專利名稱：一種氟乙酰胺類毒藥的免疫層析檢測試紙條及其制備方法
一種氟乙酰胺類毒藥的免疫層析檢測試紙條及其制備方法技術(shù)領(lǐng)域一種氟乙酰胺類毒藥的免疫層析檢測試紙條及其制備方法，屬于免疫檢測 技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到免疫膠體金試劑的制備及試紙條的制備。
技術(shù)背景氟乙酰胺、氟乙酸鈉、氟乙酸均屬于氟乙酰胺類劇毒藥，其毒性、中毒癥狀 同毒鼠強相近。氟乙酰胺類毒藥已成為我國刑事案件中最常見的毒物之一。氟 乙酰胺進入生物體后，很快在體內(nèi)代謝產(chǎn)生氟乙酸根陰離子，所以檢驗工作最 終歸結(jié)到對生物檢材中痕量氟乙酸根陰離子的分析?，F(xiàn)有的能實現(xiàn)多中毒檢測的方法主要是儀器分析，其中包括有離子色譜法、毛細管電泳法及衍生化后GC-NPD、 GC-ECD、 GC-MS法。但這些檢測方法需要昂貴的儀器設(shè)備，操作需 要專業(yè)技術(shù)人員，且不能適應高通量，現(xiàn)場的快速檢測。因此實現(xiàn)具有快速， 便攜優(yōu)點的免疫檢測方法的中毒檢測具有現(xiàn)實意義。 發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了克服現(xiàn)有檢測技術(shù)的缺陷，提供一種便攜，快速適合 進行現(xiàn)場檢測的免疫層析色譜檢測法(gold immunochromatography assay, GICA)，實現(xiàn)氟乙酰胺類毒藥的中毒檢測。同時提供該檢測試紙條的制備方法。本發(fā)明的技術(shù)方案 一種氟乙酰胺類毒藥的免疫層析檢測試紙條，由樣品 墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯組成，PVC背襯上依次粘貼樣 品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，金標墊上包被了抗氟乙酰胺類毒藥的 簇特異性抗體-膠體金標記物，硝酸纖維素膜上依次包被了氟乙酸鈉-OVA和羊 抗兔IgG。所述的氟乙酰胺類毒藥的免疫層析檢測試紙條的制備方法，制備步驟為(1) 制備氟乙酸鈉-OVA偶聯(lián)物將氟乙酸鈉與OVA以50 : 1摩爾比溶于 pH8、 0.01mol/L的PBS緩沖溶液中、攪拌下加入碳二亞胺EDC交聯(lián)劑，EDC 摩爾用量為氟乙酸鈉摩爾量的1/10，反應3h， 4。C透析3天，形成氟乙酸鈉-OVA 偶聯(lián)物；(2) 制備抗氟乙酸鈉的多克隆抗體用EDC法制備氟乙酸鈉-BSA偶聯(lián)物， 用氟乙酸鈉-BSA偶聯(lián)物免疫得到抗氟乙酸鈉的多克隆抗體；(3) 制備膠體金用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm膠體金顆粒；(4) 制備抗氟乙酰胺類毒藥的簇特異性抗體-膠體金標記物將3mL膠體 金調(diào)至pH9，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.075mg/mL的抗氟乙酸鈉的多克隆抗 體0.2mL，放置30min后加入牛血清蛋白BSA使終濃度為1%，放置至少30min 后，10000轉(zhuǎn)60min離心并用pH 9.0、 0.002mol/L的硼酸鹽緩沖液3mL重懸兩 次，最后用0.3mL重懸液重懸，得到穩(wěn)定的抗氟乙酸鈉抗體-膠體金標記物；(5) 將抗氟乙酸鈉抗體-膠體金標記物包被在金標墊上，將氟乙酸鈉-OVA 偶聯(lián)物和羊抗兔IgG分別包被在作為反應點的硝酸纖維素膜的測試線和質(zhì)控線， 在37。C烘箱充分干燥；(6) 試紙條的組裝將樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端依 次黏附在PVC背襯上，用切條機切割成3mm寬的細條，即得到用于檢測的免 疫層析檢測試紙條。本發(fā)明的有益效果:快速，僅需要5-10分鐘；便攜，適合現(xiàn)場檢測；操作 簡便，不需要專業(yè)技術(shù)人員。


圖l組裝完成的免疫層析檢測試紙條結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實施方式
實施例1PVC背襯一端依次粘貼樣品墊、金標墊，中間粘附硝酸纖維素膜，另一端粘附吸水墊，金標墊上包被了抗氟乙酰胺類毒藥的簇特異性抗體-膠體金標記物，硝酸纖維素膜上包被了氟乙酸鈉-OVA和羊抗兔IgG。 按以下步驟制備(1) 制備氟乙酸鈉-OVA偶聯(lián)物將氟乙酸鈉與OVA以50 : 1摩爾比溶于 PBS (0.01mol/LpH8)，攪拌下加入EDC交聯(lián)劑，反應3h， 4。C透析3天，形成氟乙酸鈉-OVA偶聯(lián)物；(2) 制備抗氟乙酸鈉的多克隆抗體用上述EDC方法制備氟乙酸鈉-BSA 偶聯(lián)物，用此偶聯(lián)物免疫得到高純度的抗氟乙酸鈉的多克隆抗體；(3) 制備膠體金用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm膠體 金顆粒；(4) 制備多克隆抗體-膠體金標記物將膠體金調(diào)至pH9左右，攪拌下逐 滴加入蛋白濃度為0.075mg/mL的抗氟乙酸鈉的多克隆抗體0.2mL，放置30min 后加入牛血清蛋白BSA使終濃度為1%，放置至少30min后，10000轉(zhuǎn)60min 離心并用pH 9.0、 0.002mol/L的硼酸鹽緩沖液3mL重懸兩次，最后用0.3mL重懸液重懸，得到穩(wěn)定的抗氟乙酸鈉抗體-膠體金標記物；(5)將抗氟乙酸鈉抗體-膠體金標記物包被在金標墊上，將氟乙酸鈉-OVA 偶聯(lián)物和羊抗兔IgG分別包被在作為反應點的硝酸纖維素膜的測試線和質(zhì)控線， 在37"C烘箱充分干燥。(6)試紙條的組裝將樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端依 次黏附在PVC背襯上，用切條機切割成3mm寬的細條，即得到用于檢測的免 疫層析檢測試紙條。4'C冷藏備用。檢測時將吸水墊浸入樣本溶液，液面不得超過MARK線，10s后取出平放 在操作臺上；5-15min內(nèi)可以判定結(jié)果，30min后結(jié)果無效。結(jié)果判斷樣品中 有氟乙酸鈉存在且達到500ng/mL，則測試線將不出現(xiàn)紅色條帶，而在質(zhì)控線出 現(xiàn)紅色條帶，此時結(jié)果為陽性;如果樣本中沒有氟乙酸鈉存在或數(shù)量在500ng/mL 檢測限以下，則測試線出現(xiàn)紅色條帶，質(zhì)控線也同時出現(xiàn)紅色條帶，此時結(jié)果 為陰性；無論測試線是否出現(xiàn)紅色條帶，質(zhì)控線如果沒有紅色條帶出現(xiàn)則表示 該試紙條無效。
權(quán)利要求
1、一種氟乙酰胺類毒藥的免疫層析檢測試紙條，其特征在于由樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊和PVC背襯組成，PVC背襯上依次粘貼樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，金標墊上包被了抗氟乙酰胺類毒藥的簇特異性抗體-膠體金標記物，硝酸纖維素膜上依次包被了氟乙酸鈉-OVA和羊抗兔IgG。
2、 一種權(quán)利要求1所述的氟乙酰胺類毒藥的免疫層析檢測試紙條的制備方法，其特征在于制備步驟為(1) 制備氟乙酸鈉-OVA偶聯(lián)物將氟乙酸鈉與OVA以50 : 1摩爾比溶于 pH8、 0.01mol/L的PBS緩沖溶液中、攪拌下加入碳二亞胺EDC交聯(lián)劑，EDC 摩爾用量為氟乙酸鈉摩爾量的1/10，反應3h， 4。C透析3天，形成氟乙酸鈉-OVA 偶聯(lián)物；(2) 制備抗氟乙酸鈉的多克隆抗體用EDC法制備氟乙酸鈉-BSA偶聯(lián)物， 用氟乙酸鈉HBSA偶聯(lián)物免疫得到抗氟乙酸鈉的多克隆抗體；(3) 制備膠體金用檸檬酸三鈉還原劑將氯金酸還原制成20nm-40nm膠體 金顆粒；(4) 制備抗氟乙酰胺類毒藥的簇特異性抗體-膠體金標記物將3mL膠體 金調(diào)至pH9，攪拌下逐滴加入蛋白濃度為0.075mg/mL的抗氟乙酸鈉的多克隆抗 體0.2mL，放置30min后加入牛血清蛋白BSA使終濃度為1%，放置至少30min 后，10000轉(zhuǎn)60min離心并用pH 9.0、 0.002mol/L的硼酸鹽緩沖液3mL重懸兩 次，最后用0.3mL重懸液重懸，得到穩(wěn)定的抗氟乙酸鈉抗體-膠體金標記物；(5) 將抗氟乙酸鈉抗體-膠體金標記物包被在金標墊上，將氟乙酸鈉-OVA 偶聯(lián)物和羊抗兔IgG分別包被在作為反應點的硝酸纖維素膜的測試線和質(zhì)控線， 在37。C烘箱充分干燥；(6) 試紙條的組裝將樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊由一端依 次黏附在PVC背襯上，用切條機切割成3mm寬的細條，即得到用于檢測的免 疫層析檢測試紙條。
全文摘要
一種氟乙酰胺類毒藥的免疫層析檢測試紙條及其制備方法，屬于免疫檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明以一種抗氟乙酸鈉的簇特異性抗體與顯色物質(zhì)膠體金的結(jié)合物作為檢測試劑組裝試劑條，進行氟乙酰胺類毒藥的中毒篩選檢測，成本低廉，快速，僅需要5-10分鐘；便攜，適合現(xiàn)場檢測；操作簡便，不需要專業(yè)技術(shù)人員。本發(fā)明可以用于氟乙酰胺類毒藥的中毒篩選檢測。
文檔編號G01N33/558GK101403755SQ200810195528
公開日2009年4月8日 申請日期2008年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月16日
發(fā)明者劉麗強, 彭池方, 朱穎越, 胥傳來, 謝會玲, 偉 陳 申請人:江南大學