專利名稱：：飲用水生物活性炭處理工藝的脫氫酶活性測定預處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及水處理
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體地說是涉及一種飲用水活性炭處理工藝中活性炭填料的脫氫酶活性測定預處理方法。技術(shù)背景由于飲用水常規(guī)處理工藝的局限，深度處理工藝應(yīng)用越來越普遍，其中生物活性炭技術(shù)因其兼具吸附和生物處理作用而得到廣泛的應(yīng)用，而評價生物載體填料的生物活性是判定其生物處理作用強弱的關(guān)鍵。生物體的脫氫酶活性在很大程度上反映了生物體的活性狀態(tài)，因此脫氫酶活性檢測被廣泛應(yīng)用于水處理領(lǐng)域。脫氫酶活性測定方法自1959年正式應(yīng)用于生化分析中以來，國內(nèi)外很多學者對其進行了多次改進。使用較多的為2，3,5—氯化三苯基四氮唑一脫氫酶活性檢測方法，通過測定萃取出的還原產(chǎn)物三苯基甲胺，計算生物活性值。該方法較多應(yīng)用于污水生物處理領(lǐng)域，而在飲用水生物處理中應(yīng)用較少。已有的樣品預處理方法包括超聲洗脫和振搖破碎，樣品測定主要包括萃取和離心。飲用水臭氧生物活性炭工藝中，細菌等微生物的吸附載體為微孔結(jié)構(gòu)復雜的顆粒活性炭，其吸附機理有別于活性污泥，再者污水中微生物濃度高于飲用水，特別是高于以自然掛膜為炭床生物形成方式的處理工藝，其對載體的吸附作用可能強于飲用水，所以在臭氧生物活性炭工藝中采用超聲洗脫或振搖破碎的方法無法使吸附的微生物完全脫落，從而導致之后的測定值很小或出現(xiàn)負值。實驗結(jié)果表明，上述脫氫酶活性中的預處理方法難以高效實現(xiàn)活性炭填料的活性測定。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于提供了一種飲用水生物活性炭處理工藝的活性炭填料的脫氫酶活性測定方法，本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)的針對飲用水生物活性炭處理工藝活性炭低生物活性情況，建立了一種基于新型有機混合試劑測定活性炭脫氫酶活性的預處理方法，即根據(jù)活性炭吸附特征，提出了預處理所用有機混合試劑的配比及使用方法，為飲用水生物處理中生物載體脫氫酶測定提供了新的預處理方法。本發(fā)明方法的實施步驟1.飲用水生物活性炭處理工藝的脫氫酶活性測定預處理方法，其特征在于該方法步驟如下(l)對活性炭填料進行前處理先分別取不同深度的活性炭填料置于具塞三角瓶A、B、C中，分別先添加氯仿、甲醇和蒸餾水的萃取混合液，然后再分別添加氯仿和蒸餾水；(2)對前處理后的活性炭填料分別測定吸光度值分別吸取定量的萃取后的上下兩相液體置于比色管D、E、F中，依次加入三相鹽酸緩沖液、亞硫酸鈉溶液、純水，以甲醛作為終止試劑，反應(yīng)完全后再分別添加三氯甲烷，并分別測定吸光度值；(3)繪制標準曲線并將步驟(2)中的吸光度值轉(zhuǎn)化為三苯基甲胺生成量即脫氫酶活性值按步驟(2)中的活性炭填料萃取液的測定過程，測定2，3，5—三苯基氯化四氮唑不同序列濃度下生成的三苯基甲胺的吸光度值，并繪制標準曲線，得出線性回歸方程，最后將吸光度值代入回歸方程得出三苯基甲胺生成量，即脫氫酶活性值。在步驟(1)中所述的前處理方法為，分別取距離炭床頂層40、80、120cm深度活性炭填料2025g放入100mL具塞三角瓶A、B、C中；首先加入體積比為1:2:1的氯仿、甲醇和蒸餾水的萃取混合液，恒溫水浴搖床120rpm振搖10-15min，靜置6h，再向三角瓶中分別加入氯仿和蒸餾水，使最終體積比例為1.25:1:1，置于搖床120rpm振蕩20min，靜置6h。在步驟(2)中所述的針對前處理條件選定的測定過程待分層穩(wěn)定后，分別吸取具塞三角瓶A、B、C中間分界面下層有機相5ml，分界面上層無機相5ml，分別移至50ml比色管D、E、F，向比色管中依次加入三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液(pH8.4)、Na2S03溶液(0.36%)、蒸餾水以及2,3,5—三苯基氯化四氮唑溶液(0.4%),體積比為3:l:l:h從比色管D、E、F中分別吸取2ml下層有機相和8ml上層水相，置于比色管G、H、沖，分別加入2ml甲醛固定以做樣品空白，將比色管D、E、F、G、H、I于35-37t;條件下水浴恒溫振蕩培養(yǎng)3h，振蕩速度80rpm，然后向D、E、F比色管內(nèi)加3.0ml甲醛中止酶反應(yīng)；再分別向D、E、F比色管中加9ml三氯甲垸，分別向G、H、I比色館中加6ml三氯甲垸，混勻，將比色管D、E、F、G、H、I于室溫繼續(xù)振蕩10min后，離心5min(4000轉(zhuǎn)/分鐘)，分別取下層有機相，于波長485nm處進行比色，記錄吸光值。在步驟(3)中所述的繪制標準曲線另取8支50mL比色管，分別向其中依次加入7.5ml三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液、2.5ml蒸餾水及2.5ml不同濃度的2,3,5—三苯基氯化四氮唑系列溶液；再分別加入lg低亞硫酸鈉，顯色5min后，分別加入5mL三氯甲烷，80rpm振搖萃取3min，待溶液穩(wěn)定后，分別取下層有機溶液至lcm的比色皿中；再次穩(wěn)定l-2min后，于752紫外光柵分光光度計于485nm處測定吸光度值，繪制標準曲線，同時得到線性回歸方程；根據(jù)得到的吸光度值，代入線性回歸方程，進而計算出三苯基甲胺的生成量，即脫氫酶的活性。本發(fā)明方法的優(yōu)點如下該技術(shù)實現(xiàn)了有機混合試劑對脫氫酶的萃取作用，使得活性炭填料中活體微生物得以充分洗脫，為后續(xù)的顯色物質(zhì)測定提供了保障，實驗證明效果十分明顯；該脫氫酶活性的預處理方法只需要借助普通微生物實驗室即可完成，復合試劑取材方便，操作成本較為低廉，其經(jīng)濟可行性較高；該技術(shù)也適用于其他填料的生物活性分析，操作步驟簡便易行，應(yīng)用前景廣泛。具體實施例方式研究試驗以南方某水廣臭氧-生物活性炭工藝為研究對象，通過控制不同實驗條件，最終找到合理有效的預處理和測定方案。實驗在某水廠進行，該實驗使用自制的活性炭取樣器。活性炭池的運行參數(shù)為空床接觸時間為15min，氣水聯(lián)合反沖洗。經(jīng)過3個月，工藝運行趨于穩(wěn)定，正式進入實驗階段。分別取距離炭床頂層40、80、120cm深度的活性炭填料2025g，分別放入3個100mL具塞三角瓶中，分別加入氯仿、甲醇和水的萃取混合液(體積比1:2:1)，于恒溫水浴搖床120rpm振搖10min，靜置6h。再向三角瓶中分別加入氯仿和水，使最終比例為1.25:1:1，置于搖床120rpm振蕩20min，靜置6h。待三角瓶中液相分層穩(wěn)定后，分別吸取中間分界面下層有機相5ml，分界面上層無機相5ml，移至3個50ml比色管D、E、F。向比色管中依次分別加入7.5ml三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液、2.5mlNa2S03溶液(0.36%)、2.5ml純水以及2.5ml2，3，5—三苯基氯化四氮唑溶液(0.4%)。從上述3個比色管中的混合液中分別吸取2ml下層有機相和8ml上層水相，置于另夕卜3個對應(yīng)的比色管G、H、沖，分別加入2ml甲醛固定以做空白對照。將6個比色管于37"條件下水浴恒溫振蕩培養(yǎng)3h，振蕩速度80rpm，然后向D、E、F內(nèi)分別加3.0ml甲醛中止酶反應(yīng)。再分別向D、E、F中力n9ml三氯甲垸，分別向G、H、I中加6ml三氯甲垸，，混勻。將6個比色管于室溫繼續(xù)振蕩10min后，離心5min(4000rpm)。分別取下層有機相，于波長485nm處進行比色，記錄吸光值；根據(jù)得到的吸光值，對照標準曲線，帶入線性回歸方程，進而計算出三苯基甲胺的生成量，即脫氫酶的活性。繪制標準曲線另取8支50mL比色管中，向其依次加入7.5ml三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、2.5ml蒸餾水以及2.5ml濃度分別為0、5、10、15、20、40、60、80ng/ml的2，3,5—三苯基氯化四氮唑系列溶液。再加入lg低亞硫酸鈉，顯色5min后，分別加入5mL三氯甲垸，振搖萃取3min。待溶液穩(wěn)定后，分別取下層有機溶液至lcm的比色皿中。再次穩(wěn)定l-2min后，于752紫外光柵分光光度計于485nm處測定吸光度值，繪制標準曲線，得到線性回歸方程。實驗結(jié)果表明，使用已有的生物活性測定方法，在測試的過程中，經(jīng)常出現(xiàn)空白的吸光值高于樣品的吸光值，亦即在生物活性較低的情況下得到的脫氫酶活性為負值；而在使用上述該方法后，兩次平行試驗得到的結(jié)果如下表，同時由標準曲線得到線性回歸方程為y=534.97x-14.74(R2=0.9849)，式中y代表三苯基甲胺的生成量，即脫氫酶的活性值，x代表試驗測得的吸光度值，R2代表標準曲線的相關(guān)系數(shù)。表l活性炭工藝炭床填料的兩次平行試驗脫氫酶活性結(jié)果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1.飲用水生物活性炭處理工藝的脫氫酶活性測定預處理方法，其特征在于該方法步驟如下(1)對活性炭填料進行前處理先分別取不同深度的活性炭填料置于具塞三角瓶A、B、C中，分別先添加氯仿、甲醇和蒸餾水的萃取混合液，然后再分別添加氯仿和蒸餾水；(2)對前處理后的活性炭填料分別測定吸光度值分別吸取定量的萃取后的上下兩相液體置于比色管D、E、F中，依次加入三相鹽酸緩沖液、亞硫酸鈉溶液、純水，以甲醛作為終止試劑，反應(yīng)完全后再分別添加三氯甲烷，并分別測定吸光度值；(3)繪制標準曲線并將步驟(2)中的吸光度值轉(zhuǎn)化為三苯基甲胺生成量即脫氫酶活性值按步驟(2)中的活性炭填料萃取液的測定過程，測定2，3，5-三苯基氯化四氮唑不同序列濃度下生成的三苯基甲胺的吸光度值，并繪制標準曲線，得出線性回歸方程，最后將吸光度值代入回歸方程得出三苯基甲胺生成量，即脫氫酶活性值。2.按權(quán)利要求1所述的飲用水生物活性炭處理工藝的脫氫酶活性測定預處理方法，其特征在于在步驟(l)中所述的前處理過程分別取距離炭床頂層40、80、120cm深度活性炭填料2025g放入100mL具塞三角瓶A、B、C中，首先加入體積比為1:2:1的氯仿、甲醇和蒸餾水的萃取混合液，恒溫水浴搖床120rpm振搖10-15min，靜置6h，再分別向A、B、C三角瓶中加入氯仿和蒸餾水，使氯仿、甲醇和蒸餾水的最終體積比為1.25:1:1，置于搖床120rpm振蕩20min，靜置6h。3.按權(quán)利要求l所述的飲用水生物活性炭處理工藝的脫氫酶活性測定預處理方法，其特征在于在步驟(2)中所述的對前處理條件選定的測定過程待分層穩(wěn)定后，分別吸取具塞三角瓶A、B、C中間分界面下層有機相5ml，分界面上層無機相5ml，分別移至50m此色管D、E、F，向比色管中依次加入pH8.4的三羥甲基氨基甲垸-鹽酸緩沖液、0.36。/。Na2S03溶液、蒸餾水以及0.4%的2，3,5—三苯基氯化四氮唑溶液，體積比為3:1:1:1;從比色管D、E、F中分別吸取2ml下層有機相和8ml上層水相，置于比色管G、H、沖，分別加入2ml甲醛固定以做樣品空白，將比色管D、E、F、G、H、I于35-37'C條件下水浴恒溫振蕩培養(yǎng)3h，振蕩速度80rpm，然后向D、E、F比色管內(nèi)加3.0ml甲醛中止酶反應(yīng)；再分別向D、E、F比色管中加9ml三氯甲垸，分別向G、H、I中加6ml三氯甲垸，混勻，將比色管D、E、F、G、H、I于室溫繼續(xù)振蕩10min后，離心5min，4000轉(zhuǎn)/分鐘，分別取下層有機相于波長485nm進行比色測定，記錄吸光值。4.按權(quán)利要求l所述的飲用水生物活性炭處理工藝的脫氫酶活性測定預處理方法，其特征在于在步驟(3)中所述的繪制標準曲線另取8支50mL比色管，分別向其中依次加入7.5ml三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖液、2.5ml蒸餾水及2.5ml不同濃度的2，3,5—三苯基氯化四氮唑系列溶液；再分別加入lg低亞硫酸鈉，顯色5min后，分別加入5mL三氯甲垸，80rpm振搖萃取3min，待溶液穩(wěn)定后，分別取下層有機溶液至lcm的比色皿中；再次穩(wěn)定l-2min后，于752紫外光柵分光光度計于485nm處測定吸光度值，繪制標準曲線，同時得到線性回歸方程；根據(jù)得到的吸光度值，代入線性回歸方程，進而計算出三苯基甲胺的生成量，即脫氫酶的活性。全文摘要一種飲用水生物活性炭處理工藝的脫氫酶活性測定預處理方法，由三種試劑組合成的混合溶液，通過控制加入比例、加入時間及操作條件，完成預處理，并由此選定測定過程并繪制標準曲線。優(yōu)點本技術(shù)從化學的角度出發(fā)，利用有機試劑對吸附的微生物進行萃取洗脫，脫附程度較高；通過有效的配比和振蕩方式對以活性炭為載體的脫氫酶活性進行檢測，并確定最佳的有機溶劑組合和配比達到最大的測定效果；為相似生物載體的活性檢測提供了借鑒方法，適用于飲用水處理工藝中生物載體的生物活性檢測。文檔編號G01N21/78GK101256147SQ20081002346公開日2008年9月3日申請日期2008年4月15日優(yōu)先權(quán)日2008年4月15日發(fā)明者濤林,王磊磊,衛(wèi)陳申請人:河海大學