過向其添加360千道爾頓的PVP來
改變。可選擇地，添加PVP以形成大約2X、5X、8X或任何中間濃度的分散介質(zhì)。在另一例
子中，PBS的粘彈性通過添加類似量的具有高于7千道爾頓的分子量的葡聚糖來改變。另
外地或可選擇地，將5-100ppm的PAA和/或甲基纖維素添加到該鹽水中。 在一些實施方案中，使用理論分析來指導嘗試法。例如，計算用于在給定通道中聚
集一定粒度的顆粒所需的粘彈性，且使用具有類似粘彈性的介質(zhì)作為試驗性懸浮介質(zhì)，以
及如果必要，如以上所說明的那樣改變。 示例性應用 示例性FACS儀器 圖4A是利用根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的系統(tǒng)的FACS儀器400的示意圖。儀器400包括可選擇的上述類型的且在圖2A和圖2B中所示的顆粒聚集系統(tǒng)100。流體源中的流體包括懸浮于適合粘彈性的懸浮介質(zhì)中的顆粒。系統(tǒng)100在顆粒通過通道105流到檢查區(qū)405(圖1A中的128)之后從流體源輸出顆粒。 儀器400還包括光源410，光源410將光束指向檢查區(qū)405，以便照射從系統(tǒng)100到達檢查區(qū)的顆粒?？蛇x擇地，由系統(tǒng)IOO提供的聚集使得顆粒一個接一個地到達檢查區(qū)。每一顆粒與從光源410到達的光相互作用，可選擇地通過散射所述光。另外或可選擇地，顆粒中的一些還發(fā)射熒光。 可選擇地，光源410從以上通道105照射所述顆粒。在其中聚集區(qū)域與通道的高度的中間成水平的(即與底部120平行)且在通道的高度的中間的實施方案中，所述光源被調(diào)節(jié)以聚集在所述顆粒聚集的層上，用于接收來自分布于整個通道105的寬度且濃集在所述通道的中間高度(mid-height)的顆粒的散射光和/或熒光。散射的和/或發(fā)射的光通過檢測器(415)檢測；并且用計算機420分析。 可選擇地，計算機420控制開關425，其響應分析結果，將每個顆粒引導至多個目的地430之一。例如，較強熒光的顆粒被引導至一個目的地，而較弱熒光的顆粒被引導至另一個目的地。 示例性流變學測量 本發(fā)明的一些實施方案的一個方面涉及測量介質(zhì)的流變性質(zhì)，可選擇地，達到前 所未有的準確度。該方法是基于介質(zhì)的彈性與可用該介質(zhì)獲得的聚集程度之間的關系。
圖4B是根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案的測定介質(zhì)的流變性質(zhì)的方法500中 采取的操作的流程圖。 在502，已知粒度和尖銳粒度分布的顆粒被懸浮在介質(zhì)中?？蛇x擇地，顆粒的量使 得獲得的懸浮液的體積濃度(即顆粒占據(jù)的懸浮液體積的分數(shù))是在大約0.01%和1%之 間，例如0. 1%。 在504，在502中獲得的懸浮液流過微通道。 在506，離開入口一定距離的顆粒的空間分布例如，如以下在標題"理論指導"部分 中所述測定。 在508，該懸浮介質(zhì)的流變性質(zhì)使用以下在標題"理論指導"部分中提供的方程式 由測量的空間分布來推斷出。 可選擇地，所述分析使用介質(zhì)的粘度的數(shù)據(jù)?？蛇x擇地，所述方法包括測量這種數(shù) 據(jù)。 可選擇地，相比于提供了 ±10帕斯卡的準確度的可商業(yè)獲得的流變儀，方法500 允許以大約±0. 01至±0. 001帕斯卡的準確度測量介質(zhì)的彈性。
示例性結合試驗 許多類型的顆粒例如細胞和大分子，顯示了附著于表面的趨勢。該趨勢有時可 以用于分析顆粒的試驗。例如，在一個示例性實施方案中，研究了單克隆抗體結合于固定 抗原的趨勢或者受體結合于固定于通道的內(nèi)表面的配體的趨勢。在另一個示例性實施方 案中，研究了白細胞結合于固定配體的趨勢(本領域中已知為"體外滾動試驗(in-vitro rolling assay)，，)。 在一個示例性實施方案中，顆粒被聚集在通道底部以上的給定高度處的薄層中的
懸浮介質(zhì)中，并且研究了聚集的顆粒附著到固定于底部的粘合劑的能力。 在后一種情況下，聚集可以用作用于微調(diào)自由懸浮的顆粒和固定于通道底部的粘
合劑之間的有效相互作用范圍的特別有用的工具。這種微調(diào)可以用于改進試驗的空間分辨率。 可選擇地，所述通道具有接近入口且沒有固定于底部的粘合劑的第一部分，以及 在第一部分的下游且具有固定的粘合劑的第二部分。 可選擇地，所述第一部分足夠長，以允許大多數(shù)例如95%的顆粒具有位于比通道 的高度薄得多，例如所述高度的5%的層中的中心。 可選擇地，所述第二部分具有與第一部分相同的高度，且沒有被吸引到固定粘合 劑上的顆粒與其在第一部分中運動基本上相同地在第二部分中運動?？蛇x擇地，所述第二 部分足夠長，以便結合可以結合于粘合劑的大多數(shù)顆粒，例如全部顆粒的95%，且僅僅沒有 結合的顆粒從所述第二部分離開。 可選擇地，使用多個通道，每一個通道具有不同的高度，使得在固定于底部的粘合 劑和聚集在高度的一半的薄層中的顆粒之間的相互作用-距離，是以其中附著于粘合劑的顆粒是在第一閾值以下的最小通道高度和其中附著于粘合劑的顆粒是在第二閾值以上的 最大通道高度為基礎。例如，該相互作用距離可以定義為在其中吸附了少于5%的顆粒的最 小高度和其中吸附了至少95 %的顆粒的最大高度之間的中點。 可選擇地，在所述粘合劑和所述顆粒之間的相互作用距離基于距所述第二部分的 起點的一定距離處的結合來評價。 可選擇地，所有通道具有相同長度的第一部分?？蛇x擇地，不同通道具有被設計成 在所有通道中以相同程度聚集顆粒的第一部分?？蛇x擇地，這用不同長度的第一部分來實 現(xiàn)，且較長的第一部分與較深的通道相關聯(lián)?？蛇x擇地或另外，使所有第一部分具有相同聚 集力通過調(diào)節(jié)流體引導系統(tǒng)來獲得，所述流體引導系統(tǒng)將流體引導至不同通道，以便以較 高流量將流體引導至較深的通道。 圖4C是根據(jù)本發(fā)明的一個示例性實施方案的用于研究顆粒-粘合劑相互作用的 裝置的示意圖。 裝置600包括多個通道605，通道605各自接收來自儲器610的樣品流體。可選擇 地，各個通道105具有其自身的流體弓I導系統(tǒng)645，所述流體弓I導系統(tǒng)645可選擇地是可控 制的以將樣品流體引導入與之連接的通道中，流速獨立于將流體引導至其它通道中的任一 個中的流速。 在所述實施方案中，各個通道605具有第一部分620?？蛇x擇地，各個流體引導系 統(tǒng)被操作為使得在第一部分的末端，大約90%的顆粒的中心占據(jù)在所述通道的高度中間的薄層。 在所述實施方案中還顯示了第二部分625，其中粘合劑被固定于所述通道的底部。
在各個通道上面，在第二部分開始之后的一定距離處，顯示了照相機(camera) 630，該照相
機630使該照相機以下的通道中的顆粒成像，以評價到達該位置的顆粒的數(shù)目。 可選擇地，根據(jù)進入第二部分的顆粒的數(shù)目和離開第二部分的顆粒的數(shù)目之間的
比率來評價結合的數(shù)量。 理論指導 在下面，提供理論來幫助技術人員選擇適合于聚集給定粒度的顆粒的懸浮介質(zhì)， 且報告實驗結果來支持該理論和本發(fā)明的一些實施方案的可使用性。 本發(fā)明的一個方面涉及以流通幾何學被動和可調(diào)節(jié)地聚集稀釋懸浮液中的顆粒 或細胞的方法學。該方法學由微觀流體實驗的結果支持，該實驗證明了稀釋聚合物溶液的 壓力驅(qū)動的流動中產(chǎn)生的內(nèi)在非線性彈性力(intrinsic nonlinear elastic force)如何 可以被開發(fā)來以可控方式驅(qū)動顆粒離開壁，朝向所述通道的中平面。我們提供了分析模型 的結果來描述基礎遷移機制且提出了用于微調(diào)橫向粒度分布的方法。最后，提供且徹底論 述了被設計來證明理論預測的實驗結果。 在我們的實驗中，我們使用截面hXw = 45X10、 m2的淺的微觀流體通道，該微 觀流體通道采用如在此處通過引入并入的A. Bransky等人，Biosens. Bioelectron. 22， 165(2006) ;Microvasc. Res. 73,7(2007)(下文:Bransky等人，2007)中所述的光刻法在 顯微鏡蓋玻片中制造。使用注射泵(KDS 210， KD Scientific)，來以各種恒定的流速(在 0. 1-lcm/s的典型速度下)通過微通道入口灌注聚苯乙烯(PS)微球(Duke Scientific) 的稀釋的(< 0. 1體積％ )分散懸浮液。將高速CCD照相機(CPL MS1000 CanadianPhotonicLabs)安裝在直立顯微鏡(Nikon 80i)上。在各種深度下在微通道的中心(離開側壁w/2的距離)從入口向下游流動20mm的微球膜被直接記錄到PC，用于通過定制設計的圖像處理軟件進一步分析，如Bransky等人，2007所述。該算法能夠計數(shù)顆粒且計算它們在 liim深度的薄垂直層中的速度。 我們將粒度分布函數(shù)(PDF)定義為在一定深度的聚集中記錄的顆粒除以它們的順流速度(streamwise velocity)且歸一化至單位元素(unity)的分數(shù)。根據(jù)該定義，PDF必須是恒定的且獨立于流速，條件是顆粒遵循繞流的流線。我們首先用懸浮于粘性牛頓液體的8 m直徑PS微球進行參照實驗，該牛頓液體在去離子水中含有84體積％甘油。該溶液剪切粘度使用應變控制的流變儀(ARES， Rheometric Scientific)來測量，并被認為在25t:下是0.063Pa s。圖5a表示在改變流速時的實驗PDF與偏心垂直距離的關系曲線。各點對應于基于數(shù)百個單獨測量的平均值。很容易看出，粒度分布并沒有隨流速變化，且大多數(shù)是均勻的。我們用懸浮于8wt^聚乙烯吡咯烷酮(PVP，麗"3. 6X 105 ;Sigma-Adrich)水溶液的PS微球重復該實驗，并且在圖5b中繪制了所得PDF。很容易看出，顆粒趨向于從壁遷移離開且濃集在中平面，同時該聚集隨著流速的增加而加強。以前提出的在沒有外場的情況下的顆粒聚集的解釋(變形誘發(fā)的遷移、慣性效應和剪切誘發(fā)的遷移)似乎全部不足以解釋圖5a和圖5b中所示的結果。明顯地，變形誘發(fā)的遷移對于剛性微球不起作用；慣性效應應該在兩種溶液中產(chǎn)生類似結果，而剪切誘發(fā)的遷移僅僅在濃縮懸浮液中觀測到。因此，應該提供新的解釋。 我們接下來證明，側向顆粒遷移由壓縮非線性彈性力的不平衡來驅(qū)動。在剪流中的這些力分別按照第一法向應力差和第二法向應力差M(》-ff^-ff"和
^200-";y一a忍來描述(這里o ii代表應力張量的對角線分量(diagonal component)， x表示流動方向，y是速度梯度的方向，且z是渦量方向(vorticity direction)。用于二階粘彈性流體的分析上易處理的情況的平面泊肅葉流動(Plane Poiseuille flow)的側向顆粒遷移的嚴格分析顯示，K > 0、N2 < 0 二者均起到將顆粒驅(qū)動向通道的中心的作用(參見B. P. Ho和L. G. Leal， J. Fluid Mech. 76， 783 (1976)。為了盡可能保持一般分析，我們基于縮放自變量(scaling argument)構建了簡單的理論。我們忽略了 N2貢獻且假定施加于顆粒
上的橫向彈性力與K相比于顆粒粒度的變化Fe ~V ("AV辦)成比例，且被斯托克斯阻力
Fn = 6ji naV所抵消。在這里，V是側向遷移的速度，a是顆粒的半徑，-d《y《d，d是通道的一半深度，n是動態(tài)粘度，它通常是局部剪切速率f的函數(shù)。使^和F,相等則獲得了側向遷移速度的表達式 對于w/h " 22的長寬比，我們近似為按照平面泊肅葉剖面
(planePoiseuille profile)流動。對于冪律流體，？7 -附》 》=|dw/<iyl 通過 r
(色迎
6巧9j> ~
17<formula>formula see original document page 18</formula>
來給出解，其中D是平均速度。對于高分子量聚合
物的稀溶液預計為冪律行為iV！ =乂^ (1<#S2》[16]。因此，將^和》代入(i)中，我們
獲得了
V
Ca U入I 4
(入—n)/n 其中ct-
l + 2w
具有[L/T]n—e的因次(dimension),入=l+P-n和
4 = y/d是縮放的橫向坐標(scaled transverse coordinate)，且C是后來通過將該模型 擬合到實驗數(shù)據(jù)所確定的常數(shù)。 可選擇地，(2)中的深度_平均側向速度能夠容易地求出為
<formula>formula see original document page 18</formula> 其中wi =t是等于彈性應力&與粘性應力t = ;/y的比
率的平均魏森貝格數(shù)(Weissenberg Number), 二者均在平均剪切速率
<formula>formula see original document page 18</formula> 我們進一步忽略了布朗力、在顆粒之間以及與壁之間的流體動力學相互作用，并 且假定顆粒的順流速度U大致上等于在其中心的未擾動流的速度u[18]。因此，顆粒的軌跡 是以下方程式的解《丄一i^，(r)" 其中；=x/d是縮放的軸向坐標。方程式(3)可以容易地求積分，且獲得了隱含 解 F" ， 。 = C"A-1《 (4) 假設最初穿過通道截面的粒度分布是均勻的，我們能夠估計在由于"粘彈性聚集" 而從入口離開的距離處的含有95%的顆粒的中心芯(centralcore)的半寬度y95。因為芯 的包跡(envelope)是軌跡，我們能夠基于(3)的解比較圖l(b)中的實驗結果與理論模型。 在25t:下用ARES流變儀測量的PVP溶液的剪切粘度被測得為等于 0. 064Pa *s。觀察到 的剪切稀化是較小的，因為粘度在O. l-250s—^勺剪切速率范圍內(nèi)減小少于3X (參見圖6的 插圖)，且因此，對于PVP溶液，我們使用n二 1。 PVP溶液的&的數(shù)量級太低，而不能在穩(wěn)定的剪切試驗中可靠地被測量。反而， 我們進行了作為振蕩頻率o的函數(shù)的動態(tài)剛性("儲能模量")G'的小幅度振蕩剪切測量
(參見圖6)。使用在》和"的低值下保持在G，和&之間的流變關系G'/a)2 ~ ^/2》2 ，我們能夠估計A^ "0.94^'54mPa的值。類似的Cox-Merz關系保持在剪切粘度7/(》和復數(shù)粘
度的絕對值I n*(")|之間，如在圖6的插圖中所確認的。 給定流變性質(zhì)和通道尺寸，我們能夠直接計算a ，并然后通過將(3)的解擬合到 實驗數(shù)據(jù)而發(fā)現(xiàn)倍增常數(shù)C。對應于y^(ym)的值由圖5b中所示的對于各種流速的數(shù)據(jù) 來計算，并且在圖7中提供為開放三角。圖7中的中間曲線對應于理論模型與實驗數(shù)據(jù)的 最佳擬合，且在二者之間具有優(yōu)異的一致。最佳擬合獲得了倍增常數(shù)C " 0. 301。
由于穩(wěn)態(tài)下的布朗力的PDF的縮放寬度2^能夠由條件Pe = aV/D。 = 1來估 計，其中V由(2)給出，D。是單一顆粒的斯托克斯_愛因斯坦擴散率(Stokes-Einstein diffusivity)，且Pe是佩克萊特數(shù)(P6clet number)。對于a = o. 5和D = lcm/s的典型 平均速度，獲得了 ^e" 0.004，所以對于ym尺寸的顆粒，布朗轉運能夠完全被忽略。
表達式(2)獲得了 V/D aP—，，其中聚集的強度通過a Aa2/n來控制。剪 切稀化(即，n < 1)可以增強聚集。剪切稀化和牛頓液體(具有相同的彈性和零剪切速率
粘度)的深度平均遷移速度的比率歸納為
s1_n且對<formula>formula see original document page 19</formula>該表達式
大于l，因為n〈 1。因此，通過改變粒度和改變懸浮介質(zhì)的彈性和/或粘度，能夠控制在下 游一定距離的粒度分布的寬度。例如，如果K指數(shù)為A l，則粒度分布預計對流速不敏 感。為了證明理論預測的有效性，我們使用基于高分子量聚丙烯酰胺(PAA)的稀溶液的粘 彈性液體重復所述實驗，所述稀溶液使用76wt^甘油的溶劑與45卯m PAA(S印aran AP30 ; Dow Chemical Co.)來制備。剪切粘度在0. l_450s—1的剪切速率范圍內(nèi)從O. 052Pa *s改變
至0.036Pa's，并且最近似于i;-0.047廠0'Mpa.S (參見圖6中的插圖)。動態(tài)剛性(G')
測量獲得了^N^ == 0.0116^>()9Pa (參見圖6) 。 PAA的稀溶液的動態(tài)剛性的頻率依賴性 預計為G' "2，以及該指數(shù)偏離于預期值2，甚至在測試的最低頻率下(參見圖6)，這可 以歸因于在實驗中使用的聚合物的高的多分散性。 因此，V/D D°15以及PDF對流速的較弱的依賴性被預期。另一方面，指前因子 (pre-exponential factor) A大約在高于對PVP溶液測量的指前因子的數(shù)量級，且因此，在 PAA溶液中預計有更強的聚集效果。 所獲得的8iim和5iim微球的PDF分別在圖8a和圖8b中給出。能夠容易地看出， 如預計的那樣，PDF幾乎獨立于流速。粒度效果是明顯的PDF分布對于較大顆粒更窄。y95 的相應值可以由圖8中的PDF來計算，且它們在圖7中作為5 i！ m顆粒(開放菱形)禾P 8 y m 顆粒(開放正方形)的流速的關系曲線而被描繪。PAA溶液的y^的理論預測[圖7中的 頂部曲線和底部曲線]基于具有C = 0. 301的方程式(3)的解，并且不牽涉到任何可調(diào)節(jié) 的參數(shù)。如所預計的那樣，8ym顆粒的聚集效果在PAA溶液中比在PVP溶液中更強，且粒度 的效果是相當可觀的。在理論估計(沒有可調(diào)節(jié)的參數(shù))和實驗數(shù)據(jù)之間的對比顯示了優(yōu) 異的一致并且驗證了粘彈性聚集的假說。圖7中對于PAA溶液中8ym顆粒的理論預測和 實驗之間的一致沒有對于5ym顆粒的理論預測和實驗之間的一致那樣精確，因為在前一 情況下的實驗分辨率不足顆粒被聚集在小于4ii m的非常薄的層中，參見圖8(a)。
聚集預測方法 圖9A是在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的給定流動系統(tǒng)中預測給定懸浮介質(zhì)的聚集質(zhì)量的方法900中采取的操作的流程圖。 在操作902，提供系統(tǒng)的物理尺寸。這些尺寸可選擇地包括 微觀流體通道的幾何尺寸，包括它的寬度w、深度h(或代表通道一半深度的d =h/2)、以及在入口和檢查區(qū)之間的長度；以及
要聚集的顆粒的估計尺寸。 在903，選擇用于實驗設置的流速Q(mào)，以及由方程式D = Q/A來估計平均順流速度D，其中A = hXw。 在904，估計給定懸浮介質(zhì)的流變性質(zhì)。估計的流變性質(zhì)可選擇地包括動態(tài)粘度n(Pa，s)，其作為剪切速率》的函數(shù)；以及彈性模量G' (Pa)，其作為振蕩頻率"的函數(shù)。
可選擇地，這些估計基于在文獻中可獲得的數(shù)據(jù)?？蛇x擇地，這些數(shù)據(jù)通過實驗收集，例如
用可商業(yè)上獲得的流變儀。 在906，估計在方程式i^ = J:f^中的常數(shù)A和|3 。 可選擇地，該估計是基于在904中采取的測量，用流變相等性(rheometricequality)K " 2G'。 如果&大得足以通過可商業(yè)上獲得的流變儀(通常以大約數(shù)十Pa的數(shù)量級)來測量，則可選擇地直接測量N1Q 在908，估計方程式^ =附f1中的參數(shù)m和n。該估計可選擇地基于在文獻中可
獲得的數(shù)據(jù)?？蛇x擇地，該估計包括將測量的流變性質(zhì)擬合到以上方程式。
在910，通過使用在操作902和903中提供的數(shù)據(jù)和在操作904-908中獲得的估計求解以上方程式4來估計聚集質(zhì)量?？蛇x擇地，聚集質(zhì)量通過試驗顆粒的無量綱位置(dimensionless position) 4 二y/d來估計。例如，如果想要知道多少百分率的顆粒將在流動方向上離開入口 20mm的距離處、在具有d = 40iim的一半深度的微通道中、在深度4ii m的中心層中垂直聚集，應該用4 = 4/40 = 0. 1和l = 2000/40 = 50來求解方程式(4)的4 。。例如，4 。 = 0. 75的結果值意味著大約75%的顆粒將在離開入口 20mm的距離處的、深度4 ii m的中心層內(nèi)聚集。 單分散線性聚合物的許多稀溶液表現(xiàn)了特定的良好界定的流變行為(在本領域中稱為鮑格液體)據(jù)此，n "常數(shù)，i^ =4夕2。 在本上下文中術語"單分散聚合物"用于表示具有窄分子量分布的聚合物。在稀溶液中提供鮑格液體行為的線性聚合物的例子包括單分散聚丙烯酰胺和聚乙二醇。
在鮑格液體的情況下，n = 1且13 = 2，且聚集質(zhì)量的估計明顯簡化。這種簡化方法的流程圖(900')在圖9b中提供。 圖9B是在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案的給定流動系統(tǒng)中預測給定懸浮介質(zhì)的聚集質(zhì)量的方法900中采取的操作的流程圖。 圖9b中的操作902和903正如圖9a中的相同操作一樣。 在904'，平均剪切速率和剪切速率的平均梯度由在操作902和903中提供的值根據(jù)式…附=3^7/2d和(^/^)附=3^7/^2計算。 在906，，測量粘性應力t和法向應力^的值，且計算Wi = N乂 t 。 t和^的測量可選擇地用商用流變儀來進行。這些值可選擇地僅僅在一個剪切速率下測定，這等于904'
20計算的》加。 精確的法向應力測量通常不能由商用流變儀來獲得，因此法向應力可選擇地由彈
性模量G'來估計，該彈性模量G'在振蕩剪切測量中使用商用流變儀在單一頻率《0=^, 下
測定，并使用關系式^ " 2G'以便由測量的數(shù)據(jù)獲得法向應力。 在908'，使用在906'獲得的數(shù)據(jù)計算魏森貝格數(shù)Wi = N乂 t 。 在908'，顆粒的平均側向速度V根據(jù)在904-908計算的量以及方程式(2a)和對于
鮑格液體的輸入S =0.6/6ji來計算。 在910'，顆粒將完全聚集到所述通道的中心水平平面的流向距離被估計為1
—般注釋 預計，在由本申請成熟的專利的壽命期間，許多相關的懸浮介質(zhì)、流動血細胞計數(shù) 器和FACS儀器將被開發(fā)出來，因此根據(jù)推理，相應術語的術語范圍意圖包括所有這些新技 術。 術語"包括(comprises)'，、"包括(comprising)'，、"包括(includes)'，、"包括 (including)"、"具有(having)"和它們的變化形式是指"包括但不限于"。
術語"示例性"是指"用作實例、例子或示例"。 在本文中不論是在何處指出數(shù)值范圍，均意圖包括在所指出的范圍內(nèi)的任何列舉 數(shù)字(分數(shù)或整數(shù))。短語"在"第一指示數(shù)值和第二指示數(shù)值"之間的范圍"和"從"第一 指示數(shù)值"到"第二指示數(shù)值"的范圍"在本文可互換地使用，且意圖包括第一指示數(shù)值和 第二指示數(shù)值以及在它們之間的所有分數(shù)和整數(shù)。 應該領會，為了清楚而在單獨實施方案的上下文中描述的本發(fā)明的某些特征還可 以在單個實施方案中組合提供。相反，為了簡潔，在單個實施方案的上下文中描述的本發(fā)明 的各種特征還可以單獨地提供，或者以任何適當?shù)淖咏M合(subcombination)提供，或者如 果適合在本發(fā)明的任何其它所述實施方案中提供。在各種實施方案的上下文中描述的某些 特征不應被認為是這些實施方案的必要特征，除非該實施方案沒有這些要素就不能操作。
雖然結合本發(fā)明的具體實施方案描述了本發(fā)明，但明顯地，許多替代、更改和變化 對于本領域技術人員來說是明顯的。因此，意圖包括落入所附權利要求的精神和寬范圍內(nèi) 的所有這些替代、更改和變化。 在本說明書中提到的所有出版物、專利和專利申請在此處通過引用以其整體并入 到本說明書中，其程度就好象每一單獨出版物、專利或?qū)＠暾埍痪唧w和單獨地指出在此 處通過引用并入。另外，本申請中的任何參考文獻的引用或確認不應被理解為承認這種參 考文獻可作為本發(fā)明的現(xiàn)有技術獲得。就使用節(jié)段標題而言，它們不應被認為是一定是限 制性的。
權利要求
一種聚集顆粒的方法，所述方法包括提供所述顆粒在第一懸浮介質(zhì)中的懸浮液；以及使所述懸浮液沿著具有至少一種小于100μm的截面尺寸的通道流動；其中所述第一懸浮介質(zhì)具有這樣的粘彈性，以使得所述懸浮液在所述通道中的流動增加了所述顆粒在所述通道內(nèi)的聚集區(qū)域中的濃度。
2. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述聚集區(qū)域是在所述通道的高度的一半處。
3. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述聚集區(qū)域具有與所述通道的長度垂直的截面，所述截面具有與在相同位置的所述通道的截面相同的形狀，但更小。
4. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述聚集區(qū)域與所述通道同軸。
5. 根據(jù)權利要求1所述的方法，其中所述懸浮液包括多種尺寸的顆粒；以及所述粘彈性使得所述懸浮液在所述通道中的流動優(yōu)先將較大的顆粒向所述聚集區(qū)域引導。
6. 根據(jù)權利要求1或5所述的方法，其中提供懸浮液包括獲得所述顆粒在第二懸浮介質(zhì)中的懸浮液；以及將所述第二懸浮介質(zhì)與所述第一懸浮介質(zhì)交換。
7. 根據(jù)權利要求1-6中任一項所述的方法，其中提供懸浮液包括提供具有各種粘彈性的多種懸浮介質(zhì)；響應所述介質(zhì)的粘彈性，從所述多種懸浮介質(zhì)中選擇所述第一懸浮介質(zhì)；以及將所述顆粒懸浮于所選擇的懸浮介質(zhì)中。
8. 根據(jù)權利要求7所述的方法，其中選擇包括響應所述顆粒的尺寸來選擇。
9. 根據(jù)權利要求1-8中任一項所述的方法，其中提供懸浮液包括將所述顆粒懸浮于試驗懸浮介質(zhì)中；使所述懸浮液沿著微通道流動，使得流動懸浮液具有至少一種小于lOOym的尺寸；估計聚集質(zhì)量；以及增大所述試驗懸浮介質(zhì)的彈性，以改進聚集質(zhì)量。
10. 根據(jù)權利要求1-9中任一項所述的方法，其包括以一定流速流動；估計聚集質(zhì)量；以及增大所述流速以改進聚集質(zhì)量。
11. 根據(jù)權利要求9所述的方法，其中增大所述試驗懸浮介質(zhì)的彈性包括將高分子量聚合物添加到所述懸浮液中。
12. 根據(jù)權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述通道的深度小于100 ym。
13. 根據(jù)權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述通道的寬度小于100 ym。
14. 根據(jù)權利要求1-12中任一項所述的方法，其中所述通道具有各自小于100 m的深度和寬度。
15. 根據(jù)前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述顆粒是細胞。
16. 根據(jù)權利要求6所述的方法，其中所述第二懸浮介質(zhì)包括血清。
17. —種用于聚集流動顆粒的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括通道，其具有壁和所述壁之間的底部； 流體源，其包括樣品流體；以及流體引導系統(tǒng)，其被配置成將所述樣品流體從所述流體源通過入口引導入所述通道中，其中所述樣品流體包括懸浮于液體中的所述顆粒，所述液體具有粘彈性，所述粘彈性 減輕了施加外力場以在聚集區(qū)域聚集所述顆粒的需要。
18. 根據(jù)權利要求17所述的系統(tǒng)，其中所述聚集區(qū)域是在所述通道的高度的一半處。
19. 根據(jù)權利要求17或權利要求18所述的系統(tǒng)，其包括光源，其在所述入口的下游的檢查區(qū)提供與所述聚集區(qū)域傳感連通的探測光束；以及 檢測器，其被配置成使用探測光束檢測所述檢查區(qū)中的所述顆粒。
20. 根據(jù)權利要求17-19中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述顆粒包括細胞。
21. 根據(jù)權利要求17-20中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述通道具有在5 ii m和100 ii m之 間的至少一種截面尺寸。
22. 根據(jù)權利要求21所述的系統(tǒng)，其中所述至少一種截面尺寸包括與所述通道的底部 垂直的截面的尺寸。
23. 根據(jù)權利要求17-22中任一項所述的系統(tǒng)，其中所述通道具有底部和壁，且在所述 壁之間的距離大于100iim。
24. 根據(jù)權利要求17-23中任一項所述的系統(tǒng)，其包括各自具有不同粘彈性的多種流 體以及使用每一種流體來聚集不同尺寸的顆粒的說明書。
25. —種試劑盒，其包括多種流體，各自獨立地被包裝在帶有尺寸范圍指示的包裝物中；以及 說明書，其使用所述多種流體中的每一種來聚集指定尺寸范圍的顆粒。
26. —種評價液體的彈性的方法，所述方法包括 向介質(zhì)中添加單分散粒度分布的顆粒以獲得懸浮液； 使所述懸浮液在具有至少一種lOOym或更小的截面尺寸的通道中流動； 在所述顆粒在所述通道中流經(jīng)給定距離之后獲得所述顆粒的空間分布；以及 分析所述空間分布以獲得所述介質(zhì)的彈性。
27. 根據(jù)權利要求26所述的方法，其中分析包括響應所述介質(zhì)的粘度進行分析，且所 述方法包括獲得所述介質(zhì)的粘度。
28. 根據(jù)權利要求27所述的方法，其中獲得所述介質(zhì)的粘度包括測定所述介質(zhì)的粘度。
29. 根據(jù)權利要求26-28中任一項所述的方法，其中所述顆粒在獲得的懸浮液中的體 積分數(shù)是在0. 001 %和1 %之間。
30. 根據(jù)權利要求26-28中任一項所述的方法，其中獲得的懸浮液的體積分數(shù)是 0.1%。
31. —種評價顆粒和粘合劑之間的相互作用的方法，其包括 將所述顆粒聚集在通道的底部以上的層；以及 使所述聚集的顆粒在固定于所述底部的粘合劑以上流動。
32. 根據(jù)權利要求31所述的方法，其中將所述顆粒聚集，使得至少90%的所述顆粒的中心是在具有小于所述通道的高度的一半的厚度的層中。
33. 根據(jù)權利要求31或權利要求32所述的方法，其中聚集所述顆粒包括在根據(jù)權利要求1-16中任一項所述的方法中聚集。
34. 根據(jù)權利要求31-33中任一項所述的方法，其包括進行多次所述方法，每次用不同高度的通道。
35. —種用于評價顆粒和粘合劑之間的相互作用的裝置，所述裝置包括多個系統(tǒng)，各自根據(jù)權利要求17-24中任一項，且所述系統(tǒng)中的至少一個具有通道，所述通道具有固定于所述通道的底部的至少一部分之處的所述粘合劑。
36. 根據(jù)權利要求35所述的裝置，其中所述多個系統(tǒng)具有共同的流體源。
37. 根據(jù)權利要求35或權利要求36所述的裝置，其中所述多個系統(tǒng)具有共同的流體引導系統(tǒng)。
38. 根據(jù)權利要求35-37中任一項所述的裝置，其具有控制器，所述控制器用于在與其它系統(tǒng)獨立的各系統(tǒng)中控制流體進入所述通道的流速。
39. 根據(jù)權利要求35-38中任一項所述的裝置，其具有固定于所述通道中的至少一個的至少一部分之處的粘合劑。
40. 根據(jù)權利要求35-39中任一項所述的裝置，其中并非所有的所述通道都具有相同深度。
41. 根據(jù)權利要求40所述的裝置，其中所述通道中的每一個具有與所有其它通道不同的深度。
42. 根據(jù)權利要求35-41中任一項所述的裝置，其被配置成在所有的所述通道中以相同聚集質(zhì)量聚集所述顆粒。
全文摘要
提供了一種聚集顆粒的方法，該方法包括提供所述顆粒在懸浮介質(zhì)中的懸浮液；以及使該懸浮液沿著通道流動，使得該流動懸浮液占據(jù)具有至少一種小于100μm的截面尺寸的一定體積。所述懸浮介質(zhì)具有這樣的粘彈性，使得所述懸浮液在通道中流動將顆粒中的至少一些向在所述一定體積中包含的聚集區(qū)域引導。
文檔編號G01N15/00GK101772697SQ200880101686
公開日2010年7月7日 申請日期2008年6月5日 優(yōu)先權日2007年6月7日
發(fā)明者亞歷山大·萊申斯基, 科琳·納塔尼爾, 阿維謝伊·布蘭斯基 申請人:技術研究及發(fā)展基金有限公司