專利名稱：：一種可兼用作溶血?jiǎng)┑钠颇┘捌溆梅ǖ闹谱鞣椒?br>技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)療檢測(cè)用試劑領(lǐng)域。具體涉及用于流式細(xì)胞儀的輔助檢測(cè)用試劑。
背景技術(shù)：
：隨著流式細(xì)胞儀的普及和應(yīng)用，其配套試劑的開(kāi)發(fā)和研制也曰益重要。目前，國(guó)內(nèi)很多醫(yī)院和實(shí)驗(yàn)室都使用國(guó)外進(jìn)口的溶血?jiǎng)┖推颇鏐DIS，BD-Pharmingen，Immunotech，Caltag等公司的產(chǎn)品。普遍存在用途單一、裂解不完全、目的細(xì)胞丟失、價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)，提供用于流式細(xì)胞分析的破膜劑，以及將其稀釋后的溶血?jiǎng)?，其檢測(cè)的特異性和敏感性等方面明顯優(yōu)于進(jìn)口試劑，檢測(cè)成本低，穩(wěn)定性好，使用簡(jiǎn)便易行，適用于科研和臨床流式檢測(cè)。本發(fā)明還提供此破膜劑的配制方法和使用方法。本發(fā)明涉及的破膜劑的主要成分和配制方法為皂角苷(saponin)0.1-0.5%疊氣化鈉(NaN3)0.05-0.5%多聚甲醛(paraformaldehyde)1-4%;首先準(zhǔn)確稱取多聚甲醛，置于0.01M磷酸鹽緩沖液(Phosphatebufferedsaline,簡(jiǎn)稱PBS)中，在37匸水浴箱中水洛l-2小時(shí)。若有部分不溶解，可以逐滴加入0.01M的氫氧化鈉(NaOH)助溶，直至完全溶解。待冷卻后，分別加入皂角苷和NaN3，用0.01MPBS補(bǔ)足體積(總體積為l);調(diào)整pH7.0-7.4(25°C);最后用G5漏斗除菌、過(guò)濾。制得破膜劑，為方便敘述，將此破膜劑簡(jiǎn)稱A液。4本發(fā)明釆用的皂角苦是從植物中提取，由皂角苷元和糖、糖醛酸或其他有機(jī)酸組成的。有刺激性氣味，能溶于水；本發(fā)明釆用的多聚甲醛是低分子量多聚甲醛((CH20)n),為白色結(jié)晶粉末，不溶于乙醇,微溶于冷水，溶于稀酸、稀堿。此破膜劑A液可直接用于流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞內(nèi)免疫指標(biāo)。另外，本發(fā)明涉及的破膜劑A液可稀釋后用作溶血?jiǎng)娪锰囟舛确秶腘aN3、多聚甲醛的0.01M磷酸鹽緩沖液溶液，將破膜劑中的皂角苷稀釋為皂角苷含量為0.05%,制得溶血?jiǎng)?。特別的，可釆用與溶血?jiǎng)┲蠳aN3、多聚甲醛的濃度相同的NaN3、多聚甲醛(其范圍分別為0.05-0.5%和1-4%)的0.01M磷酸鹽緩沖液溶液，將破膜劑中的皂角苷稀釋為皂角苷含量為0.05%，制得溶血?jiǎng)?。也就是說(shuō)，稀釋可釆用以下成分和配比的稀釋劑進(jìn)行NaN30.05-0.5%多聚甲醛1-4%0.01M磷酸鹽緩沖液余量；稀釋劑中各成分的濃度與權(quán)利要求1所述的破膜劑中相同成分的濃度相同。制得的溶血?jiǎng)┑某煞趾团浔葹樵斫擒?.05%NaN30,05-0.5%多聚甲醛1-4%0.01M磷酸鹽緩沖液余量。稀釋可釆用相應(yīng)體積的與A液中NaN3、多聚甲醛的濃度一致NaN3和多聚甲醛的0.01M磷酸鹽緩沖液溶液分別稀釋；也可以加入相應(yīng)重量份的NaN3、多聚甲醛和磷酸鹽后，加入蒸餾水稀釋；還可以將NaN3和多聚甲醛與磷酸緩沖液配置成稀釋劑稀釋。優(yōu)選的稀釋方法為將NaN3、多聚甲醛與磷酸緩沖液配置成可穩(wěn)定保存的濃溶液，使用前用蒸餾水稀釋用作稀釋劑。優(yōu)選稀釋方法詳述如下1)配置下列成分和組成的溶液，為便于敘述，將此稀釋劑濃溶液稱為B溶液疊氮化鈉(NaN3)0.5-5%多聚甲醛(paraformaldehyde)10-40%0.1M轔酸鹽緩沖液余量為方便保存和稀釋，一般可將B溶液的各組分的具體濃度配置為相應(yīng)A液中同樣組分濃度的10倍；2)使用前用蒸餾水稀釋為稀釋劑，稀釋劑中疊氮化鈉、多聚甲醛的濃度與相應(yīng)破膜劑中疊氮化鈉、多聚甲醛的濃度相同；3)將適量稀釋劑與破膜劑A液混合，使溶液中的皂角苷含量為0.05%，制得用于溶血的溶血?jiǎng)?。?yōu)選稀釋方法中所用的B溶液在常溫下可穩(wěn)定保存，實(shí)驗(yàn)證明本發(fā)明的B溶液可以保存6個(gè)月以上，使用前用蒸餾水稀釋即可用作稀釋劑。釆用此稀釋方法，既便于保存稀釋劑，又使稀釋步驟簡(jiǎn)單易行。本發(fā)明的溶血?jiǎng)┦窃斫擒蘸繛?.05%，稀釋劑與破膜劑A液的的混合液，可用于流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表型免疫指標(biāo)。本發(fā)明涉及的可用作溶血?jiǎng)┑钠颇┑氖褂梅椒?)用作破膜劑可直接作為破膜劑應(yīng)用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)多項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)；2)用作溶血?jiǎng)⑵颇┲械脑斫擒障♂屩?.05%，可用作檢測(cè)臨床血標(biāo)本免疫表型的溶血?jiǎng)＞唧w地說(shuō)，本發(fā)明涉及的可用作溶血?jiǎng)┑钠颇┑氖褂梅椒?、作為溶血?jiǎng)?yīng)用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)臨床血標(biāo)本的免疫表型分析取適量抗凝血(室溫存放，在24小時(shí)內(nèi)使用EDTA,肝素或檸檬酸鈉抗凝的全血樣本)，加入檢測(cè)細(xì)胞表面分子用的熒光素標(biāo)記抗體，混和均勻，避光孵育；加入溶血?jiǎng)┢颇┑南♂屢?皂角苷含量為0.05%,稀釋劑與破膜劑A液的的混合液)，振蕩均勻；離心去除上清液；加入固定劑。于48小時(shí)內(nèi)上機(jī)分析。2、作為破膜劑應(yīng)用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)臨床血標(biāo)本細(xì)胞內(nèi)多項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)取適量抗凝血(室溫存放，在24小時(shí)內(nèi)使用的EDTA，肝素或檸檬酸鈉抗凝的全血樣本)，加入檢測(cè)細(xì)胞表面分子用的熒光標(biāo)記抗體，混和均勻，避光孵育；加入溶血?jiǎng)┢颇┑南♂屢?皂角苷含量為0.05%,稀釋劑與破膜劑A液的的混合液)，振蕩均勻，離心去除上清液；重懸；離心去除上清液；加入破膜劑A液，振蕩均勻；離心去除上清液；加入胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)用熒光素標(biāo)記抗體，混和均勻，避光孵育；重懸洗滌細(xì)胞，離心去除上清液；加入固定劑。于48小時(shí)內(nèi)上機(jī)分析。3、作為破膜劑應(yīng)用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血PBMC(外周血單個(gè)核細(xì)胞)的細(xì)胞內(nèi)多項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)取新鮮的PBMC，加入檢測(cè)細(xì)胞表面分子用的熒光素標(biāo)記抗體，混和均勻，避光孵育；加入破膜劑A液，振蕩均勻；離心去除上清液；加入檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子用的熒光素標(biāo)記抗體，混和均勻，避光孵育；重懸洗滌細(xì)胞，離心(300g，5分鐘)去除上清液；加入固定劑。于48小時(shí)內(nèi)上機(jī)分析。與現(xiàn)有溶血?jiǎng)┖推颇┫啾龋景l(fā)明涉及的破膜劑既可以直接用作破膜劑又可以稀釋后用作溶血?jiǎng)?，具有雙重用途。溶血作用好，既能保證白細(xì)胞不被破壞，保留原有的生物活性，又能完全裂解紅細(xì)胞，產(chǎn)生的細(xì)胞碎片少，降低染色背景，減少非特異染色，一般可以獲得富集血液樣本中90%以上的白細(xì)胞。而且，本發(fā)明涉及的溶血?jiǎng)┖推颇┑臋z測(cè)特異性和敏感性等方面明顯優(yōu)于進(jìn)口試劑，可以用于諸如白血病、紅細(xì)胞增多癥、重型肝病病人的全血標(biāo)本的溶血和破膜，解決由于其外周血中含有較多有核紅細(xì)胞，現(xiàn)有溶血?jiǎng)┖推颇┝呀饧t細(xì)胞不完全或者損傷白細(xì)胞產(chǎn)生大量的碎片的問(wèn)題；也可以處理紅細(xì)胞含量較多或者脂肪細(xì)胞較多的組織樣本；還可以用于Thl/Th2細(xì)胞內(nèi)因子檢測(cè)，白血病免疫分型和細(xì)胞內(nèi)相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)，處理效果良好。本發(fā)明涉及的破膜劑，其稀釋劑濃溶液B溶液以及溶血?jiǎng)┑姆€(wěn)定性好，實(shí)驗(yàn)證明可以保存6個(gè)月以上。配置方法簡(jiǎn)單易行，原料成本低廉，制備簡(jiǎn)單，應(yīng)用方便，使用者可根據(jù)需要自行選擇，適用于科研和臨床流式檢測(cè)。圖1為市售溶血?jiǎng)┖捅景l(fā)明溶血?jiǎng)┑牧魇紽SC/SSC點(diǎn)圖結(jié)果比較，A，B，C分別為應(yīng)用巿售溶血?jiǎng)〣D,JM和本發(fā)明的溶血?jiǎng)┤苎髽悠返牧魇紽SC/SSC點(diǎn)圖，其中R1，R2,R3,R4分別為淋巴細(xì)胞群，單核細(xì)胞群，粒細(xì)胞群和碎片。圖2為巿售溶血?jiǎng)┖捅景l(fā)明溶血?jiǎng)┰谘獦?biāo)本細(xì)胞免疫表型檢測(cè)中的比較，A，B分別為應(yīng)用巿售溶血?jiǎng)〣D和本發(fā)明的溶血?jiǎng)┨幚硌獦?biāo)本的細(xì)胞免疫表型檢測(cè)結(jié)果。圖3為巿售破膜劑與本發(fā)明破膜劑在細(xì)胞內(nèi)顆粒酶檢測(cè)應(yīng)用中的比較，A，B分別為應(yīng)用巿售破膜劑BD和本發(fā)明的破膜劑處理全血標(biāo)本的細(xì)胞內(nèi)顆粒酶檢測(cè)結(jié)果。圖4為巿售破膜劑與本發(fā)明破膜劑在細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)中的比較，A，B分別為應(yīng)用巿售破膜劑BD和本發(fā)明的破膜劑處理全血標(biāo)本的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果。圖5為溶血?jiǎng)┑募铀俜€(wěn)定性試驗(yàn)。A，B分別為4。C保存與37t:保存6天的溶血?jiǎng)┨幚硌獦悠泛蟮腇SC/SSC點(diǎn)圖。其中R1，R2分別為淋巴細(xì)胞群，單核細(xì)胞群。圖6為破膜劑的加速穩(wěn)定性試驗(yàn)。A，B分別為4。C保存與37t:保存6天的破膜劑處理血樣品后的檢測(cè)結(jié)果。具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例l釆用分析級(jí)純度的試劑配置破膜劑和稀釋劑濃溶液，首先準(zhǔn)確稱取多聚甲醛1g,置于一定量的0.01M磷酸鹽緩沖液(Phosphatebufferedsaline,簡(jiǎn)稱PBS)中，在37。C水洛箱中水洛l小時(shí)，逐滴加入0.01M的氫氧化鈉(NaOH)助溶不溶解的多聚甲醛，直至完全溶解，冷卻至室溫。加入準(zhǔn)確稱取的皂角苷0.5g，疊氮化鈉0.05g，直至完全溶解，用0.01M的PBS補(bǔ)足體積，使重量為100g;用1N的鹽酸(HC1)調(diào)整pH至7.2(25。C);最后用G5漏斗除菌、過(guò)濾，得到破膜劑A液。準(zhǔn)確稱取多聚甲醛10g,置于一定量的0.1M磷酸鹽緩沖液(Phosphatebufferedsaline,簡(jiǎn)稱PBS)中，在37。C水浴箱中水洛2小時(shí)。逐滴加入0.01M的氫氧化鈉(NaOH)助溶不溶解的多聚甲醛，直至完全溶解，冷卻至室溫。加入準(zhǔn)確稱量的疊氮化鈉0.5g,溶解完全后，用0.1M的PBS補(bǔ)足體積至重量為100g;然后用G5漏斗除菌過(guò)濾，得到稀釋劑濃溶液B液，室溫保存。配置本發(fā)明的溶血?jiǎng)葘液用蒸餾水稀釋10倍成稀釋劑，以9:1的比例混合該稀釋劑和破膜劑A液，得到皂角苷含量為0.05%的溶血?jiǎng)?。?shí)施例2作為溶血?jiǎng)?yīng)用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)臨床血標(biāo)本的免疫表型分析的使用方法采用室溫存放，在24小時(shí)內(nèi)使用的EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝的全血樣本，應(yīng)用本發(fā)明溶血?jiǎng)?、取抗凝血50(il放入流式管中。2、加入適量熒光標(biāo)記抗體(鼠抗人CD123-PE)，混和均勻，室溫避光孵育20分鐘。3、加入lml本發(fā)明的溶血?jiǎng)?皂角苷含量為0.05%,破膜劑A液與稀釋劑的混合稀釋液)，振蕩均勻，室溫放置5分鐘，離心(300g，5分鐘)去除上清液。4、用30(HilP/。多聚甲醛固定，4"C避光保存。48小時(shí)內(nèi)釆用流式細(xì)胞儀檢測(cè)分析。免疫學(xué)指標(biāo)的使用方法、、、7釆用室溫存放，使用在24小時(shí)內(nèi)EDTA、肝素或梓檬酸鈉抗凝的全血樣本，應(yīng)用本發(fā)明涉及的破膜劑和溶血?jiǎng)?。釆用下列步驟進(jìn)行1、取抗凝血50pl放入流式管中。2、加入檢測(cè)細(xì)胞表面分子用的熒光標(biāo)記抗體(鼠抗人CD3-PerCP)20^1,混和均勻，室溫避光孵育20分鐘。3、加入lml本發(fā)明溶血?jiǎng)?皂角苷含量為0.05%，破膜劑A液與稀釋劑的混合稀釋液)，振蕩均勾，室溫放置5分鐘，離心(300g,5分鐘)，去除上清液。4、用lmlO.OIM的PBS重懸洗滌細(xì)胞，離心(300g,5分鐘)去除上清液。5、加入lml本發(fā)明破膜劑A液，振蕩均勻，室溫放置20分鐘。離心(300g，5分鐘)，去除上清液。6、加入細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)用熒光標(biāo)記抗體(鼠抗人Granzymes-FITC)20^1，混和均勻，室溫避光孵育20分鐘。7、用lmlPBS重懸洗滌細(xì)胞，離心(300g，5分鐘)去除上清液。8、加入300^il的l。/。多聚甲醛固定，4"C避光保存，48小時(shí)內(nèi)采用流式細(xì)胞儀分析。多項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)的使用方法、釆用下列步驟進(jìn)行1、使用Lympholyte-H人淋巴細(xì)胞分離液(比重1.0770±0.001)10分離外周血樣本，獲得新鮮PBMC(外周血單個(gè)核細(xì)胞)后，取lx106的細(xì)胞放入流式管中。2、加入檢測(cè)細(xì)胞表面分子用的熒光素標(biāo)記抗體(鼠抗人CD8-APC)20(xl，混和均勻，室溫避光孵育20分鐘。3、加入lm破膜劑A液，振蕩均勻，室溫放置20分鐘。離心(300g，5分鐘)去除上清液。4、加入檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子用的熒光素標(biāo)記抗體(鼠抗人IFN-r-FITC和鼠抗人Il-7-PE)20nl，混和均勻，室溫避光孵育20分鐘。5、用lmlPBS重懸洗滌細(xì)胞，離心(300g，5分鐘)去除上清液。6、加入300W1%多聚甲醛固定，4"C避光保存，48小時(shí)內(nèi)采用流式細(xì)胞儀分析。實(shí)施例5將室溫存放，在24小時(shí)內(nèi)使用的EDTA、肝素或梓檬酸鈉抗凝的正常人全血樣本分成三份，分別應(yīng)用巿售BD紅細(xì)胞裂解液(FACSlysingsolution,美國(guó)BDPharMingen公司)和JM紅細(xì)胞裂解液(晶美生物工程有限公司)，以及實(shí)施例1配置的溶血?jiǎng)?皂角苷含量為0.05%;NaN3含量為0.05%;多聚甲醛含量為1%的0.01M的PBS溶液)，考察其溶血效果。圖1的A，B,C分別為應(yīng)用市售溶血?jiǎng)〣D，JM和本發(fā)明的溶血?jiǎng)┨幚硌獦悠返牧魇紽SC/SSC點(diǎn)圖。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用本發(fā)明溶血?jiǎng)┨幚硌獦颖荆t細(xì)胞裂解完全，產(chǎn)生的細(xì)胞碎片少，背景清晰，白細(xì)胞分群明顯，特別是單個(gè)核細(xì)胞丟失很少。圖l的具體分析結(jié)果見(jiàn)表l:表i巿售溶血?jiǎng)┖捅景l(fā)明溶血?jiǎng)┤苎潭缺容^(％)名稱背景(FSC/SSC)淋巴細(xì)胞(R1)單核細(xì)胞(R2)粒細(xì)胞(R3)碎片(R4)ABD清晰15.8410.5162.357.18BJM清晰15.1611.5154.2415.01C溶血?jiǎng)┣逦?0.3414.7352.116.79說(shuō)明本發(fā)明涉及的溶血?jiǎng)?，其溶血效果好于巿售常用溶血?jiǎng)〣D和JM。實(shí)施例6釆用實(shí)施例2的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。釆用室溫存放，在24小時(shí)內(nèi)使用的EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝的重型肝炎患者的全血標(biāo)本，將此全血樣本分成兩份，分別應(yīng)用巿售溶血?jiǎng)〣D和本發(fā)明涉及的溶血?jiǎng)?皂角苷含量為0.05%;NaN3含量為0.25%;多聚甲醛含量為2。/。的0.01M的PBS溶液)，考察此溶血?jiǎng)z測(cè)臨床血標(biāo)本的免疫表型分析效果。圖2的A，B分別為應(yīng)用巿售溶血?jiǎng)〣D和本發(fā)明的溶血?jiǎng)?皂角苷含量為0.05%,破膜劑A液與稀釋劑的混合稀釋液)處理血標(biāo)本的細(xì)胞免疫表型檢測(cè)結(jié)果。應(yīng)用FACSCalibia上的CELLQUEST分析軟件分析獲取的數(shù)據(jù)。設(shè)定單個(gè)核細(xì)胞群(淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞)區(qū)域?yàn)镽l,以Rl為門(mén)建立LinlFITC/HLA-DRPerCP雙參數(shù)點(diǎn)圖；設(shè)定Linl陰性細(xì)胞區(qū)域?yàn)镽2，以R2為門(mén)建立CD123PE/HLA-DRPerCP雙參數(shù)點(diǎn)圖，設(shè)定111^-011+/^0123+雙陽(yáng)性細(xì)胞區(qū)域?yàn)?0。統(tǒng)計(jì)LIN1陰性和HLA-DR十/CD123+雙陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量占單個(gè)核細(xì)胞總數(shù)的百分比?？梢?jiàn)對(duì)于重型肝炎患者的全血標(biāo)本，本發(fā)明的溶血?jiǎng)┍仁惺廴苎獎(jiǎng)〣D溶血效果好，背景清晰，目的細(xì)胞檢出率高。圖2的具體分析結(jié)果見(jiàn)表2:表2巿售破膜劑和本發(fā)明的溶血?jiǎng)┨幚硌獦?biāo)本后細(xì)胞免疫表型檢測(cè)比較(％)名稱背景(FSC/SSC)LIN1-(R2)HLA-DR+/CD123+(R3)ABD分群不清晰碎片多30.540.13B溶血?jiǎng)┣逦槠?.660.29注以重型肝炎患者全血標(biāo)本為檢測(cè)樣品說(shuō)明本發(fā)明涉及的溶血?jiǎng)?，可用于重型肝炎患者的免疫表型分析，效果良好，明顯好于巿售常用溶血?jiǎng)〣D。實(shí)施例7釆用實(shí)施例3的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。將室溫存放，在24小時(shí)內(nèi)使用EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝的全血樣本分成兩份，分別應(yīng)用本發(fā)明實(shí)施例l配置的破膜劑和巿售破膜劑，考察破膜劑檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)顆粒酶的結(jié)果，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中使用的溶血?jiǎng)樵斫擒蘸繛?.05%;NaN3含量為0.45%;多聚甲醛含量為4%的O.OIM的PBS溶液。圖3中的A，B分別為應(yīng)用巿售破膜劑BD和破膜劑處理全血標(biāo)本的細(xì)胞內(nèi)顆粒酶檢測(cè)結(jié)果。應(yīng)用FACSCalibia上的CELLQUEST分析軟件分析獲取的數(shù)據(jù)。設(shè)定淋巴細(xì)胞群區(qū)域?yàn)镽1，以R1為門(mén)建立Gra(Granzymes，簡(jiǎn)稱Gra)-FITC/CD3-PerCP雙參數(shù)點(diǎn)圖。設(shè)定四個(gè)象限Gra十/CD3-為左上象限(UL),Gra十/CD3+為右上象限(UR)，GraVCD3-為左下象限(LL)，GmVCD3+為右下象限(LR)。分別統(tǒng)計(jì)四個(gè)象限內(nèi)的細(xì)胞數(shù)量占淋巴細(xì)胞總數(shù)的百分比?？梢?jiàn)本發(fā)明的破膜劑與巿售破膜劑BD的檢測(cè)結(jié)果相近。圖3的具體分析結(jié)果見(jiàn)表3:表3巿售破膜劑和本發(fā)明破膜劑處理血標(biāo)本后細(xì)胞內(nèi)顆粒酶檢測(cè)比較(％)名稱GA+/CD3-饑)GA+/CD3+0JR)GA-/CD3-(LL)GA-細(xì)+(LR)ABD13.4316.4220.1749.97B破膜劑15.0516.9621.0847.31實(shí)施例8巿售釆用實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行此實(shí)驗(yàn)。將室溫存放，在24小時(shí)內(nèi)使用EDTA、肝素或檸檬酸鈉抗凝的正常人全血樣本分成兩份，分別應(yīng)用本發(fā)明涉及的破膜劑(皂角苷含量為0.15%;NaN3含量為0.4%;多聚甲醛含量為3%的0.01M的PBS溶液)和巿售破膜劑，考察此破膜劑在細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)方面的應(yīng)用。圖4的A，B分別為應(yīng)用巿售溶血?jiǎng)〣D和本發(fā)明的破膜劑處理全血標(biāo)本的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果。應(yīng)用FACSCalibia上的CELLQUEST分析軟件分析獲取的數(shù)據(jù)。設(shè)定淋巴細(xì)胞群區(qū)域?yàn)镽1，以R1為門(mén)建立IFN-r-FITC/CD8-APC和Il-7-PE/CD8-APC雙參數(shù)點(diǎn)圖。設(shè)定四個(gè)象限(UL、UR、LL、LR)，統(tǒng)計(jì)正]^-汁/008+、IFN-r-/CD8+和IL-17-/CD8+、IL-17+/CD8+四群細(xì)胞數(shù)量占淋巴細(xì)胞總數(shù)的百分比?？梢?jiàn)本發(fā)明的破膜劑的檢測(cè)結(jié)果與巿售破膜劑BD結(jié)果基本符合。圖4的具體分析結(jié)果見(jiàn)表4:表4應(yīng)用市售破膜劑和本發(fā)明破膜劑在細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)中的比較(％)名稱IFN-r+飾-IFN-r+/CD8+IL-17+/CD8-IL-17+/CD8+ABD21.4121.693.610.48B破膜劑23.2124.374.480.53實(shí)施例9穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)按照實(shí)施例1所述的方法新鮮配制破膜劑A液和稀釋劑濃溶液B液，分別放置37"C孵箱和4"C保存6天，進(jìn)行加速穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)37'C和4'C保存6天的A液和B液的外觀都清亮透明，無(wú)混濁和沉淀；比較37。C和4。C保存6天的A液，外觀未見(jiàn)差異；比較37。C和4。C保存6天的B液，外觀未見(jiàn)差異，說(shuō)明本發(fā)明的破膜劑和稀釋劑濃溶液具有良好的穩(wěn)定性。分別將4。C保存6天、37。C保存6天的破膜劑A液和稀釋劑濃溶液B液按照實(shí)施例l所述的方法配置成溶血?jiǎng)?，以?shí)施例2的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。圖5的A，B分別是4r與37。C保存6天后配置的溶血?jiǎng)┨幚硌獦悠泛蟮腇SC/SSC點(diǎn)圖。FSC/SSC點(diǎn)圖顯示4'C存放與37。C保存6天后配置的溶血?jiǎng)┤苎Y(jié)果相近。紅細(xì)胞裂解完全，產(chǎn)生的細(xì)胞碎片少，背景清晰，白細(xì)胞分群明顯。圖5的具體分析結(jié)果見(jiàn)表5:表5溶血?jiǎng)?'C和37'C6天穩(wěn)定性試驗(yàn)比較(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>按照實(shí)施例l所述的方法新鮮配制破膜劑和溶血?jiǎng)謩e放置37'C孵箱和4t:保存6天，進(jìn)行加速穩(wěn)定性試驗(yàn)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)37"C和4'C保存6天的破膜劑和溶血?jiǎng)┑耐庥^都清亮透明，無(wú)混濁和沉淀；比較37。C和4。C保存6天的破膜劑，外觀未見(jiàn)差異；比較37。C和4。C保存6天的溶血?jiǎng)?，外觀也未見(jiàn)差異，說(shuō)明本發(fā)明的破膜劑和溶血?jiǎng)┚哂辛己玫姆€(wěn)定性。按照實(shí)施例4的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行進(jìn)行溶血和破膜對(duì)照試驗(yàn)，對(duì)照分析全血標(biāo)本的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子結(jié)果。圖6的A,B分別是4。C存放與37。C保存6天的溶血?jiǎng)┖推颇┨幚硌獦悠泛蟮碾p參數(shù)點(diǎn)圖。應(yīng)用FACSCalibia上的CELLQUEST分析軟件分析獲取的數(shù)據(jù)。設(shè)定CD3T淋巴細(xì)胞群區(qū)域?yàn)镽l,以Rl為門(mén)建立IFN-r-FITC/CD8-PerCP和11-7-PE/CD8-PerCP雙參數(shù)點(diǎn)圖。設(shè)定四個(gè)象限(UL、UR、LL、LR)，統(tǒng)計(jì)CD3+、CD8+、IFN-r+/CD8-、正^『+/。08+和1-17+/€08-、正-17+/。08+四群細(xì)胞數(shù)量占0031淋巴細(xì)胞總數(shù)的百分比。圖6的具體分析結(jié)果見(jiàn)表6:表6破膜劑4'C和37'C保存6天的穩(wěn)定性比較(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>權(quán)利要求1、一種破膜劑，其成分和配比為皂角苷0.1-0.5％NaN30.05-0.5％多聚甲醛1-4％；0.01M磷酸鹽緩沖液余量。2、如權(quán)利要求l所述的破膜劑，其特征在于其pH值為7.0-7.4。3、一種溶血?jiǎng)?，其特征在于，是稀釋?quán)利要求l所述的破膜劑，使皂角苷含量為0.05%得到的。4、如權(quán)利要求3所述的溶血?jiǎng)♂屷娪靡韵鲁煞趾团浔鹊南♂寗┻M(jìn)行NaN30.05-0.5%多聚甲醛1-4%0.01M磷酸鹽緩沖液余量；稀釋劑中各成分的濃度與權(quán)利要求1所述的破膜劑中相同成分的濃度相同。5、如權(quán)利要求4所述的溶血?jiǎng)?，所述稀釋劑是由以下溶液NaN30.5-5%多聚甲醛10-40%O.IM磷酸鹽緩沖液余量；用蒸餾水稀釋后得到的。6、權(quán)利要求3-5任一所述的溶血?jiǎng)?，其成分和配比為皂角?.05%NaN30.05-0.5%多聚甲醛1-4%0.01M磷酸鹽緩沖液余量。7、權(quán)利要求l-2任一所述的破膜劑在流式細(xì)胞分析中的應(yīng)用。8、權(quán)利要求3-6任一所述的溶血?jiǎng)┰诹魇郊?xì)胞分析中的應(yīng)用。9、一種處理用于流式細(xì)胞分析的血標(biāo)本的方法，包括適量樣品中加入檢測(cè)細(xì)胞表面分子用的熒光標(biāo)記抗體，混和均勻，避光孵育；加入權(quán)利要求3-6任一所述的溶血?jiǎng)?，振蕩均勻，離心去除上清液；重懸；加入權(quán)利要求l-2任一所述的破膜劑，振蕩均勻；離心去除上清液；加入胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)用熒光素標(biāo)記抗體，混和均勻，避光孵育；重懸洗滌細(xì)胞，離心去除上清液；加入固定劑，于48小時(shí)內(nèi)上機(jī)分析。10、一種處理用于流式細(xì)胞分析的血標(biāo)本的方法，包括取適量抗凝血，加入檢測(cè)細(xì)胞表面分子用的熒光標(biāo)記抗體，混和均勻，避光孵育；加入權(quán)利要求3-6任一所述的溶血?jiǎng)袷幘鶆?；離心去除上清液；重懸；于48小時(shí)內(nèi)上機(jī)分析。全文摘要本發(fā)明涉及一種可用作溶血?jiǎng)┑钠颇?。其主要成分為皂角苷，疊氮鈉和多聚甲醛，將適量上述組分混合，溶解在磷酸鹽緩沖液中，可制得本發(fā)明的破膜劑，將其稀釋后可用作溶血?jiǎng)?。與現(xiàn)有溶血?jiǎng)┖推颇┫啾?，本發(fā)明涉及的破膜劑既可以直接用作破膜劑又可以稀釋后用作溶血?jiǎng)哂须p重用途。本發(fā)明涉及的溶血?jiǎng)┖推颇┛蓱?yīng)用于流式細(xì)胞儀檢測(cè)人體血液中各項(xiàng)免疫學(xué)指標(biāo)，其檢測(cè)特異性和敏感性等方面明顯優(yōu)于進(jìn)口試劑，特別是在白血病、紅細(xì)胞增多癥、重型肝病病人全血標(biāo)本溶血和破膜等預(yù)處理過(guò)程中更加具有優(yōu)勢(shì)。文檔編號(hào)G01N33/48GK101620220SQ20081011593公開(kāi)日2010年1月6日申請(qǐng)日期2008年6月30日優(yōu)先權(quán)日2008年6月30日發(fā)明者暉張,王福生申請(qǐng)人:暉張