專利名稱：一種檢測(cè)腸病毒的快速檢測(cè)試紙及其制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種檢測(cè)腸病毒的快速檢測(cè)試紙以及其制造方法，尤其是檢測(cè)可導(dǎo)致手足口病的腸病毒EV71和Coxsackievirus A16病毒的快速檢測(cè)試紙。
背景技術(shù)：
手足口病(Hand foot mouth disease, HFMD)是全球性傳染病，世界大部分地區(qū)均有此病流行的報(bào)導(dǎo)，是由腸病毒引起的傳染病，多發(fā)生于5歲以下的嬰幼兒，可引起發(fā)熱和手、足、口腔等部位的皮疹、潰瘍，個(gè)別患者可引起心肌炎、肺水腫、無(wú)菌性腦膜腦炎等并發(fā)癥。引發(fā)手足口病的腸道病毒有20多種，其中柯薩奇病毒(CoxAsckievirus)A16型(CoxA16)和腸道病毒71型(Enterovirus71.EV71)最常見。
澳大利亞和美國(guó)、瑞典一樣，是最早出現(xiàn)EV71感染的國(guó)家之一。1972 1973年、1986年和1999年澳大利亞均發(fā)生過(guò)EV71流行，重癥病人大多伴有中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀(CNS)， 一些病人還有嚴(yán)重的呼吸系統(tǒng)癥狀。20世紀(jì)70年代中期，保加利亞、匈牙利相繼暴發(fā)以CNS為主要臨床特征的EV71流行，僅保加利亞就超過(guò)750例發(fā)病，149人致癱，44人死亡。英國(guó)1994年4季度暴發(fā)了一起遍布英格蘭威爾士由CoxA16引起的手足口病流行，監(jiān)測(cè)哨點(diǎn)共觀察到952個(gè)病例，為該國(guó)有記錄以來(lái)的最大一次流行，患者大多1 4歲，大部分病人癥狀平和。該國(guó)1963年以來(lái)的流行病資料數(shù)據(jù)顯示，手足口病流行的間隔期為2 3年。其它國(guó)家如意大利、法國(guó)、荷蘭、西班牙、羅馬尼亞、巴西、加拿大、德國(guó)也經(jīng)常發(fā)生由各型柯薩奇、?？刹《竞虴V71引起的手足口病。日本是手足口病發(fā)病較多的國(guó)家，歷史上有過(guò)多次大規(guī)模流行，1969 1970年的流行以CoxA16感染為主，1973和1978年的2次流行均為EV71引起，主要臨床癥狀為手足口病，病情一般較溫和，但同時(shí)也觀察到伴無(wú)菌性腦膜炎的病例。1997 2000年手足口病在閂本再度活躍，EV71、 CoxA16均有分離，EV71毒株的基因型也與以往不同。20世紀(jì)90年代后期，EV71開始肆虐東亞地區(qū)。1997年馬來(lái)西亞發(fā)生了主要由EV71引起的手足口病流行，4 8月共有2628例發(fā)病，僅4 6月就有29例病人死亡。死者平均年齡1.5歲，病程僅2天，100%發(fā)熱，62%手足皮疹，66%口腔潰瘍，28%病癥發(fā)展迅速，17%肢軟癱，17例胸片顯示肺水腫。
年3月份以來(lái)，我國(guó)安徽省阜陽(yáng)市也發(fā)生了較大規(guī)模的手足口病疫情。截至5月1日，安徽阜陽(yáng)累計(jì)報(bào)告手足口病3321例，其中22例死亡；有978例正在住院治療，其中重癥病例48人，病危10例；正在接受門診治療1209人；已治愈1112人。EV71感染引起重癥的比例高于其他類型腸道病毒，重癥患兒病死率較高，目前尚無(wú)疫苗和特效治療藥物。因此，能夠及時(shí)檢測(cè)出患者體內(nèi)攜帶的EV71病毒和CoxA16病毒，有助于及早發(fā)現(xiàn)并控制疫情，對(duì)患者及早治療，挽救生命。
目前，檢測(cè)腸道病毒，國(guó)內(nèi)外多采用病毒分離、免疫熒光法、PCR等檢測(cè)手段。病毒分離法耗時(shí)太長(zhǎng)且成本較高；免疫熒光法需要昂貴的熒光顯微鏡且標(biāo)本不易保存；PCR方法不
3能區(qū)別有感染毒力的病毒和死病毒，同時(shí)上述方法均需專業(yè)人員操作。
正是因?yàn)楝F(xiàn)有檢測(cè)方法的落后，因此開發(fā)出使用方便，檢測(cè)靈敏，價(jià)格低廉的檢測(cè)產(chǎn)品是當(dāng)務(wù)之急。
顏色顆粒免疫層析分析為腸病毒的檢測(cè)提供了一個(gè)新的檢測(cè)途徑。免疫微粒技術(shù)是利用高分子材料合成一定粒度大小的固相微粒作為載體，包被上具有特異性親和力的各種免疫活性物質(zhì)(抗原或抗體)，用于免疫學(xué)及其他生物學(xué)檢測(cè)與分離的一項(xiàng)技術(shù)。作為載體的微粒通常是以某種高分子有機(jī)單體為原料，經(jīng)過(guò)乳液聚合、懸浮聚合及輻照聚合等高分子聚合方法制備而成。由于制備材料及工藝不同，微粒的種類繁多，現(xiàn)已制成惰性微粒如聚苯乙烯膠乳微粒、活性微粒如羧化聚苯乙烯微粒、磁性微粒及標(biāo)記微粒(用同位素、熒光素或酶標(biāo)記)等四大類微粒，數(shù)量多達(dá)幾十種。將制備好的微粒與抗原(或抗體)經(jīng)物理吸附、化學(xué)偶聯(lián)及生物素親合素橋聯(lián)法等致敏方法形成免疫微粒。廣泛應(yīng)用于各種可溶性大分子物質(zhì)的檢測(cè)、分離與純化、細(xì)胞標(biāo)記與識(shí)別等。近年來(lái)，微粒技術(shù)在核酸分子雜交、DNA與RNA的分離及PCR等研究領(lǐng)域亦顯示出廣闊的應(yīng)用前景。
乳膠微粒作為免疫微粒的一種，采用合成高分子乳膠微球，即羧化的聚苯乙烯乳膠作為載體，將抗體或抗原通過(guò)物理吸附固載于微球表面而形成免疫乳膠診斷試劑，通過(guò)膠乳凝集實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)對(duì)應(yīng)的抗原或抗體。制備成的乳膠診斷試劑，用于診斷多種疾病，具有簡(jiǎn)便、快速、靈敏、價(jià)廉及操作容易等優(yōu)點(diǎn)。
膠體金免疫層析技術(shù)是20世紀(jì)90年代以來(lái)在單克隆抗體技術(shù)、免疫層析技術(shù)及膠體金顯色技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型體外診斷技術(shù)，是根據(jù)免疫反應(yīng)原理，利用大孔徑微孔濾膜為載體，以膠體金作為固相標(biāo)記物來(lái)檢測(cè)樣本中待測(cè)物質(zhì)的一種快速免疫分析技術(shù)。
本發(fā)明在顏色顆粒免疫層析技術(shù)原理基礎(chǔ)上，改進(jìn)檢測(cè)方法，建立了采用膠體金法及乳膠法檢測(cè)腸病毒的方法。檢測(cè)方法的改進(jìn)，使檢測(cè)更方便，結(jié)果更準(zhǔn)確，具有快速、靈敏、操作簡(jiǎn)便、成本低、無(wú)需專業(yè)人員操作等特點(diǎn)，真正達(dá)到復(fù)雜原理與簡(jiǎn)易操作的有機(jī)統(tǒng)一。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明為解決上述現(xiàn)有技術(shù)中存在的問(wèn)題，提供了一種采用顏色顆粒免疫層析法來(lái)檢測(cè)EV71和Cox A16病毒的快速檢測(cè)試紙。其使用方便、結(jié)果準(zhǔn)確、成本低、運(yùn)輸儲(chǔ)存簡(jiǎn)便，且無(wú)需專業(yè)人員操作。本發(fā)明還提供了制備這種試紙的方法。
為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種檢測(cè)EV71和Cox A16病毒快速檢測(cè)試紙，由底板、吸水板、硝酸纖維素膜、病毒顏色顆粒儲(chǔ)藏墊、樣品吸液層組成；底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上設(shè)置有一條或兩條檢測(cè)線和一條多克隆抗體控制線，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和病毒顏色顆粒儲(chǔ)藏墊相互交疊連接，在病毒顏色顆粒儲(chǔ)藏墊上壓有樣品吸液層，利用顏色顆粒免疫層析法來(lái)檢測(cè)病毒。
上述病毒單克隆抗體可以是EV71病毒單克隆抗體和/或Cox A16病毒單克隆抗體，也可以是二者的混合。
顏色顆?？梢允且环N金屬溶膠顆粒，可包括膠體金顆粒、銀顆粒、鐵顆粒、磁性顆粒等；一種標(biāo)記顆粒，可包括染料顆粒、乳膠顆粒、熒光顆粒等。其中，膠體金顆粒的顆粒直徑大小為納米級(jí)，乳膠顆粒直徑大小0.01 10ura;金屬溶膠顆粒的吸附機(jī)理是利用它在堿性條件下帶負(fù)電荷的性質(zhì)，與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)，靠靜電吸引而結(jié)合；乳膠顆粒是利用化
學(xué)結(jié)合的方式與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，形成免疫診斷試劑。
樣品吸液層由三層材料疊加組成，依次為10 25g/n^無(wú)紡布層、玻璃纖維層、10 25g/m2無(wú)紡布層，上述物質(zhì)均需經(jīng)過(guò)表面活性劑緩沖液浸泡處理，干燥后備用，上述裝置除有毛細(xì)管作用原理外，還有虹吸作用原理，大大加快吸水移動(dòng)速度。
用滅活的EV71病毒或CoxA16病毒免疫小鼠，細(xì)胞株注射鼠腹腔，提取腹水迷行純化，在篩選出的雜交瘤細(xì)胞株中，分別獲得2株高純度、配對(duì)的EV71病毒單克隆抗體細(xì)胞株和CoxA16病毒單克隆抗體細(xì)胞株， 一株用于檢測(cè)線包被， 一株可用于顏色顆粒標(biāo)記。
把試紙樣品吸液層放入待測(cè)樣本中(液面不得超過(guò)MAX線)，由于毛細(xì)管作用樣品將沿著試紙條向吸水板移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)至顏色顆粒儲(chǔ)藏墊時(shí)，樣品中的EV71病毒和/或CoxA16病毒抗原分別與EV71或Cox A16病毒單克隆抗體標(biāo)記探針發(fā)生特異結(jié)合，當(dāng)移動(dòng)至檢測(cè)線時(shí)，樣品中EV71和/或Cox A16病毒抗原又與檢測(cè)線中相應(yīng)病毒單克隆抗體相結(jié)合，因此其顏色顆粒滯留于檢測(cè)線上，檢測(cè)線處顯示紅色為陽(yáng)性；相反如果待測(cè)樣本中沒(méi)有EV71病毒或CoxA16病毒，相應(yīng)病毒單克隆抗體標(biāo)記探針就不會(huì)與檢測(cè)線上對(duì)應(yīng)病毒的單克隆抗體發(fā)生特異結(jié)合，沒(méi)有顏色顆粒滯留，即僅有一條紅色控制線為陰性，這就是采用的本試紙雙抗夾心法原理。根據(jù)此原理，兩條線為陽(yáng)性， 一條線為陰性得出判斷。
硝酸纖維素膜上設(shè)置的控制線是由羊抗鼠多克隆抗體包被而成，當(dāng)樣品通過(guò)顏色顆粒標(biāo)記的EV71和/或Cox A16病毒單克隆抗體移動(dòng)至羊抗鼠多克隆抗體控制線時(shí)，無(wú)論樣品中有無(wú)EV71和/或CoxA16病毒，都會(huì)與已設(shè)定好的羊抗鼠多克隆抗體結(jié)合滯留，使控制線顯示紅色。因此控制線無(wú)色帶產(chǎn)生則代表操作有誤，檢測(cè)時(shí)樣品液面超過(guò)MAX線或試紙已經(jīng)過(guò)期。
由于采用上述技術(shù)方案，本發(fā)明所提供的EV71和/或Cox A16病毒快速檢測(cè)試紙具有這樣的有益效果，即方便快速、可移動(dòng)、便于腸病毒的現(xiàn)場(chǎng)篩査工作，且特異性強(qiáng)，靈敏度高，無(wú)須專門技術(shù)人員操作，而且結(jié)果易讀。


圖l本發(fā)明的一種實(shí)施方式的結(jié)構(gòu)示意2本發(fā)明的一種實(shí)施方式的檢測(cè)結(jié)果示意3本發(fā)明的另一種實(shí)施方式的結(jié)構(gòu)示意4本發(fā)明的另一種實(shí)施方式的檢測(cè)結(jié)果示意圖附圖標(biāo)記
底板l;硝酸纖維素膜2;控制線4;檢測(cè)線3;顏色顆粒儲(chǔ)藏墊5;樣品吸液層6;吸水板7。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步解釋如圖1到圖4所示， 一種手足口病快速檢測(cè)試紙，包括底板l、吸水板7、硝酸纖維素膜 2、顏色顆粒儲(chǔ)藏墊5、樣品吸液層6;底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上設(shè)置有一 條檢測(cè)線3和一條多克隆抗體控制線4，底板一端端頭為吸水板7，另一端端頭為樣品吸液層， 硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和病毒顏色顆粒儲(chǔ)藏墊相互交疊連接，在病毒顏色顆粒儲(chǔ)藏 墊上壓有樣品吸液層，利用顏色顆粒免疫層析法來(lái)檢測(cè)EV71和/或Cox A16病毒。
實(shí)施例1:抗EV71病毒單克隆抗體的制備
1. 雜交瘤細(xì)胞的制備
(1) SP2/0骨髓瘤細(xì)胞在含有10%小牛血清DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)48-72小時(shí)，待細(xì)胞生長(zhǎng)良好， 準(zhǔn)備融合。
(2) 抗原免疫EV71抗原10ug與等量完全福氏佐劑乳化后皮下注射，進(jìn)行基礎(chǔ)免疫。融合前 3天，在小鼠脾內(nèi)和腹腔分別注射上述EV71抗原10ug。
(3) 制備免疫脾細(xì)胞最后一次加強(qiáng)免疫3天后處死小鼠，無(wú)菌取脾淋巴細(xì)胞。
(4) 細(xì)胞融合
融合劑PEG (4000);培養(yǎng)液10y。小牛血清DMEM。 SP2/0骨髓瘤細(xì)胞和免疫的BALB/C鼠 的淋巴細(xì)胞按l: 10或1: 5的比例融合。
(5) 抗體的檢測(cè)
雜交瘤細(xì)胞在96孔板培養(yǎng)一周后，即開始用ELISA法檢測(cè)特異性抗體。-4° C過(guò)夜包被 EV71抗原lug/ml，次日洗滌后，加入培養(yǎng)上清100ul，加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG 抗體反應(yīng)，篩選陽(yáng)性孔。
(6) 克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)按常規(guī)方法克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)。按照常規(guī)方法篩選單克隆抗體細(xì)胞 株，獲得兩株高純度、配對(duì)的EV71病毒單克隆抗體細(xì)胞株。
2. 單克隆抗體的制備
(1)可采用常規(guī)技術(shù)生產(chǎn)單克隆抗體，例如，小鼠腹水法生產(chǎn)單克隆抗體，或體外無(wú)血清培 養(yǎng)法。
實(shí)施例2:
一種EV71病毒膠體金檢測(cè)試紙，如圖1所示，包括底板1、吸水板7、硝酸纖維素膜2、 顏色顆粒儲(chǔ)藏墊5、樣品吸液層6，其中，顏色顆粒儲(chǔ)藏墊5優(yōu)選為EV71病毒單克隆抗體金 標(biāo)墊；底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上設(shè)置有一條檢測(cè)線3和一條多克隆抗體控 制線4，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水 板和EV71病毒單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接，在EV71病毒單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品 吸液層.，利用膠體金免疫層析法來(lái)檢測(cè)EV71病毒。
試紙制法
1.將上述兩株細(xì)胞株產(chǎn)生的兩種EV71單克隆抗體， 一種用于檢測(cè)線包被， 一種用于膠體金 標(biāo)記。
62. 膠體金的制備及與EV71病毒單克隆抗體的結(jié)合
(1) 取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到9(TC，加入適量擰檬酸三納繼續(xù)加熱攪拌 至沸騰3 10分鐘，優(yōu)選5分鐘，冷卻后避光保存?zhèn)溆谩?br> (2) 膠體金-抗體結(jié)合物制備及純化
二蒸水溶解氯金酸，加熱至沸騰，至終濃度為0. 01%,每100ml加入10%檸檬酸三鈉水溶 液1. 5ml。再煮沸10min呈橙紅色，冷卻后用0. 2mol/L {(20)3調(diào)至？朋.5,按照l(shuí)-3mg抗體/100ml 膠體金加入純化的EV71抗體IgG，優(yōu)選2mg抗體/100ml膠體金，然后加入牛血清白蛋白 250mg/100ml膠體金，快速攪拌10min，加入l.O柳aCl，使NaCl的濃度為1%，搖勻，分別以 2000、 4000、 10000 r/min梯度離心，10min/次，最后獲得沉淀物即為初步純化的進(jìn)標(biāo)記抗 EV71結(jié)合物，溶于儲(chǔ)存液。取膠體金-抗體結(jié)合物溶液，均勻噴在玻璃纖維素膜上，放在平 坦的塑料板上，然后冷凍1小時(shí)，放入冷凍干燥機(jī)上凍干過(guò)夜，至完全干燥后切條，干燥環(huán) 境中保存。
3. 膜的制備將實(shí)施例1制備的抗EV71單克隆抗體用0. 01MPBS稀釋成3. 5呢/ml。用噴膜 機(jī)將以上抗體已lul/cm的速度噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測(cè)線。
將羊抗鼠IgG多克隆抗體用0. 01MPBS稀釋成2mg/ml。用噴膜機(jī)將以上抗體以lu]/cm的速度 噴于硝酸纖維素膜上，形成控制線。
把固定有抗體的硝酸纖維素膜晾干后，置于25-37° C封閉液中浸泡60分鐘。 將封閉后的硝酸纖維素膜置于37。 C烤箱中干燥30分鐘。充分干燥備用。
4. 試紙條按公知技術(shù)組合，如圖1所示。
5. 使用方法及結(jié)果判斷使用時(shí)，把試紙樣品吸液層放入待測(cè)樣本中(例如，血液、血漿樣 本，便樣稀釋液，唾液等)，5分鐘時(shí)觀察結(jié)果。若檢測(cè)EV71病毒濃度高于檢出量，觀察窗 處出現(xiàn)兩條紅線為陽(yáng)性，如圖2所示；低于界限值，出現(xiàn)一條紅線為陰性；控制線無(wú)色帶產(chǎn) 生代表操作有誤或試紙已經(jīng)過(guò)期。
實(shí)施例3:
一種EV71病毒乳膠檢測(cè)試紙，包括底板l、吸水板7、硝酸纖維素膜2、顏色顆粒儲(chǔ)藏 墊5、樣品吸液層6，其中，顏色顆粒儲(chǔ)藏墊5優(yōu)選為EV71單克隆抗體乳膠微粒儲(chǔ)藏墊；底 板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上設(shè)置有一條檢測(cè)線3和一條多克隆抗體控制線4， 底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和EV71 單克隆抗體顏色顆粒儲(chǔ)藏墊相互交疊連接，在EV71單克隆抗體顏色顆粒儲(chǔ)藏墊上壓有樣品吸 液層，利用乳膠層析法來(lái)檢測(cè)EV71病毒。
試紙制法
1. 將上述兩株細(xì)胞株產(chǎn)生的兩種EV71單克隆抗體， 一種用于檢測(cè)線包被， 一種用于乳膠微 粒標(biāo)記。
2. 乳膠微粒的制備1) 取乳膠溶液100ul，加入硼砂緩沖液900ul，高速離心10min;
2) 棄上清，加入硼砂緩沖液洗滌，再次高速離心10min;
3) 棄上清，加入硼砂緩沖液懸浮沉淀，加入EV71單克隆抗體20ug，體積定容至lml;
4) 向"3"所得溶液中加入10ulEDC (15mg/ml)，孵育4h，高速離心10min;
5) 棄上清，用封閉液(5% BSA)懸浮沉淀，封閉過(guò)夜。
3. 膜的制備機(jī)器制膜，利用電腦控制傳動(dòng)速度，保證每單位膜上包被的抗體量相等。
檢測(cè)線另一株EV71病毒單克隆抗體
控制線羊抗鼠多克隆抗體
4. 試紙條按公知技術(shù)組合。
5. 使用方法及結(jié)果判斷使用時(shí)，把試紙樣品吸液層放入待測(cè)樣本中，5分鐘時(shí)觀察結(jié)果。 若檢測(cè)EV71病毒濃度高于檢出量，觀察窗處出現(xiàn)兩條紅線為陽(yáng)性；低于界限值，出現(xiàn)一條 紅線為陰性；控制線無(wú)色帶產(chǎn)生代表操作有誤或試紙已經(jīng)過(guò)期。
實(shí)施例4抗CoxA16病毒單克隆抗體的制備
制備方法同實(shí)施例l。其中，免疫小鼠的免疫量為皮下注射Cox A16抗原10ug，加完全福 氏佐劑，進(jìn)行基礎(chǔ)免疫。融合前3天，在小鼠脾內(nèi)和腹腔分別注射上述EV71抗原10ug。
實(shí)施例5
一種CoxA16病毒膠體金檢測(cè)試紙，包括底板l、吸水板7、硝酸纖維素膜2、顏色顆粒 儲(chǔ)藏墊5、樣品吸液層6，其中顏色顆粒儲(chǔ)藏墊優(yōu)選為CoxA16單克隆抗體金標(biāo)墊；底板中部 為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上設(shè)置有一條檢測(cè)線3和一條多克隆抗體控制線4，底板一 端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水板和Cox A16單 克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接，在CoxA16病毒單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層，利用 膠體金免疫層析法來(lái)檢測(cè)Cox A16病毒。
試紙制法及使用方法與實(shí)施例2相同。
實(shí)施例6
一種CoxA16病毒乳膠檢測(cè)試紙，包括底板l、吸水板7、硝酸纖維素膜2、顏色顆粒儲(chǔ) 藏墊5、樣品吸液層6，其中顏色顆粒儲(chǔ)藏墊優(yōu)選為CoxA16單克隆抗體乳膠為例儲(chǔ)藏墊；底 板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上設(shè)置有一條檢測(cè)線3和一條多克隆抗體控制線4， 底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸水銜和Cox A16病毒顏色顆粒儲(chǔ)藏墊相互交疊連接，在Cox A16病毒顏色顆粒儲(chǔ)藏墊上壓有樣品吸液層， 利用乳膠層析法來(lái)檢測(cè)Cox A16病毒。 試紙制法及使用方法與實(shí)施例3相同。
實(shí)施例7
8一種EV71和CoxA16病毒聯(lián)合膠體金檢測(cè)試紙，如圖3所示，包括底板1、吸水板7、 硝酸纖維素膜2、顏色顆粒儲(chǔ)藏墊5、樣品吸液層6，其中，顏色顆粒儲(chǔ)藏墊5優(yōu)選為含有EV71 單克隆抗體和Cox A16單克隆抗體的金標(biāo)墊，兩種單克隆抗體的含量比為1: 4至4: 1，優(yōu)
選l: 1;底板中部為硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上設(shè)置有兩條檢測(cè)線3和一條多克隆抗體 控制線4，底板一端端頭為吸水板，另一端端頭為樣品吸液層，硝酸纖維素膜兩端分別與吸
水板和病毒單克隆抗體金標(biāo)墊相互交疊連接，在病毒單克隆抗體金標(biāo)墊上壓有樣品吸液層，
利用膠體金免疫層析法來(lái)檢測(cè)EV71病毒和Cox A16病毒。
試紙制法
1.膠體金的制備及與EV71病毒單克隆抗體的結(jié)合
(1) 取雙蒸水加適量的氯金酸磁力攪拌加溫到9(TC，加入適量檸檬酸三納繼續(xù)加熱攪拌 至沸騰3 10分鐘，優(yōu)選5分鐘，冷卻后避光保存?zhèn)溆谩?br> (2) 膠體金-抗體結(jié)合物制備及純化
三蒸水溶解氯金酸，加熱至沸騰，至終濃度為0.01%，每100ml加入10%檸檬酸三鈉水溶 液1.5ml。再煮沸10min呈橙紅色，冷卻后用0. 2mol/L 1(2(:03調(diào)至pH8. 5，快速攪拌下加入實(shí) 施例1中純化的一株EV71抗體IgG 2mg和實(shí)施例4中純化的一株Cox A16單克隆抗體2mg， 加入牛血清的蛋白250mg，快速攪拌10min，加入10%NaCl，使NaCl的濃度為1%，搖勻，分 別以2000、 4000、 10000 r/min梯度離心，10min/次，最后獲得沉淀物即為初步純化的金標(biāo) 記抗EV71和Cox A16聯(lián)合結(jié)合物。取膠體金-抗體結(jié)合物溶液，均勻噴在玻璃纖維素膜上， 放在平坦的塑料板上，然后冷凍1小時(shí)，放入冷凍干燥機(jī)上凍干過(guò)夜，至完全干燥后切條， 干燥環(huán)境中保存。
3. 膜的制備將實(shí)施例1制備的另一株抗EV71單克隆抗體用0. 01MPBS稀釋成3. 5mg/ml。 用噴膜機(jī)將以上抗體已lul/cm的速度噴于硝酸纖維素膜上，形成檢測(cè)線。
將實(shí)施例3制備的另一株Cox A16單克隆抗體用0. 01M PBS稀釋成3. 5mg/ml。用噴膜機(jī)將此 抗體以lul/cm的速度噴于硝酸纖維素膜上，形成另外一條檢測(cè)線。
將羊抗鼠IgG多克隆抗體用0. 01MPBS稀釋成2mg/ml。用噴膜機(jī)將以上抗體以lul/cm的速度 噴于硝酸纖維素膜上，形成控制線。
把固定有抗體的硝酸纖維素膜晾干后，置于25-37° C封閉液中浸泡60分鐘。 將封閉后的硝酸纖維素膜置于37。 C烤箱中干燥30分鐘。充分干燥備用。
4. 試紙條按公知技術(shù)組合。
5. 使用方法及結(jié)果判斷使用時(shí)，把試紙樣品吸液層放入待測(cè)樣本中，5分鐘時(shí)觀察結(jié)果。 若檢測(cè)EV71或Cox A16病毒濃度高于檢出量，觀察窗處噴有相應(yīng)病毒單克隆抗體的位置出 現(xiàn)紅線，同時(shí)控制線處也出現(xiàn)紅線，即出現(xiàn)兩條檢測(cè)線和一條控制先，則結(jié)果為陽(yáng)性，如圖 4所示；低于界限值，出現(xiàn)一條紅線為陰性；控制線無(wú)色帶產(chǎn)生代表操作有誤或試紙已經(jīng)過(guò) 期。實(shí)施例8
根據(jù)實(shí)施例7所述的EV71和Cox A16病毒聯(lián)合膠體金檢測(cè)試紙，在膜的制備過(guò)程中， 還可將EV71單克隆抗體和Cox A16單克隆抗體混合后，再用0.01M PBS稀釋成3.5mg/ml 后用噴膜機(jī)以lul/cm的速度噴膜，形成一條混合檢測(cè)線。其中，EV71單克隆抗體與CoxA16
單克隆抗體的混合比為l: 4至4: 1，優(yōu)選l: 1。
使用時(shí)，把試紙樣品吸液層放入待測(cè)樣本中，5分鐘時(shí)觀察結(jié)果。若樣本中EV71或Cox A16病毒其中的任何一種或兩種的濃度高于檢出量，觀察窗處噴有混合單克隆抗體的位置出 現(xiàn)紅線，同時(shí)控制線處也出現(xiàn)紅線，則結(jié)果為陽(yáng)性；低于界限值，出現(xiàn)一條紅色控制線為陰 性；控制線無(wú)色帶產(chǎn)生代表操作有誤或試紙已經(jīng)過(guò)期。
實(shí)施例9
實(shí)施例7或8中的EV71和Cox A16病毒聯(lián)合膠體金檢測(cè)試紙，還可按照實(shí)施例2和3 中單克隆抗體金標(biāo)墊的制備方法，分別制備EV71單克隆抗體金標(biāo)墊和Cox A16單克隆抗體 金標(biāo)墊，然后疊加為兩層使用，以代替含有EV71單克隆抗體和CoxA16單克隆抗體的混合金 標(biāo)墊，此種方法在生產(chǎn)過(guò)程中更為簡(jiǎn)便。
另外，還可將實(shí)施例7、 8或9中的膠體金標(biāo)記方法替換為乳膠微粒標(biāo)記，制成EV71和 CoxA16病毒聯(lián)合乳膠層析檢測(cè)試紙。標(biāo)記方法同實(shí)施例3。
權(quán)利要求
1.一種檢測(cè)腸病毒的快速檢測(cè)試紙，其包含背板、吸水板、樣品吸液層、硝酸纖維素膜、顏色顆粒儲(chǔ)藏墊，其特征在于所述硝酸纖維素膜上設(shè)有至少一條單克隆抗體檢測(cè)線和多克隆抗體控制線，顏色顆粒儲(chǔ)藏墊中含有單克隆抗體包附的顏色顆粒；上述單克隆抗體選自下列中的至少一種腸道病毒EV71小鼠單克隆抗體；科薩奇病毒Coxsackievirus A16小鼠單克隆抗體。
2. 權(quán)利要求1中所述檢測(cè)腸病毒的快速檢測(cè)試紙，其特征在于所述顏色顆?？梢允且环N膠體金顆粒、 膠體銀顆粒、膠體鐵顆粒、磁性顆粒、染料顆粒、乳膠顆粒、或熒光顆粒。
3. 權(quán)利要求2中所述檢測(cè)腸病毒的快速檢測(cè)試紙，其特征在于所述顏色顆粒優(yōu)選膠體金顆粒，其顆粒直徑為納米級(jí)。
4. 權(quán)利要求2中所述檢測(cè)腸病毒的快速檢測(cè)試紙，其特征在于所述顏色顆粒優(yōu)選乳膠顆粒，其顆粒直 徑為0.01 10um。
5. 權(quán)利要求1中所述檢測(cè)腸病毒的快速檢測(cè)試紙，其特征在于所述顏色顆粒儲(chǔ)藏墊中含有EV71病毒 單克隆抗體和Coxsackievirus A16病毒單克隆抗體混合包附的顏色顆粒。
6. 權(quán)利要求5中所述檢測(cè)腸病毒的快速檢測(cè)試紙，其特征在于所述硝酸纖維素膜上設(shè)有兩條檢測(cè)線， 其中一條為EV71病毒單克隆抗體噴涂的檢測(cè)線，另一條為Coxsackievirus A16病毒單克隆抗體噴涂 的檢測(cè)線。
7. 權(quán)利要求5中所述檢測(cè)腸病毒的快速檢測(cè)試紙，其特征在于所述硝酸纖維素膜上設(shè)有一條由EV71 病毒單克隆抗體和Coxsackievirus A16病毒單克隆抗體混合噴涂的檢測(cè)線。
8. —種制備權(quán)利要求1中所述檢測(cè)腸病毒的快速檢測(cè)試紙的方法，其特征在于包括以下步驟(1) 單克隆抗體的制備SP2/0骨髓瘤細(xì)胞與抗原免疫過(guò)的小鼠脾淋巴細(xì)胞融合，形成雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)過(guò)篩選后，分別獲得兩株能夠產(chǎn)生高純度、配對(duì)的腸病毒EV71單克隆抗體的細(xì)胞株和兩株 能夠產(chǎn)生高純度、配對(duì)的科薩奇病毒(Coxsackievirus) A16單克隆抗體的細(xì)胞株。(2) 用顏色顆粒標(biāo)記單克隆抗體；(3) 膜的制備將上述步驟(1)中制備的另一株EV71單克隆抗體或科薩奇A16單克隆抗體用 0.01MPBS稀釋成3.5mg/ml，用噴膜機(jī)將以上抗體以lul/cm的速度噴于硝酸纖維素膜上，形 成檢測(cè)線；將多克隆抗體稀釋成2mg/ml，用噴膜機(jī)以lul/cm的速度噴于硝酸；將膜晾干后， 在25-37° C封閉液中浸泡60分鐘，取出后充分干燥，備用；(4) 將步驟(2)中制備的顏色顆粒標(biāo)記抗體涂覆到玻璃纖維膜上，形成顏色顆粒儲(chǔ)藏墊。(5) 在底板上順次相互搭接的粘貼樣品吸液層、顏色顆粒儲(chǔ)藏墊、硝酸纖維素膜、吸水板。
9. 權(quán)利要求8中所述的制備檢測(cè)腸病毒的快速檢測(cè)試紙的方法，其特征在于步驟(2)中采用膠體金標(biāo) 記抗體，其制備方法是用0.2mol/LK2CO3調(diào)至膠體金pH至8.5，攪拌下加入純化的EV71單克隆抗 體或科薩奇A16單克隆抗體l-3mg/100ml膠體金，然后加入牛血清蛋白250mg,攪拌后加入NaCl， 使其濃度為1%，搖勻后離心，將沉淀溶于儲(chǔ)存液中備用。
10. 權(quán)利要求8中所述的制備檢測(cè)腸病毒的快速檢測(cè)試紙的方法，其特征在于步驟(2)中采用乳膠顆粒 標(biāo)記抗體，其制備方法是取乳膠溶液100ul，加入硼砂緩沖液900ul，離心后去上清，用硼砂緩沖液 洗滌、離心、去上清后，再加入硼砂緩沖液懸浮沉淀，加入EV71單克隆抗體或科薩奇A16單克隆抗 體20ug，體積定容至lml，再向所得溶液中加入10ull5mg/ml的EDC,孕育4小時(shí)后離心，棄上清， 用5%BSA懸浮沉淀，封閉過(guò)夜。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測(cè)腸病毒的快速檢測(cè)試紙及其制造方法。其通過(guò)顏色顆粒標(biāo)記的免疫層析法檢測(cè)樣本中的腸病毒EV71和Coxsackievirus A16病毒。本發(fā)明的快速檢測(cè)試紙條是在底板上順次相互搭接的粘貼樣品吸液層、顏色顆粒儲(chǔ)藏墊、硝酸纖維素膜和吸水板而形成的檢測(cè)試紙條。其中顏色顆粒儲(chǔ)藏墊上涂覆有顏色顆粒標(biāo)記的單克隆抗體，硝酸纖維素膜上設(shè)有EV71和/或Coxsackievirus A16單克隆抗體噴涂的試驗(yàn)線和抗鼠IgG多克隆抗體噴涂的控制線。本發(fā)明能夠分別或同時(shí)檢測(cè)樣本中的EV71和Coxsackievirus A16病毒，能夠盡早發(fā)現(xiàn)由這些病毒感染所引起的疫情，并且具有操作簡(jiǎn)便、快速獲得結(jié)果、無(wú)需專業(yè)人員操作等優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)G01N33/569GK101650366SQ20081014735
公開日2010年2月17日 申請(qǐng)日期2008年8月11日 優(yōu)先權(quán)日2008年8月11日
發(fā)明者萬(wàn)志強(qiáng), 萬(wàn)志靜 申請(qǐng)人:萬(wàn)志靜;萬(wàn)志強(qiáng)