專利名稱：：胱抑素c測定試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)免疫體外診斷領(lǐng)域，涉及一種免疫比濁檢測試劑，進一步地，本發(fā)明涉及一種膠乳顆粒增強型胱抑素c檢測試劑盒。
背景技術(shù)：
：胱抑素C(CystatinC)是一種低分子量蛋白質(zhì)，可由機體所有有核細胞產(chǎn)生，產(chǎn)生率恒定。循環(huán)中的胱抑素C僅經(jīng)腎小球濾過而被清除，是一種反映腎小球濾過率變化的理想的內(nèi)源性標(biāo)志物，而腎小球的濾過率(glomerularfiltrationrate,GFR)是監(jiān)測腎功能的一個重要指標(biāo)，尤其對于腎移植的病人，快速準(zhǔn)確的掌握腎小球濾過率的變化是十分重要的。此外由于胱抑素C分子量大于肌酐，且?guī)д姾桑运菀追从衬I小球濾過膜通透性的早期變化，可以在腎小球濾過率輕微降低時升高，較肌酐更敏感，作為腎功能試驗優(yōu)于血清肌酐，具有重要的臨床應(yīng)用價值。胱抑素C，是一種由120個氨基酸殘基組成的分子量僅13KDa的低分子量分泌性蛋白質(zhì)，是半胱氨酸蛋白酶抑制物超家族的成員之。胱抑素C基因5'側(cè)翼序列與"看家基因"的啟動子區(qū)具有相同的特性，也屬于"看家基因"即此基因在所有組織恒定持續(xù)地轉(zhuǎn)錄及表達，無組織學(xué)特異性，廣泛地存在于各種體液中，如腦脊液、血液、唾液、精漿等，機體胱抑素C產(chǎn)生率相當(dāng)恒定。而胱抑素C是一種低分子量蛋白質(zhì)，可經(jīng)腎小球自由濾過，腎臟是清除循環(huán)中胱抑素C的唯一器官，所以血清胱抑素C濃度主要由GFR決定，由此可見胱抑素C是一種理想的反映GFR變化的內(nèi)源性標(biāo)志物。臨床研究低分子量蛋白質(zhì)((32-微球蛋白、視黃醇結(jié)合蛋白、胱抑素C)濃度與GFR(51Cr-EDTA清除率或其金標(biāo)準(zhǔn)99mTc-DTPA清除率)的相關(guān)性，血清胱抑素C、肌酐濃度診斷異常GFR的敏感性分別為78.1%及57.1%，各自濃度倒數(shù)與GFR("Cr-EDTA清除率)的相關(guān)系數(shù)分別為0.81、0.50。表明胱抑素C是低分子量蛋白質(zhì)中與GFR最相關(guān)的內(nèi)源性標(biāo)志物，甚至優(yōu)于血清肌酐。血清(32-微球蛋白濃度由于在炎癥、腫瘤及免疫疾病時也可升高，故不是理想的GFR內(nèi)源性標(biāo)志物。而胱抑素C即使在炎癥狀態(tài)下，其產(chǎn)生率也不會改變，血清濃度受年齡、性別、疾病的病情變化的影響較小。說明胱抑素C的診斷準(zhǔn)確性明顯優(yōu)于血清肌酐。免疫濁度測定的基本原理是抗原抗體在特殊緩沖液中快速形成抗原抗體復(fù)合物，使反應(yīng)液出現(xiàn)濁度。當(dāng)反應(yīng)液中保持抗體過量時，形成的復(fù)合物隨抗原量增加而增加，反應(yīng)液的濁度亦隨之增加，與一系列的標(biāo)準(zhǔn)品對照，即可計算出待檢測物的含量。但含量低的分子量小的抗原抗體復(fù)合物極難形成濁度，除非放置較長時間；如形成較大的復(fù)合物，則抗原和抗體用量也較大，顯然不符合微量化的要求。于是發(fā)展了免疫膠乳濁度測定法，是在膠乳凝集定性試驗基礎(chǔ)上發(fā)展建立的-種非放射性均相免疫濁度測定法，其基本原理是將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時，則使膠乳顆粒發(fā)生凝集。單個膠乳顆粒在入射光波之內(nèi)不阻礙光線透過，兩個或兩個以上膠乳顆粒凝聚時則使透過光減少，這種減少的程度與膠乳顆粒凝聚的程度呈正比，當(dāng)然也與待測抗原量呈正比，由此可測出標(biāo)本中待測物的含量。由于血清中胱抑素c濃度較低，故其測定方法需較高的分析靈敏度及特異性。最早采用單向免疫擴散法(RID)及酶免疫測定法(EIA)對胱抑素C含量進行測定，而這兩種方法不僅費時，檢測限也較差。較簡單且更靈敏的放射、熒光及各種酶免疫測定(RIA、FIA及EIA)的方法能改善胱抑素C測定的可靠性，但測定時間仍較長，無法常規(guī)應(yīng)用，更無法用于急診測定。以上各種測定方法均屬非均相測定方法，很難自動化，因此限制了胱抑素C的廣泛臨床應(yīng)用。采用上述的膠乳免疫均相測定方法，即在膠乳顆粒上包被抗體，與抗原結(jié)合時顆粒發(fā)生凝集，此方法很容易自動化。Kabanda等于1994年報道的測定胱抑素C的膠乳顆粒凝集法是一種顆粒計數(shù)免疫測定法。Kyhseandersen等于同年報道了一種顆粒增強透射免疫比濁法(particle-enhancedturbidimetricimmunoassay,PETIA)，使胱抑素C測定的時間縮短至5min左右，且可在自動生化分析儀上進行，使胱抑素C測定的常規(guī)應(yīng)用成為可能。單純就檢測靈敏度而言，RID法最差，而EIA、RIA及FIA法均優(yōu)于PETIA及PENIA法。由于RIA法存在放射性污染，F(xiàn)IA法需昂貴的儀器，以及RIA、FIA、EIA法測定時間長，且不能全自動化，無法用于臨床大批量標(biāo)本的測定。PETIA及PENIA法雖然檢測靈敏度差些，但仍可達150嗎/L左右，遠遠低于健康人血清胱抑素C濃度的下限值，可滿足臨床需要；這兩種測定方法基本上不受血紅蛋白、膽紅素、類風(fēng)濕因子、甘油三酯的影響，回收率可達95%109%，批內(nèi)及批間變異系數(shù)均較小(<4.5%);加上這兩種方法可全自動化，故在血清胱抑素C測定的常規(guī)臨床應(yīng)用中可首選PETIA或PENIA法。本發(fā)明采用膠乳顆粒增強透射免疫比濁法即PETIA檢測血清或血漿中胱抑素C含量。采用膠乳包被的抗胱抑素C的抗體，與待測標(biāo)本中的胱抑素C發(fā)生凝集反應(yīng)，用光透射強度檢測這種變化，以胱抑素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣本中目標(biāo)檢測物胱抑素C的濃度。使用本發(fā)明的方法靈敏度較高保證能夠檢測極低水平(0.lmg/L)的胱抑素C，具有很高的臨床應(yīng)用價值。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種特異的高靈敏度的能夠測定0.lmg-8mg的胱抑素C的含量的膠乳顆粒增強型胱抑素C測定試劑盒，所述的試劑盒包含試劑Rl，試劑R2，所述的試劑R1為含有多聚物的緩沖液；所述的試劑R2為結(jié)合抗人胱抑素C抗體的聚苯乙烯膠乳溶液，膠乳顆粒直徑為50-150nm，置于合適的緩沖液。進一步的，在本發(fā)明所述的膠乳顆粒增強型胱抑素C測定試劑盒試劑R1中，所述的多聚物包括TritonX，Tween，E70C或聚氧乙烯類多聚物等；在試劑R2中，結(jié)合有抗人胱抑素C抗體的聚苯乙烯膠乳溶液的含量為0.2-2.0mg/mL。更進一歩的，在本發(fā)明所述的膠乳顆粒增強型胱抑素C測定試劑盒，試劑Rl中，所述的多聚物包括TritonX,Tween，E70C或聚氧乙烯類多聚物等其含量為0.1-5.0%(重量體積比)。更進一步的，試劑2中膠乳與抗人胱抑素C抗體的包被實驗，可以采用物理吸附法或化學(xué)交聯(lián)法制備，物理吸附法更為優(yōu)化。在本發(fā)明所述的膠乳顆粒增強型胱抑素C測定試劑盒，其中還包括胱抑素C試劑的參考標(biāo)準(zhǔn)品。進一步的，所述的胱抑素C試劑的參考標(biāo)準(zhǔn)品，即胱抑素C含量為0.5，1.0，2.0，4.0，8.0mg/L的五個梯度標(biāo)準(zhǔn)品。進一步的，所述的胱抑素C試劑的參考標(biāo)準(zhǔn)品，為添加重組人胱抑素C純品的人血清或其它類似血清基質(zhì)的液體。進一步的，在本發(fā)明中，胱抑素C測定試劑盒中，試劑R1，R2的緩沖液包括但不限于TR工S緩沖液或甘氨酸緩沖液，以及其它具有相似性質(zhì)的緩沖液。緩沖液的pH值為6.5-8.5，進一步緩沖液pH值7.0-8.0更為優(yōu)化。本發(fā)明采用膠乳顆粒增強透射免疫比濁法即PETIA，是一種間接凝集試驗，其原理是包被了抗原或抗體的膠乳顆粒即免疫膠乳，與標(biāo)本中相應(yīng)的抗體或抗原發(fā)生免疫后，形成凝集顆粒，凝集物的形成使體系中產(chǎn)生一定的濁度，且與目的檢測物的濃度成正相關(guān)，測定特定波長下反應(yīng)體系得濁度，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線(該曲線為標(biāo)準(zhǔn)物濃度與濁度關(guān)系曲線)即可測出目的檢測物的濃度。該技術(shù)的關(guān)鍵在于兩個方面首先是選擇適用的膠乳，其大小(直徑)要稍小于波長,用500nm波長者，選擇100nm顆粒較適合；用585nm波長者，則選用100200nm顆粒為好；其次是采用合適的方法將聚苯乙烯膠乳包被目的抗體，常有的包被方法有物理吸附法和化學(xué)交聯(lián)法。本發(fā)明兩種方法均可采用，其中物理吸附法更為經(jīng)濟，簡便和穩(wěn)定，為更優(yōu)化推薦方法。本發(fā)明中，采用聚苯乙烯膠乳包被的抗胱抑素C的抗體，與待測標(biāo)本(血清或血槳)中的胱抑素C發(fā)生結(jié)合反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物，用光透射強度檢測這種變化，以胱抑素標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣本中目標(biāo)檢測物胱抑素C的濃度。使用本發(fā)明的方法靈敏度較高保證能夠檢測極低水平的胱抑素C，具有很高的臨床應(yīng)用價值。本試劑為液體雙試劑，具有特異性好，靈敏度高，準(zhǔn)確性好及抗干擾能力強等優(yōu)點，可用于檢測血清或血漿中胱抑素C的濃度，適用于臨床全自動生化分析儀。圖1是采用本發(fā)明膠乳增強型胱抑素C試劑盒測定目標(biāo)蛋白含量的方法示意圖。圖2顯示5種不同含量的胱抑素C參考標(biāo)準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個點代表不同含量的胱抑素c參考標(biāo)準(zhǔn)，其中x軸表示胱抑素c的含量，Y軸表示吸光度。圖3分別采用本發(fā)明試劑和A公司的胱抑素C膠乳增強型試劑，采用日立全自動生化分析儀對50份人血清(包含正常和異常標(biāo)本)按各自參數(shù)同時進行測定，對測定值進行相關(guān)分析。其中X軸表示的是本發(fā)明試劑測定的病人血清結(jié)果；Y軸表示的是某公司試劑測定的病人血清結(jié)果，相關(guān)系數(shù)R2=0.9919，回歸方程為y=1.1119x—0.2466。表l，2本發(fā)明試劑和A公司試劑靈敏度實驗結(jié)果，計算結(jié)果為我公司試劑檢測靈敏度可達O.lmg/L較A公司試劑更好(0.25mg/L)。表3本發(fā)明試劑抗干擾性實驗結(jié)果。結(jié)果顯示各項抗干擾指標(biāo)均優(yōu)于對比A公司試劑。具體實施例方式實施例1檢測試劑及標(biāo)準(zhǔn)制備及測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明檢測試劑盒及標(biāo)準(zhǔn)所需主要原料如下1兔抗人胱抑素C多克隆抗體，委托本公司按照常規(guī)方法自制，該抗體僅與人胱抑素C反應(yīng)，與其他抗原無免疫交叉反應(yīng)，效價能夠滿足本試劑要求。2聚苯乙烯膠乳，市場上有許多商品化的膠乳可供選擇，包括美國sigma公司，日本UNF公司；可選擇多種直徑的膠乳顆粒，本實施例僅僅示例性的采用了直徑為100-150腿的乳膠顆粒進行實驗，則相應(yīng)的試劑檢測主波長為570nm。3重組人胱抑素C純品(購自Dako公司)，用于制備本試劑所需標(biāo)準(zhǔn)品。主要試劑和參考標(biāo)準(zhǔn)品配制如下試劑Rl為0.1MTris-HCl緩沖液(pH7.2)，向該緩沖液中分別添加NaCl、Tritonx100、PEG6000和線，使各種成分的終濃度分別為0.9%(重量休積比)的NaCl，終濃度為0.5%(重量體積比)的Tritonx100，終濃度為5%(重量體積比)的PEG6000，終濃度為0.5%(重量體積比)NaN3。各種成分可以在室溫下依次添加，或者同時添加，或者分別單獨包裝并于檢測之前在即吋配制。試劑R2:用0.1M磷酸緩沖液(pH7.2)在室溫下稀釋兔抗人胱抑素C多克隆抗體和聚苯乙烯膠乳(抗體和膠乳的比例l:l左右)，將兩者混勻后室溫吸附1小時(即物理吸附法)，加入封閉液(含O.1%BSA磷酸緩沖液)封閉l小時，離心去上清，用0.1M磷酸緩沖液稀釋至合適濃度(0.1%-5%)并加入適當(dāng)?shù)谋绢I(lǐng)域技術(shù)人員已知的防腐劑。獲得試劑2，其為乳白色溶液。胱抑素C試劑參考標(biāo)準(zhǔn)品制備用重組人胱抑素C蛋白(購自Dako公司)溶于制備的類似人血清基質(zhì)的溶液(Nacl0.9%，BSA0.1%，NaN30.5%,Tris-HclpH8.0)，制備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品。以進口的胱抑素C標(biāo)準(zhǔn)品(購自Dako公司)為原始標(biāo)準(zhǔn)，采用膠乳凝集反應(yīng)法，分別對制備的標(biāo)準(zhǔn)品進行測定和調(diào)整，調(diào)整合適后分別檢測20次，求出均值達到標(biāo)準(zhǔn)品所要求的濃度，即O.5，1.0，2.0，4.0和8.0mg/L。胱抑素C試劑測定方法(如圖l所示)，分析方法兩點終點法，即試劑R1:試劑R2用量分別為300ul和100ul，樣本用量3ul;300ul試劑Rl加入3ul樣本，于37C5min后加入100ul試劑R2，即開始讀點，反應(yīng)5min后讀取另一點；檢測波長分別主波長570nm副波長800腿。采用本試劑及上述測定方法，采用自動奧林巴斯AU400生化分析儀測得的5種不同含量的胱抑素C標(biāo)準(zhǔn)品(自制)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(如圖2所示)，每個點代表一個含量的參考標(biāo)準(zhǔn)品。其中X軸表示胱抑素C的含量(mg/L);Y軸表示的是吸光度。這些自制的5種不同含量的胱抑素c標(biāo)準(zhǔn)品將用作下一步檢測的標(biāo)準(zhǔn)品。實施例2:檢測試劑的相關(guān)性試驗及靈敏度試驗1相關(guān)性試驗分別使用本發(fā)明試劑(具體配方同實施例1)和商售可獲得的A公司的胱抑素C膠乳增強型試劑，采用奧林巴斯AU400全自動生化分析儀對50份人血清(包含正常和異常標(biāo)本)按各自參數(shù)同時進行測定，我們試劑的主要參數(shù)同上即胱抑素C試劑測定方法，對測定值進行相關(guān)分析(結(jié)果見圖3，X，Y軸均為測定值(胱抑素C的含量mg/L)。兩種試的相關(guān)系數(shù)為R2:0.9919，回歸方程為y二1.1119x-0.2466。結(jié)果表明本試劑與進口試劑測定病人血清相關(guān)性良好，具有很好的特異性和準(zhǔn)確性。此外本試劑不僅適用于奧林巴斯AU400全自動生化分析儀還適用于其他全自動和半自動生化分析儀，具體參數(shù)可據(jù)主要參數(shù)做適當(dāng)調(diào)整。2靈敏度試驗表1表2分別顯示的是本發(fā)明檢測試劑和對照A公司試劑的靈敏度試驗結(jié)果，具體操作方法同上。結(jié)果顯示本發(fā)明試劑的靈敏度可達0.lmg/L，優(yōu)于對照A公司試劑。表1:<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>A公司試劑最低檢測限(LLD)二115.5+3X56.08781=283.76靈敏度0.58X283.76/659.65=0.25mg/L實施例3:檢測試劑的抗干擾性試驗本發(fā)明對檢測試劑(具體配方同實施例1)和對照試劑同時進行了抗干擾性試驗，試驗結(jié)果如表3所示，加入干擾物后，對各種干擾物的相對誤差均在10%以內(nèi)。對照試劑對各種干擾物的相對誤差都超過10%。顯示即使檢測樣品中存在一定濃度的干擾物包括血紅蛋白、膽紅素、Vc、甘油三酯等，對本發(fā)明的測定結(jié)果影響很小。表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>權(quán)利要求1.一種膠乳增強型胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于，包含試劑R1，試劑R2，所述的試劑R1為含有多聚物的緩沖液；所述的試劑R2為結(jié)合抗人胱抑素C抗體的聚苯乙烯膠乳溶液，膠乳顆粒直徑為50-150nm，置于合適的緩沖液。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠乳增強型胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑R1，R2的緩沖液是TRIS緩沖液或甘氨酸緩沖液，緩沖液的pH值為6.5-8.5。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的膠乳增強型胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于所述的緩沖液的pH值為7.0-8.0。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠乳增強型胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于，在試劑R1中，所述的多聚物包括TritonX，Tween，E70C或聚氧乙烯類多聚物等；在試劑R2中，結(jié)合有抗人胱抑素C抗體的苯聚乙烯膠乳溶液的含量為0.2-2.Omg/mL。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠乳增強型胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于試劑2中膠乳與抗人胱抑素C抗體的包被實驗采用物理吸附法或化學(xué)交聯(lián)法制備。6.據(jù)權(quán)利要求1所述的膠乳增強型胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于試劑2中膠乳與抗人胱抑素C抗體的包被實驗采用物理吸附法制備。7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的乳膠增強型胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于，在試劑R1中，所述的多聚物包括TritonX,Tween，E70C或聚氧乙烯類多聚物，其含量按按體積比為0.1-5.0%。8.根據(jù)權(quán)利要求書1所述的膠乳增強型胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于，其中還包括胱抑素c試劑的參考標(biāo)準(zhǔn)品。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的膠乳增強型胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于所述的胱抑素C試劑的參考標(biāo)準(zhǔn)，為胱抑素C濃度分別為0.5，1.0，2.0，4.0，8.Omg/L的五支標(biāo)準(zhǔn)品。10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的膠乳增強型胱抑素C檢測試劑盒，其特征在于所述的胱抑素C試劑的參考標(biāo)準(zhǔn)，為添加重組人胱抑素C純品的人血清或其它類似血清基質(zhì)的液體。全文摘要本發(fā)明公開一種檢測血清或血漿中胱抑素C的膠乳增強型免疫比濁試劑盒。該試劑盒采用膠乳包被的抗胱抑素C的抗體，與待測胱抑素C發(fā)生連鎖反應(yīng)，膠乳通過免疫反應(yīng)一層一層聚集形成不溶性免疫顆粒復(fù)合物，膠乳的粒徑發(fā)生改變引起濁度明顯變化，用光透射強度(570nm)或光散射強度檢測該變化，從用已知濃度胱抑素C標(biāo)準(zhǔn)品做出的標(biāo)準(zhǔn)曲線得出樣本中目標(biāo)檢測物胱抑素C的濃度。本發(fā)明所述試劑盒包含試劑R1，試劑R2，胱抑素C標(biāo)準(zhǔn)品。本發(fā)明的試劑測定胱抑素C是通過膠乳凝集反應(yīng)法進行的，是測定腎小球濾過率GFR的理想的內(nèi)源性標(biāo)記物，且較肌酐更為敏感和早期。使用本發(fā)明的方法靈敏度較高保證能夠檢測極低水平的胱抑素C，具有很高的臨床應(yīng)用價值。文檔編號G01N33/546GK101377492SQ200810084390公開日2009年3月4日申請日期2008年3月20日優(yōu)先權(quán)日2007年8月29日發(fā)明者孫國敬申請人:北京九強生物技術(shù)有限公司