專利名稱：一種生物活性炭上微生物dna提取預(yù)處理方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種生物活性炭上微生物DNA提取預(yù)處
理方法。
背景技術(shù)：
活性炭由于具有良好的吸附性能，化學(xué)性能穩(wěn)定，可耐強酸及強堿，能經(jīng)受水浸、高溫、比水還輕，是多孔性的疏水性吸附劑，故已廣泛用于去除飲用水中的臭味、色度、天然及人工合成有機物?；钚蕴可细街囊晕⑸锛捌浒舛嗑畚餅橹黧w的生物膜是水體中有害物質(zhì)生物降解的主要部分。因此鑒定分析活性炭表面微生物群落結(jié)構(gòu)和分布對于明確飲用水深度處理中活性炭生物降解機制以及微生物泄露導(dǎo)致的健康風(fēng)險具有重要意義。
傳統(tǒng)的微生物檢測是建立在微生物的分離培養(yǎng)基礎(chǔ)上的，檢測周期長，操作復(fù)雜，特異性不強。同時環(huán)境中的大量微生物無法實現(xiàn)人工培養(yǎng)，或者在培養(yǎng)過程中由于生存環(huán)境的改變而改變原有的群落結(jié)構(gòu)，因此僅靠現(xiàn)有的微生物培養(yǎng)技術(shù)不能全面地反映所在環(huán)境的微生物多樣性。分子生物學(xué)技術(shù)于是成為了研究生物活性炭微生物群落的主要手段。然而，由于處理飲用水的生物活性炭上的生物量相對少，并且和載體顆粒結(jié)合緊密，所以菌體很難直接從活性炭上洗脫下來。另一方面，活性炭上吸附的腐殖酸在自然條件下不易發(fā)生生物降解，又表現(xiàn)出極性、氧化還原性、絡(luò)合與吸附等多重理化性質(zhì)，在經(jīng)典的DNA提取過程中與粘粒及金屬離子等相互作用而將微生物裹挾其中，阻止SDS等變性劑的滲透并抑制溶菌酶及蛋白酶K等的活性，影響裂解緩沖液對微生物的裂解。同時經(jīng)堿性裂解液處理后溶出的黃腐酸與棕腐酸既能氧化為醌，又能還原為酚，會導(dǎo)致部分DNA隨氧化的苯酚進(jìn)入有機相而喪失。即使采用透析、離子交換、密度梯度離心、層析和電泳等不同方法對核酸粗提物進(jìn)行進(jìn)一步純化，仍有一些理化性質(zhì)與核酸相近的腐殖酸組分與之共存，從而影響到核酸的定量及后續(xù)的PCR擴增等技術(shù)過程。然而，傳統(tǒng)的DNA提取和市售DNA提取試劑盒都不能有效解決上述問題，因此如何在裂解細(xì)胞前采用去除腐植酸的預(yù)處理和有效微生物洗脫方法就成為從生物活性炭上獲得產(chǎn)量大質(zhì)量高的DNA的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種生物活性炭上微生物DNA提取預(yù)處理方法，以獲得產(chǎn)量和純度均達(dá)到適用于下游分子生物學(xué)操作的DNA片段。一種生物活性炭上微生物DNA提取預(yù)處理方法，該方法包括步驟如下(I)生物活性炭的脫腐將生物活性炭與脫腐緩沖液按質(zhì)量/體積比I : 10混合，旋潤2min后，在50°C下反應(yīng)IOmin,再旋潤2min后，在轉(zhuǎn)速為I. OX IO4 rpm下離心5min ;其中脫腐緩沖液為NaOH濃度為200mM、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)濃度為2. Owt%的混合溶液；(2)超聲洗脫取上述離心后的活性炭，溶于滅菌的去離子水中，旋渦2min后常溫下水浴20min，進(jìn)行Imin超聲處理，然后取超聲后懸濁液，進(jìn)行DNA提取純化。本發(fā)明的有益效果為以濃度為200mM的NaOH和濃度為2. 0wt%的PVP作為脫腐緩沖液脫腐能力高，減少了腐殖酸對微生物核酸提取的不利影響；超聲洗脫處理活性炭克服了飲用水生物活性炭上因生物量少且和載體顆粒結(jié)合緊密導(dǎo)致的洗脫困難；本發(fā)明克服了傳統(tǒng)直接提取DNA方法的缺陷，且操作簡單，能夠從生物活性炭上獲得高產(chǎn)量且高純度的 DNA。


圖I為實施例I中9種不同方法提取總DNA電泳圖；其中各標(biāo)號條帶分別為1-λ-Hind III digest DNA Marker, 2-4分別為NaOH+PVP混合溶液脫腐并超聲處理l、2、5min，5-7分別為NaOH溶液脫腐并超聲處理I、2、5min，8-10分別為不脫腐并超聲處理l、2、5min。 圖2為實施例2中9種不同方法提取獲得的總的DNA的PCR電泳圖；其中各標(biāo)號條帶分別為1-M100 bp DNA Ladder，2-4分別為NaOH+PVP混合溶液脫腐并超聲處理l、2、5min，5-7分別為NaOH溶液脫腐并超聲處理l、2、5min，8_10分別為不脫腐并超聲處理l、2、5min。
具體實施例方式下面將通過具體實施例和附圖對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。實施例I :比較不同脫腐緩沖液脫腐效果生物活性炭樣品取自北京市某自來水廠。脫腐緩沖液分別采用不同濃度單一組分的濃度分別為50mM、100mM、200mM的NaCl溶液，濃度分別為50mM、100mM、200mM的Tris-HCl溶液，濃度分別為50mM、IOOmM,200mM的NaOH溶液和不同濃度的NaOH+PVP混合溶液，濃度組合分別為50mM+0. 5wt%、100mM+l. 0wt%、200mM+2. 0wt%對活性炭中腐殖酸進(jìn)行去除。脫腐效果如表I所示。單一組分的脫腐緩沖液中，如NaCl溶液和Tris-HCl在脫腐處理后上清顏色沒有變化，說明二者均不具備明顯的脫腐能力，NaOH溶液濃度大于IOOmM時上清淡棕色，說明IOOmM以上的NaOH溶液表現(xiàn)出一定的脫腐效果；將不同配位劑加以組合其脫腐效果可得到提高，在本實例中組合后的脫腐緩沖液的脫腐能力大大提高，特別是經(jīng)200mM的NaOH和2. 0%的PVP的脫腐緩沖液處理后上清變?yōu)樯钭厣?，說明選擇以200mM的NaOH和2. 0%的PVP作為脫腐緩沖液可以有效去除腐殖酸。表I不同脫腐緩沖液的脫腐效果
權(quán)利要求
1.一種生物活性炭上微生物DNA提取預(yù)處理方法，其特征在于，該方法包括步驟如下 (1)生物活性炭的脫腐將生物活性炭與脫腐緩沖液按質(zhì)量/體積比I: 10混合，旋潤2min后,在50°C下反應(yīng)IOmin,再旋潤2min后,在轉(zhuǎn)速為I. 0 X IO4 rpm下離心5min;其中脫腐緩沖液為NaOH濃度為200mM、聚乙烯吡咯烷酮濃度為2. Owt%的混合溶液； (2)超聲洗脫取上述離心后的活性炭，溶于滅菌的去離子水中，旋渦2min后常溫下水浴20min，進(jìn)行Imin超聲處理，然后取超聲后懸濁液，進(jìn)行DNA提取純化。
全文摘要
本發(fā)明公開了屬于環(huán)境工程技術(shù)領(lǐng)域的一種生物活性炭上微生物DNA提取預(yù)處理方法。此方法采用濃度為200mM的NaOH和2.0wt%的聚乙烯吡咯烷酮混合溶液作為脫腐緩沖液對活性炭進(jìn)行脫腐處理，超聲波洗脫1min和然后化學(xué)裂解后提取生物活性炭上的微生物DNA。所獲總DNA長度在20Kb以上，完全滿足PCR分析的要求。解決了生物活性炭上因生物量少且和載體顆粒結(jié)合緊密導(dǎo)致的洗脫困難問題，減少了腐殖酸對微生物核酸提取的不利影響，微生物細(xì)胞充分裂解。該方法操作簡便，DNA產(chǎn)量大，純度高。
文檔編號C12N15/10GK102807979SQ201210300669
公開日2012年12月5日 申請日期2012年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月22日
發(fā)明者劉文君, 張明露, 王占朝 申請人:清華大學(xué)