專利名稱：：一種男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及蛋白芯片疾病檢測產(chǎn)品，具體地說，涉及一種男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片及其試劑盒。
背景技術(shù)：
：惡性腫瘤的早期診斷可以提高患者的預(yù)后和生存率，男性惡性腫瘤(包括原發(fā)性肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、胃癌、結(jié)腸直腸癌)的臨床診斷方法一般包括影像學(xué)檢査(如B超、X線鋇餐、X線、CT、MRI)、血清腫瘤標(biāo)志物檢測(如tPSA、AFP、CA19-9等)、直腸指診、內(nèi)鏡檢査(食管內(nèi)鏡、纖維胃鏡、可折式乙狀結(jié)腸鏡、全結(jié)腸鏡)和活組織病理檢査。盡管影像學(xué)檢査和內(nèi)鏡檢查可以早期發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤，但由于價格昂貴或具有入侵性，不能應(yīng)用于一般人群的體檢篩查。然而，多數(shù)惡性腫瘤早期鮮有臨床癥狀，當(dāng)出現(xiàn)癥狀去醫(yī)院就診時，已發(fā)展為惡性腫瘤中晚期，病人的預(yù)后和生存率較低。越來越多的研究顯示血清腫瘤標(biāo)志物檢測有助于惡性腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、提示預(yù)后或監(jiān)測病程，而且血清腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合檢測可以提高惡性腫瘤檢測的敏感性和特異性。目前用于血清標(biāo)志物檢測的方法可分為三大類單指標(biāo)單人份(如免疫膠體金、自動化免疫分析儀)、單指標(biāo)多人份(ELISA)和多指標(biāo)多人份(蛋白芯片)。與單指標(biāo)檢測方法相比，蛋白芯片檢測有樣本用量少、所需時間短、價廉等優(yōu)點(diǎn)，更適于多腫瘤標(biāo)志物的聯(lián)合檢測。男性，尤其是中年男性是社會的主要勞動力，同時也是最忙碌的群體，往往對身體過于自信，忽視檢查。需要一種簡便，適應(yīng)快節(jié)奏生活的檢査方法用于男性的體檢。目前市場上尚沒有專門針對男性腫瘤進(jìn)行檢測的多指標(biāo)蛋白檢測產(chǎn)品。另外腫瘤檢測指標(biāo)經(jīng)報道已經(jīng)不少，但指標(biāo)選擇不當(dāng)會產(chǎn)生假陽性或假陰性偏高的問題，從而使臨床檢測失去意義。所以我們需要一種指標(biāo)選擇合適，專門針對男性作腫瘤檢測的多指標(biāo)蛋白檢測產(chǎn)品。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明要提供一種專門用于男性腫瘤檢測，并且指標(biāo)選擇恰當(dāng)?shù)亩嗄[瘤蛋白標(biāo)志物檢測芯片，以及包含該芯片的試劑盒。本發(fā)明涉及的檢測指標(biāo)恰當(dāng)，應(yīng)用反應(yīng)條件一致，避免了交叉反應(yīng)和酶反應(yīng)底物的潛在危害和污染，大大提高了檢測的效率，降低了假陽性率。本發(fā)明可以適用于男性無癥狀人群和高危人群的惡性腫瘤普査。可同時篩査腫瘤包括原發(fā)性肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、胃癌和結(jié)腸直腸癌。輔助診斷原發(fā)性肝癌、前列腺癌和胰腺癌。指標(biāo)與檢測項目對應(yīng)關(guān)系見下表。<table>tableseeoriginaldocumentpage3</column></row><table>本發(fā)明目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，發(fā)明人根據(jù)己報道的腫瘤標(biāo)志物的臨床應(yīng)用情況以及中國男性腫瘤的流行病學(xué)特點(diǎn)，選取AFP、CEA、NSE、CYFRA21-1、CA19-9、tPSA和SCC-ag七個腫瘤標(biāo)志物，與陽性指標(biāo)，陰性指標(biāo)構(gòu)成陣列式點(diǎn)樣涂層，同時點(diǎn)陣于一張基片上，每個陣列可有多次重復(fù)。本發(fā)明涉及的用于男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片，由基片和陣列式分布于基片上的蛋白檢測指標(biāo)以及對照檢測指標(biāo)涂層組成，所述的蛋白檢測指標(biāo)包括AFP、CEA、NSE、CYFRA21-1、CA19-9、tPSA和SCC-ag共7個腫瘤標(biāo)志物，以共價鍵盤或非共價鍵固定在基片上面。所述的基片可以是玻璃片基，硝酸纖維素膜或尼龍膜。上述基片的一個優(yōu)選例是醛基化玻片。上述的對照檢測指標(biāo)涂層包括陽性對照和陰性對照；陽性對照為兔IgG抗體，陰性對照為抗體點(diǎn)樣所用的稀釋液。上述涂層上的每個陣列中蛋白檢測指標(biāo)每個有2-10個重復(fù)，對照指標(biāo)有1-5個重復(fù)。陣列的多少和大小與待檢樣品的數(shù)目，基片大小，以及點(diǎn)樣直徑有關(guān)。上述蛋白檢測指標(biāo)與檢測陣列的優(yōu)選例是當(dāng)?shù)鞍讬z測指標(biāo)點(diǎn)樣直徑為0.l腿時，點(diǎn)間距0.6mm，陣列大小為6mmX5mm,可在硝酸纖維素膜蛋白芯片上設(shè)置24個陣列。本發(fā)明還提供了包含上述男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片的試劑盒，還包括標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品；標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品為瓶裝，用紙質(zhì)模板固定于包裝盒內(nèi)。上述的試劑盒，還包括樣本稀釋液，酶標(biāo)工作液，濃縮洗滌液，檢測液；各液體為瓶裝，與標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品一起用紙質(zhì)模板固定于包裝盒內(nèi)。各部分由紙質(zhì)模具固定于一包裝盒內(nèi)，不限放置方式，檢測時配套使用。上述的標(biāo)準(zhǔn)品由5-10個不同濃度梯度的蛋白混合液組成，每個蛋白混合液裝入一個容器，蛋白混合液由7個多腫瘤標(biāo)志物蛋白檢測指標(biāo)按不同濃度混合而成。標(biāo)準(zhǔn)品用于在每次標(biāo)本檢測結(jié)束后做標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以定量測定樣品中的檢測指標(biāo)的蛋白濃度。上述的質(zhì)控品由3-6個不同濃度的蛋白混合液組成，每個蛋白混合液裝入一個容器，蛋白混合液由7個多腫瘤標(biāo)志物蛋白檢測指標(biāo)按不同濃度混合而成。質(zhì)控品可以監(jiān)測整個檢測系統(tǒng)的CV值，保證每次檢測結(jié)果的有效性。上述的樣本稀釋液是一種蛋白穩(wěn)定劑；可以是由3%BSA和0.05X防腐劑(Proclin300)的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配制而成；上述的酶標(biāo)工作液由含有冊P標(biāo)記的相應(yīng)抗原或單克隆抗體，以及檢測抗體HRP-羊抗兔IgG的前述樣本稀釋液組成；上述的濃縮洗滌液是一種中性緩沖液；可以是磷酸鹽緩沖液；上述的檢測液指配套使用的兩種試劑，一種含有魯米諾和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑，另一種含有過氧化氫。圖l是男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片的外觀圖，l為反應(yīng)區(qū)域，底部為點(diǎn)樣涂層的基片。圖2是點(diǎn)樣陣列示意圖，第1行為陽性對照兔IgG抗體和陰性對照，各有3個重復(fù)點(diǎn)樣；其余各行分別為蛋白檢測指標(biāo)點(diǎn)樣AFP、CEA、NSE、CYFRA21-1、CA19-9、tPSA和SCOag,每行兩個指標(biāo)，第一行AFP、CEA，第二行NSE、CYFRA21-1，第三行CA19-9、tPSA,第四行SCC-ag,各有5個重復(fù)點(diǎn)樣。圖3是男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片試劑盒示意圖。2代表濃縮洗滌液；3代表1瓶樣本稀釋液和1瓶酶標(biāo)工作液；4代表2瓶配套使用的檢測試劑；5代表標(biāo)準(zhǔn)品；6代表質(zhì)控品。圖4為檢測血清示意圖，其中12個矩形表示所在加樣區(qū)域加的是標(biāo)準(zhǔn)品，6個標(biāo)準(zhǔn)品每個重復(fù)2次；4個多邊形表示所在加樣區(qū)域加的是質(zhì)控品；其余圓形表示所在加樣區(qū)域加的是樣本。圖5為結(jié)果檢測為陰性的反應(yīng)區(qū)陣列圖，其中左上角3個亮點(diǎn)是陽性對照的信號，陰性對照和CEA、CYFRA21-1沒有信號，其余指標(biāo)有微弱信號。圖6為結(jié)果檢測為肝癌陽性的反應(yīng)區(qū)陣列圖。左上角3個亮點(diǎn)表示陽性對照的信號，第2排前5個亮點(diǎn)是AFP的信號。具體實(shí)施例方式實(shí)施例1:一種男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片的制備其步驟主要是(1)準(zhǔn)備基質(zhì)硝酸纖維素膜；(2)設(shè)計芯片，確定點(diǎn)陣的排列方式和點(diǎn)樣位置；(3)點(diǎn)樣針從384孔板吸出抗體噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上；(4)裝配硝酸纖維素膜，并且進(jìn)行封閉、干燥、包裝、保存。上述用于檢測男性多腫瘤標(biāo)志物抗體的蛋白芯片的制備方法具體包括以下步驟1.腫瘤標(biāo)志物檢測抗原抗體的確定檢測指標(biāo)抗原的確定-腫瘤標(biāo)志物CEA是由六段相似度很高的肽段組合而成，因而選擇了其中的Al+B1段進(jìn)行基因工程表達(dá)；PSA、NSE、SCC-ag和CYFRA2-1均為全長基因工程表達(dá)；而AFP和CA19-9則為純化的腫瘤細(xì)胞分泌抗原。檢測指標(biāo)抗體的確定所采用的檢測抗體對均為小鼠雜交瘤單克隆抗體對，其檢測精度和準(zhǔn)確度明顯優(yōu)于多克隆抗體。2.點(diǎn)樣制備具檢測指標(biāo)涂層的膜芯片用Gesim點(diǎn)樣儀噴點(diǎn)，點(diǎn)樣針從384孔板吸出抗體噴點(diǎn)于硝酸纖維素膜上，點(diǎn)陣形式為10X5矩形陣列，當(dāng)點(diǎn)直徑為O.lmm，點(diǎn)橫向間距為0.6mm，抗體陣列的大小為6mmX5咖；點(diǎn)樣后貼膜，封閉；最后將芯片干燥、包裝后于4'C保存。3.蛋白芯片組裝用具有分隔反應(yīng)區(qū)域的器具將反應(yīng)區(qū)域固定。組裝方式見ZL032298900。組裝完成后的示意圖如圖1。實(shí)施例2:試劑盒的制備一種男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片的試劑盒，由男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片，標(biāo)準(zhǔn)品，質(zhì)控品，樣本稀釋液，酶標(biāo)工作液，濃縮洗滌液，檢測液組成；各部分為瓶裝，用紙質(zhì)模板固定于包裝盒內(nèi)(如圖2)，不限放置方式，檢測時配套使用。以下是各部分的制備方法1.男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片為6X8孔板，由硝酸纖維素膜做為片基，組裝方式見ZL032298900。完成后外觀圖見圖1。2.標(biāo)準(zhǔn)品提供6瓶，每瓶0.25ml。用含有3%BSA和0.05X防腐劑(Proclin300)的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配置，其中AFP、CEA、CA19-9、tPSA、NSE、SCC-ag和CYFRA21-l標(biāo)準(zhǔn)品的終濃度見下表AFPCEACA19-9KU/LtFSA]NSESCC-agCYFRA21-1標(biāo)準(zhǔn)品里0000000標(biāo)準(zhǔn)品II0.50.220.110.20.1標(biāo)準(zhǔn)品III2.518.57.522標(biāo)準(zhǔn)品IV501010030標(biāo)準(zhǔn)品v1004020010603025標(biāo)準(zhǔn)品VI200803001610060503.質(zhì)控品提供4瓶，每瓶0.2ml。質(zhì)控品分為4個濃度，分別是LL(最低檢測濃度)、L(接近正常參考值上限的濃度)、M(界于最低檢測濃度和檢測上限之間的中間濃度)和H(檢測上限)。質(zhì)控品是用含有3%BSA和0.05X防腐劑(Proclin300)的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配制，下表顯示AFP、CEA、CA19—9、tPSA、NSE、SCOag和CYFRA21-1標(biāo)準(zhǔn)品的終濃度及質(zhì)控界限。質(zhì)控品L(質(zhì)控界限)質(zhì)控品M(質(zhì)控界限)質(zhì)控品H(質(zhì)控界限)3215250.51.5(is-":;(in:)in"(O.'t-('.(i.'(1.3-.7)10040，508503025〔7力H、20080300161006050、no::)12H>1f15.4'.9s.5國i(:'i,"上述質(zhì)控品質(zhì)控界限測定方法如下分別由2個實(shí)驗(yàn)人員按照標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作檢測質(zhì)控品LL、L、M和H，重復(fù)4次/板，每天每人重復(fù)測2塊芯片，重復(fù)檢測10天，分別計算質(zhì)控品LL、L、M和H的均值和標(biāo)準(zhǔn)差，質(zhì)控界限為5±2SD。4.樣本稀釋液由3%BSA和0.05X防腐劑(ProclirT300)的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配制而成。提供1瓶，9ml。用于稀釋血清樣本(體積比1:1)。AFP質(zhì)控品LLns(質(zhì)控界限)Q,;lofi:CA19-9KU/LtPSA0.1NSE1SCC-agCYFRA20.20.1Ec5.酶標(biāo)工作液.由3%BSA和0.05W防腐劑(Proclin300)的磷酸鹽緩沖液(pH7.4)配成溶液，含有冊P標(biāo)記的7個腫瘤標(biāo)志物特異的單克隆抗體，以及檢測抗體冊P-羊抗兔IgG。提供6ml，l瓶。6.濃縮洗滌液(10X)為磷酸鹽緩沖液。由以下方法配置而成磷酸二氫鉀6.8g，磷酸氫二鈉7.1g,TWEEN-2010ml，溶于1000ml純化水。各化學(xué)物質(zhì)均為分析純。提供50ml，1瓶。使用前用450ml去離子水稀釋，混勻。7.檢測液使用P正RCE公司的SuperSignalELfSAFemtoMaximumSensitivitySubstrate作為配套檢測液。A液、B液各1瓶，每瓶0.6ml。實(shí)施例3:蛋白芯片及試劑盒的應(yīng)用及檢測本發(fā)明所述的用于檢測男性多腫瘤標(biāo)志物抗體的蛋白芯片的應(yīng)用，主要采用抗體-抗原-酶標(biāo)二抗方法檢測人血液中的腫瘤標(biāo)志物抗體，方法是將人血清加于芯片表面，樣本中的抗原分別于固定在芯片上的相對應(yīng)的抗體結(jié)合，甩干后加入酶標(biāo)二抗反應(yīng)，洗去未結(jié)合的二抗，加入檢測液后l分鐘，掃描并收集信號，樣本點(diǎn)的信號強(qiáng)度與血清中抗原的濃度成正比。在上述用于檢測男性多腫瘤標(biāo)志物抗體的蛋白芯片試劑盒的應(yīng)用中，其抗原抗體反應(yīng)及檢測的具體使用方法如下(1)對噴點(diǎn)抗體、陽性對照、陰性對照的芯片用3%BSA溶液進(jìn)行封閉，室溫2小時，封閉基片表面非特異性位點(diǎn)；(2)甩干封閉液后，室溫放置4小時，進(jìn)行干燥；(3)在芯片的反應(yīng)區(qū)域，加入經(jīng)等比例稀釋的人血清樣品，以及6份標(biāo)準(zhǔn)品的2次重復(fù)，4份質(zhì)控品(加樣方式見示意圖4);每孔加100ul，置于恒溫反應(yīng)儀中37'C,振蕩反應(yīng)l小時，使抗原與抗體充分反應(yīng)；(4)甩干后，每孔加入酶標(biāo)二抗100ul，置于恒溫反應(yīng)儀中37°C，振蕩反應(yīng)30分鐘，并且用10倍稀釋的磷酸緩沖液在搖床上振蕩洗滌三次，每次1分鐘；(5)將PIERCE公司的SuperSignalELISAFemtoMaximumSensitivitySubstrate的配套使用的檢測液A液和B液1:1混合，加入芯片上各反應(yīng)區(qū)域上，每陣列加20ul，進(jìn)行化學(xué)發(fā)光；(6)用CCD檢測儀進(jìn)行化學(xué)發(fā)光的掃描并收集信號，依據(jù)掃描結(jié)果顯示分析檢測結(jié)，。如圖5為結(jié)果檢測為陰性的陣列圖，圖6為結(jié)果檢測為肝癌陽性的陣列圖。權(quán)利要求1.一種男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片，其特征在于，由基片和陣列式分布于基片上的蛋白檢測指標(biāo)以及對照檢測指標(biāo)涂層組成，所述的蛋白檢測指標(biāo)包括AFP、CEA、NSE、CYFRA21-1、CA19-9、tPSA和SCC-ag共7個腫瘤標(biāo)志物，以共價鍵或非共價鍵固定在基片上面。2.如權(quán)利要求l所述的男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片，其特征在于，所述的基片可以是玻璃片基，硝酸纖維素膜或尼龍膜。3.如權(quán)利要求2所述的的男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片，其特征在于，所述的玻璃片基是帶有醛基修飾的載玻片。4.如權(quán)利要求1或2或3所述的的男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片，其特征在于，所述的對照指標(biāo)包括1個陽性對照和1個陰性對照；陽性對照為兔IgG抗體，陰性對照為抗體點(diǎn)樣所用的稀釋液。5.如權(quán)利要求4所述的男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片，其特征在于，所述的涂層上每個檢測指標(biāo)有2-IO個重復(fù)，對照指標(biāo)有l(wèi)-5個重復(fù)。6.—種男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，包含權(quán)利要求1所述的男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片，標(biāo)準(zhǔn)品和質(zhì)控品；標(biāo)準(zhǔn)品與質(zhì)控品為瓶裝，用紙質(zhì)模板固定于包裝盒內(nèi)。7.如權(quán)利要求6所述的男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，還包括樣本稀釋液，酶標(biāo)工作液，濃縮洗滌液和檢測液；各液體為瓶裝，用紙質(zhì)模板固定于包裝盒內(nèi)。8.如權(quán)利要求6或7所述的男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，所述的標(biāo)準(zhǔn)品由5-IO個不同濃度梯度的蛋白混合液組成，每個蛋白混合液裝入一個容器，蛋白混合液由7個多腫瘤標(biāo)志物蛋白檢測指標(biāo)按不同濃度混合而成。9.如權(quán)利要求6或7所述的男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，所述的質(zhì)控品由3-6個不同濃度的蛋白混合液組成，每個蛋白混合液裝入一個容器，蛋白混合液由7個多腫瘤標(biāo)志物蛋白檢測指標(biāo)按不同濃度混合而成。10.如權(quán)利要求7所述的男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片試劑盒，其特征在于，各部分配制方法如下所述的樣本稀釋液為蛋白穩(wěn)定劑所述的酶標(biāo)工作液由含有HRP標(biāo)記的相應(yīng)抗原的單克隆抗體，以及檢測抗體HRP-羊抗兔IgG的前述樣本稀釋液組成；所述的濃縮洗滌液為中性緩沖液；所述的檢測液指配套使用的兩種試劑，一種含有魯米諾和化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑，另一種含有過氧化氫。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于男性多腫瘤標(biāo)志物檢測蛋白芯片及其試劑盒，該芯片包括基片和陣列式分布的蛋白標(biāo)志物與對照的點(diǎn)涂層，所述的基片是玻璃基片或膜基片；所述的腫瘤標(biāo)志物與對照的點(diǎn)涂層是指在基片上均勻分布的，點(diǎn)陣于基片上的AFP、CEA、NSE、CYFRA21-1、CA19-9、tPSA和SCC-ag七個蛋白標(biāo)志物及陽性對照、陰性對照。利用本發(fā)明的蛋白芯片僅通過一次反應(yīng)就可得到多種指標(biāo)的反應(yīng)結(jié)果，可以同時篩查下列腫瘤原發(fā)性肝癌、前列腺癌、胰腺癌、肺癌、食管癌、胃癌和結(jié)腸直腸癌。特別適用于男性無癥狀人群和高危人群的惡性腫瘤普查。文檔編號G01N33/68GK101603966SQ200810038869公開日2009年12月16日申請日期2008年6月12日優(yōu)先權(quán)日2008年6月12日發(fā)明者璐張,汪寧梅,穆海東,蓉顧申請人:上海裕隆生物科技有限公司