專利名稱：一種stlv雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥生物領(lǐng)域，具體底是涉及一種改良的STLV雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附 (ELISA)測定法及其試劑盒。
技術(shù)背景猴T淋巴細胞趨向性病毒1型(Simian T-lymphotropic virus type 1， STLV-l)是猴群中 一種重要的傳染性病毒，該病毒主要侵害猴的免疫系統(tǒng)，引起免疫器官的病變或免疫機能紊 亂，從而影響動物實驗的研究。早在1992年，中華人民共和國衛(wèi)生部頒布的《醫(yī)學實驗動物 標準》規(guī)定STLV-1型是SPF實驗猴必須排除的病毒之一。隨著當前國際市場對SPF實驗猴需求 量的增加，STLV-l病毒已被列為必須排除的病原之一。酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)后發(fā)展的一種酶免技術(shù)，涉及 到醫(yī)學、生物學、遺傳學、免疫等許多科學，其基本原理是利用抗原、抗體的特異性反應， 用已知抗原或抗體檢測未知抗原或抗體，由于ELISA試驗方法具有敏感、特異、經(jīng)濟、簡便、 安全等特點，在疾病的診斷和療效觀察以及預防醫(yī)學方面應用尤為廣泛。目前使用的STLV雙抗原夾心方法用于測定抗體，基本操作步驟如下 1、抗原包被將特異性抗原包被固相載體，使形成固相抗原后，洗去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)；2、 加入待檢測的血清或血漿標本，使標本中的抗體與固相載體上的抗原充分反應，形成固相 抗原抗體復合物，洗滌除去未結(jié)合抗體和雜質(zhì)；3、 加入酶標的已知抗原，孵育，使形成固相抗原-待測抗體-酶標抗原夾心復合物，洗滌除去 未結(jié)合酶標抗原。4、 加底物顯色。固相上的酶催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物,通過比色,測標本中抗體的量。上述ELISA方法中，由于步驟較多，經(jīng)常會發(fā)生酶標抗原和標本漏加或錯加的現(xiàn)象，標 本污染酶標抗原的現(xiàn)象，以及溶液狀態(tài)保存的酶標抗原會由于運輸和放置過程中產(chǎn)生的各種 原因?qū)е旅庖呋钚韵陆?，進而影響檢測結(jié)果的準確性，因此，本發(fā)明旨在建立一種方便可行 的雙抗原夾心快速檢測方法，提高檢測靈敏度，加快檢測速度，降低加樣過程中的污染問題， 節(jié)省人力、物力，降低檢測成本。發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題之一在于提供一種新的STLV雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法，該測定法可減少雙抗原夾心方法中的加樣步驟，減少加樣污染，且更為快速、靈敏的檢 測方法。解決的技術(shù)問題的技術(shù)內(nèi)容如下一種STLV雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法，包括以下步驟A. 制備酶聯(lián)板1) 、抗原包被將6ng/mL的(90—110yL) STLV特異性抗原包被聚氯乙烯板或聚苯乙烯板 中的微孔中，使形成固相抗原后，洗去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，4'C陰干，得到包被板；2) 、包被板封閉(110—130 iiL)封閉液于4。C加到包被板的微孔中，封閉10—14h,甩干后 陰干；3) 、加入(45 — 55uL)酶標的已知STLV抗原(6ng/mL)，放在真空冷凍干燥箱中干燥l-3h， 使之附著在固相抗原表面，得到制備好的酶聯(lián)板；B. 檢測步驟4) 、加入40 —60u L被待檢測的血清或血漿標本以及(40—60yL)標本稀釋液，使標本中的 抗體與固相載體上的抗原復合物充分反應，形成固相抗原-抗體-酶標抗原復合物，洗滌除去 未結(jié)合抗體和雜質(zhì)；5) 、加底物顯色加入顯色底物(頂B)，固相上的酶催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物，通過比色，測標 本中抗體的量。本發(fā)明中，酶聯(lián)板為聚氯乙烯板或聚苯乙烯板，優(yōu)選聚苯乙烯板。本發(fā)明中，封閉液為(O. lmol/1) PBS溶液，內(nèi)含1% BSA (牛血清白蛋白)、4%蔗糖，5 %。蛋白胨，有效屏蔽未包被的空間，減少非特異性反應。本發(fā)明中，標本稀釋液為(0.015mol/L)三羥甲基氨基甲烷溶液，內(nèi)含2%蔗糖，1%。吐 溫-20， 1%。硫柳汞，10%小牛血清，減少非特異性反應。本發(fā)明中，所述小牛血清的是滅活或不滅活的無菌小牛血清。本發(fā)明所要解決的另一技術(shù)問題是提供一種STLV雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試劑盒。具體方案如下一種STLV雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，其特征是包括有酶聯(lián)板，該酶聯(lián)板為包 被有固相STLV特異性抗原-酶標STLV抗原復合物的聚氯乙烯板或聚苯乙烯板；該酶聯(lián)板的制 備方法為1)、抗原包被將濃度為6 Pg/mL的STLV特異性抗原90—110 ixL包被聚氯乙烯 板或聚苯乙烯板中的微孔中，使形成固相抗原后，洗去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，4'C陰干，得到 包被板；2) 、包被板封閉將110-130 iiL封閉液4i:加到包被板的微孔中，封閉10—14 h,甩干后陰 干；3) 、每孔微孔中加入濃度為8X102 ug/mL酶標的STLV抗原45 — 55yL，放在真空冷凍干燥箱 中干燥，使之附著在固相抗原表面，得到制備好的酶聯(lián)板。本發(fā)明中，所述的酶聯(lián)板中加入了特異性抗原和特異性酶標抗原。避免在檢測過程中添 加酶標抗原，減少雙抗原夾心方法中的加樣步驟，減少加樣污染；其二，酶標抗原以一種固 化的方式，降低了運輸或保存過程中活性的降低。本方法不僅對醫(yī)學微生物病原診斷有價值， 而且對流行病學調(diào)查、篩選、臨床診斷有重要意義。經(jīng)過改良的雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附ELISA 測定法及其試劑盒具有檢測速度快，節(jié)省人力、物力、降低檢測成本等優(yōu)點。符合快速、簡 單、明了的方法，易于推廣，能滿足基礎需要，并適合流行病學調(diào)査。
具體實施方式
以下實施例中，所用試劑為封閉液(0. lmo1/1) PBS溶液(Na,C03-NaHC03緩沖液)，內(nèi)含1% BSA (牛血清白蛋白)、 4%蔗糖，5%。蛋白胨。標本稀釋液(0.015mol/L)三羥甲基氨基甲垸溶液，內(nèi)含2%蔗糖，1%。吐溫-20, 1%0硫 柳汞，10%小牛血清。本實施例中，STLV特異性抗原和酶標抗原來自北京養(yǎng)生堂生物技術(shù)有限公司。實施例1STLV雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附ELISA測定法，包括下列步驟 (一)制備酶聯(lián)板1、 抗原包被將濃度為6 w g/mL的STLV特異性抗原100 n L (可用0. lmol/1 PBS溶液作 為抗原稀釋液)包被固相載體，使形成固相抗原后，洗去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，4'C陰干；2、 包被板封閉(120 !iL)封閉液4r放置12 h，甩干后陰干；3、 加入濃度為8X10—2 Pg/mL (50 uL)酶標的STLV抗原，放在真空冷凍干燥箱中干燥2h， 使之附著在固相抗原表面；取出后放室溫平衡lh，得到制備好的酶聯(lián)板。檢測步驟
1、 加入50 yL實驗猴的血清或血漿標本以及50 uL稀釋液，使標本中的抗體與固相載體上 的抗原復合物充分反應，形成固相抗原-抗體-酶標抗原復合物，洗滌除去未結(jié)合抗體和雜質(zhì);
2、 加底物顯色。固相上的酶催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物,通過比色，測標本中抗體的量。 靈敏度和特異性檢測結(jié)果血清樣品陽性結(jié)果/測試樣品敏感度S柳plePositive/testedSensitivitySTLV90/90100%血清樣品陰性結(jié)果/測試樣品特異性SampleNegative/testedSpecificityBV infectors8/8100%SIV infectors8/988. 9%Healthy donors82/8398. 7%(98/100)98. 0%
權(quán)利要求
1.一種STLV雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法，其特征是包括以下步驟A.制備酶聯(lián)板1)、抗原包被將濃度為6μg/mL的STLV特異性抗原90-110μL包被聚氯乙烯板或聚苯乙烯板中的微孔中，使形成固相抗原后，洗去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，4℃陰干，得到包被板；2)、包被板封閉將110-130μL封閉液于4℃加到包被板的微孔中，封閉10-14h，甩干后陰干；3)、每孔微孔中加入濃度為8×10-2μg/mL酶標STLV抗原45-55μL，放在真空冷凍干燥箱中干燥，使酶標STLV抗原附著在固相抗原表面，得到制備好的酶聯(lián)板；B.檢測步驟4)、加入40-60μL待檢測的血清或血漿標本以及40-60μL標本稀釋液，37℃溫育1-2h，使標本中的抗體與固相載體上的抗原復合物充分反應，形成固相抗原-抗體-酶標抗原復合物，洗滌除去未結(jié)合抗體和雜質(zhì)；5)、加底物顯色加入顯色底物，固相上的酶催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物，通過比色，測標本中抗體的量。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的STLV雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法，其特征是所述封閉液為 0. lmo1/1的PBS溶液，該溶液中還含有1% BSA、 4%蔗糖，5%。蛋白胨。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的STLV雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法，其特征是所述標本稀釋液 為0.015mol/L的三羥甲基氨基甲烷溶液，該溶液中還含有2%蔗糖，1%。吐溫-20， 1%。硫柳汞， 10%小牛血清。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的STLV雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法，其特征是步驟l)中包 被抗原的量為50uL;步驟3)中加入酶標的STLV抗原的量為50nL。
5. —種STLV雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，其特征是包括有酶聯(lián)板，該酶聯(lián)板為包被有 固相STLV特異性抗原-酶標STLV抗原復合物的聚氯乙烯板或聚苯乙烯板；該酶聯(lián)板的制備方 法為1)、抗原包被將濃度為6 y g/mL的STLV特異性抗原90 — 110 u L包被聚氯乙烯板或 聚苯乙烯板中的微孔中，使形成固相抗原后，洗去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)，4'C陰干，得到包被 板；2) 、包被板封閉將110-130 yL封閉液4'C加到包被板的微孔中，封閉10—14 h，甩干后陰 干；3) 、每孔微孔中加入濃度為8X10—2 W g/mL酶標的STLV抗原45 — 55 uL，放在真空冷凍干燥箱 中干燥，使之附著在固相抗原表面，得到制備好的酶聯(lián)板。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述STLV雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附試劑盒，其特征是步驟1 )中包被STLV 特異性抗原的量為50iiL;步驟3)中加入酶標的STLV抗原的量為50"L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種STLV雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法及其試劑盒，該測定法包括以下步驟1)STLV抗原包被；2)包被板封閉；3)加入酶標的STLV抗原；4)加入被檢標本以及標本稀釋液，使標本中的抗體與固相載體上的抗原復合物充分反應，形成固相抗原-抗體-酶標抗原復合物，洗滌除去未結(jié)合抗體和雜質(zhì)；5)加底物顯色，通過比色，測標本中抗體的量。經(jīng)過改良的STLV雙抗原夾心酶聯(lián)免疫吸附測定法及其試劑盒具有檢測速度快，節(jié)省人力、物力、降低檢測成本等優(yōu)點。符合快速、簡單、明了的方法，易于推廣，能滿足基礎需要，并適合流行病學調(diào)查。
文檔編號G01N33/569GK101246167SQ200810026820
公開日2008年8月20日 申請日期2008年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2008年3月17日
發(fā)明者萬玉玲, 劉曉明, 芳 季, 饒軍華 申請人:廣東省昆蟲研究所