專利名稱：?jiǎn)屋d體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生命科學(xué)領(lǐng)域，具體涉及到單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
基因治療是目前腫瘤治療領(lǐng)域很有希望的治療方法之一，而基因治療中對(duì)所用治療基因的準(zhǔn)確快速的調(diào)控對(duì)提高療效，減少治療基因帶來(lái)的負(fù)作用至關(guān)重要。Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，是四環(huán)素誘導(dǎo)系統(tǒng)的一種，特點(diǎn)是加入四環(huán)素或者其衍生物如強(qiáng)力霉素(Doxycycline, Dox)等誘導(dǎo)藥物后,受控基因表達(dá)開(kāi)啟。Tet_on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)是廣泛應(yīng)用的誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，具有本底低，高誘導(dǎo)倍數(shù)，高特異性，誘導(dǎo)劑無(wú)明顯毒性等優(yōu)點(diǎn)，非常適合對(duì)治療基因的調(diào)控。現(xiàn)階段，該系統(tǒng)已被應(yīng)用于諸多疾病的研究和治療中。但現(xiàn)有的Tet-on 誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)依然存在較明顯的本底滲漏和調(diào)控蛋白過(guò)量表達(dá)對(duì)細(xì)胞的干擾作用，同時(shí)以往Tet-o誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的建立需要調(diào)控載體和反應(yīng)載體兩個(gè)質(zhì)粒，如此降低了系統(tǒng)建立的效率。單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可以克服兩質(zhì)粒系統(tǒng)的缺點(diǎn)，同時(shí)具有低本底滲漏，并易于用于如腺病毒等載體，因此對(duì)于腫瘤治療至關(guān)重要。通過(guò)建立一種全部調(diào)控系統(tǒng)和目的基因都位于一個(gè)載體上，并具有低本底滲漏和高效誘導(dǎo)倍數(shù)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)各種基因，如報(bào)告基因或者抗腫瘤基因TRAIL的有效調(diào)控表達(dá)；并能應(yīng)用到如腺病毒載體等病毒載體上，使其獲得的具有更好的活力，為腫瘤基因治療提供有力的工具。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的一個(gè)技術(shù)問(wèn)題在于提供一種單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問(wèn)題在于提供一種單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法。本發(fā)明所要解決的還有一個(gè)技術(shù)問(wèn)題在于為單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)提供一種新用途。解決上述技術(shù)問(wèn)題采用的技術(shù)方案是單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)元件的連接順序?yàn)?5_’ CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE- Tight-PminCMV-EcoR I -Spe I -SV40polyA_3’，Tight-PminCMV 左側(cè)的復(fù)合兀件rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE 的連接方式為 3’ -rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE_5’ -5’ -Tight-PminCMV-3’，其余元件均按與該系統(tǒng)相同方向5’ -3’順序連接；兩個(gè)酶切位點(diǎn)EcoRI和Spe I位于元件Tight-PminCMV和元件SV40polyA之間，該系統(tǒng)序列如核苷酸序列表中 No. 11。本發(fā)明的TRE元件左側(cè)的PminCMV元件的方向與右側(cè)的Tight-PminCMV啟動(dòng)方向相反，均與TRE元件相鄰。在本發(fā)明單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的EcoR I與Spe I位點(diǎn)間連入的目的基因是報(bào)告基因或腫瘤治療基因。單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法包括下述步驟I、構(gòu)建含有Kpn I -Cla I -Not I -Xho I -EcoR I -Spe I 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的腺病毒El區(qū)穿梭載體使用酶切連接法將DNA linker (Kpn I -Cla I -Not I -Xho I -EcoR I -SpeI -Spe I )連接入腺病毒El區(qū)穿梭載體，獲得所需要的載體；2、擴(kuò)增構(gòu)建單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)所需的元件通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增構(gòu)建單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)所需的元 件，元件包括 CMV、TetR-KRAB, SV40polyA、Tight-PminCMV, rtTA2S_M2。3、構(gòu)建帶有復(fù)合元件TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2的中間載體通過(guò)酶切連接，將TRE-PminCMV 連接至 pShuttle-KSL-SV40polyA_KB，并使用Kpn I酶切后，T4 DNA聚合酶補(bǔ)平末端，再用T4 DNA連接酶進(jìn)行平末端連接，使TRE-PminCMV序列中304位的Kpn I位點(diǎn)消失，獲得TRE-KB-PminCMV元件；再將rtTA2S_M2連接到 TRE-KB-PminCMV 的 3’ 端，同樣方法使 TRE-KB-PminCMV 與 rtTA2S_M2 間的 EcoR I位點(diǎn)消失，得到帶有復(fù)合元件TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2的中間載體pShuttIe-TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2-SV40polyA。4、構(gòu)建單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)使用連接酶連接法，將元件5’ -CMV-3’，5’ -TetR-KRAB-3’先后連接到pShuttle-KSL-SV40polyA 上，5’ -SV40polyA_3’ 與 3’ -rtTA2S-M2-TRE-PminCMV_5’ 連接為5’ -SV40polyA-3’ -3’ -rtTA2S-M2-TRE-PminCMV_5’，并一起連接到元件 TetR-KRAB 的 3’端，再將 5’ -Tight-PminCMV-3 連接到 3’ -rtTA2S-M2-TRE-PminCMV_5’ 的 5’ 端，得單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在制備治療結(jié)腸癌藥物中的用途。有效成分制備El區(qū)攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并調(diào)控表達(dá)目的基因TRAIL的腺病毒載體，制備治療腫瘤藥物用常規(guī)注射劑的形式來(lái)使用。所述的藥用常規(guī)制劑含作為活性成分的制備El區(qū)攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并調(diào)控表達(dá)目的基因TRAIL的腺病毒載體，該活性成分在制劑中與藥學(xué)上可接受的載體如適宜于靜脈注射給藥的有機(jī)或無(wú)機(jī)液體賦形劑混合。單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在制備治療結(jié)腸癌藥物中的用途，制備El區(qū)攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并調(diào)控表達(dá)目的基因TRAIL的腺病毒載體，制備治療結(jié)腸癌藥物以注射液來(lái)使用，制備該藥物1000支用原料及其配比如下El區(qū)攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并調(diào)控表達(dá)目的基因TRAIL的腺病毒載體2 X IO15Vp注射用水加至2000mL制備方法按藥劑學(xué)注射劑的常規(guī)方法進(jìn)行。每支2mL，每mL含活性成分El區(qū)攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并調(diào)控表達(dá)目的基因TRAIL的腺病毒載體I X IO12Vp。
使用時(shí)每日I次注射,按瘤體積計(jì)算,瘤體<3cm3，用量為2X IO12Vp病毒即I支；3cm3<瘤體<5cm3，用量為3X 1012vp病毒即I. 5支；瘤體>5cm3，用量為4X IO12Vp病毒即2支，每次多點(diǎn)瘤內(nèi)注射。治療一個(gè)療程用藥連續(xù)5天。用藥期間同時(shí)按常規(guī)抗生素用量口服強(qiáng)力霉素。本發(fā)明改進(jìn)了 Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)，使全部調(diào)控元件和目的基因的表達(dá)均構(gòu)建在了一個(gè)載體上，克服2質(zhì)粒Tet-on系統(tǒng)的低效性，同時(shí)對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控具有嚴(yán)密性，并能應(yīng)用于如腺病毒載體等病毒載體，使基因的治療更為安全和有效。


圖I 是載體 pShuttle-KSL-SV40polyA_KB 的構(gòu)建流程。圖2是帶有復(fù)合元件TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2的中間載體的構(gòu)建流程。
圖3是單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建流程及結(jié)構(gòu)。圖4是載體pEl-Bi-Tet-on的結(jié)構(gòu)。圖5是載體pEl-r-Tet-on的結(jié)構(gòu)。圖6單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)eGFP基因表達(dá)的調(diào)控作用。圖7單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)Flu基因表達(dá)的調(diào)控作用。圖8單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的時(shí)間誘導(dǎo)曲線。圖9單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)藥物劑量依賴曲線。圖10單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的去藥物后關(guān)閉曲線。圖11單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)對(duì)FAM76B_Flag基因表達(dá)的調(diào)控作用的Western Blot檢測(cè)結(jié)果。圖12是El區(qū)帶有單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并調(diào)控表達(dá)TRAIL基因的腺病毒載體在體外對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的生長(zhǎng)抑制作用。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明不限于這些實(shí)施例。實(shí)施例I本實(shí)施例的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng),其元件的連接順序?yàn)?_’ CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR I -Spe
I -SV40polyA-3，。Tight-PminCMV 左側(cè)的復(fù)合元件 rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB_TRE 的連接方式為3’ -rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-5’ -5’ -Tight-PminCMV-3’，其余元件均按與該系統(tǒng)相同方向5’ -3’順序連接；兩個(gè)酶切位點(diǎn)EcoR I和Spe I位于元件Tight-PminCMV和元件SV40polyA之間。該系統(tǒng)序列如核苷酸序列表中No. 11。其構(gòu)建方法步驟如下I、構(gòu)建含有Kpn I -Cla I -Not I -Xho I -EcoR I -Spe I 限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的腺病毒El區(qū)穿梭載體委托生工生物上海有限公司合成兩端含有酶切位點(diǎn)Xba I與Bgl II的雙向多聚腺苷酸信號(hào)SV40polyA序列，連接在載體pUC19-SV40polyA上，經(jīng)過(guò)Xba I與Bgl II雙酶切后經(jīng)過(guò)DNA瓊脂糖電泳純化回收后獲得的SV40polyA片段與經(jīng)相同酶切的腺病毒El區(qū)穿梭載體pShuttle (購(gòu)買自addgene公司)連接。T4連接酶進(jìn)行連接,連接條件為2μ I酶切純化片段，5μ I 2ΧΤ4連接酶緩沖液，O. 5μ I pShuttle載體，O. 5μ I Τ4連接酶，2 μ I三蒸水，25°C連接I小時(shí)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5a細(xì)胞。并涂布于含有30 μ g/ml的卡那霉素的LB平板中。挑取菌落,接種到30ug/ml的卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，14-16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)Xba I與Bgl II雙酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆。獲得的載體命名為pShuttle-SV40polyA，見(jiàn)圖I。再將此載體經(jīng)過(guò)EcoR I酶切后，使用T4DNA聚合酶將粘性末端補(bǔ)平，反應(yīng)體系為20 μ I酶切產(chǎn)物，3 μ I EcoR I酶切緩沖液，Ιμ IOmM dNTP, I μ I T4DNA聚合酶，25 μ I三蒸水，37°C反應(yīng)I小時(shí)。補(bǔ)平末端的產(chǎn)物，進(jìn)行平末端連接，連接條件為1μ I補(bǔ)平末端產(chǎn)物，5 μ I 2ΧΤ4連接酶緩沖液，O. 5μ IΤ4連接酶，3. 5 μ I三蒸水，25°C連接I小時(shí)，使得位于原pShuttle上2668位上的EcoR I消失，獲得的載體稱為 pShuttle-SV40polyA-EB，見(jiàn)圖 I。將載體 pShuttle-SV40polyA_EB經(jīng) Kpn I 與 Xba I 雙酶切后，與 DNAlinker (Kpn I -Cla I -Not I -Xho I -EcoRI -Spe I -Spe I )連接，獲得的陽(yáng)性克隆稱為pShuttle-KSL_SV40polyA，見(jiàn)圖I。將載 體pShuttle-KSL-SV40polyA經(jīng)過(guò)Kpn I酶切，T4DNA聚合酶將粘性末端補(bǔ)平后，T4連接酶連接后，使載體pShuttle-KSL-SV40polyA上的Kpn I位點(diǎn)消失，獲得的陽(yáng)性克隆稱為pShuttle-KSL-SV40polyA-KB，見(jiàn)圖 I。2、擴(kuò)增構(gòu)建單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)所需的元件peGFPNl載體購(gòu)自CL0NTECH公司，peGFPNl為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)模板，經(jīng)過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得增人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子CMV的序列，并在5’端引入Kpn I位點(diǎn)，3’端引入Cla I位點(diǎn)，PI-P2 為一對(duì)引物 PI: GGTACCAATAGTTATTAATAGTAA，P2: ATCGATGATCTGACGGTTCACTAA。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件是94°C、2分鐘，94°C、50秒，55 °C、60秒，72 °C、60秒，30個(gè)循環(huán)。重疊聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量濃度為1.0%的瓊脂糖電泳后回收片段。將聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)片段與pGEMT easy載體連接。連接條件是2 μ I酶切純化片段，5 μ I 2ΧΤ4連接酶緩沖液，O. 5μ1 pGEMT easy載體，O. 5μ I Τ4連接酶，2 μ I三蒸水，25°C連接I小時(shí)，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)的DH5 α細(xì)胞，并涂布于含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB平板中。挑取菌落接種到含有100 μ g/ml的氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液中，14 16小時(shí)后，經(jīng)堿性裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過(guò)酶切及測(cè)序鑒定陽(yáng)性克隆。將所獲得陽(yáng)性克隆命名為pGEMT/CMV。載體pLVCT-tTR-KRAB購(gòu)買自addgene公司，以pLVCT-tTR-KRAB為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)模板，經(jīng)過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得四環(huán)素轉(zhuǎn)錄沉默因子TetR-KRAB序列，并在5’端引入Cla I 位點(diǎn)，3 ’ 端引入 Not I 位點(diǎn) P3-P4 為一對(duì)引物 P3 AATCGATATGGCTAGATTAGATAAA,P4: TGCGGCCGCTTAAACTGATGATTTGAT。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件是94 °C、2 分鐘，94 °C、50秒，55 0C >60秒，72 0C >70秒，30個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物如前所述，回收后與pGEMT easy載體連接，獲得的陽(yáng)性克隆稱為pGEMT/TetR-KRAB。以步驟I中所述的pUC19-SV40polyA為模板，同樣聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增獲得SV40polyA元件，并在5’端引入Not I位點(diǎn)，3’端引入Xba I位點(diǎn)，P5-P6為一對(duì)擴(kuò)增引物，P5: GCGGCCGCCACAGCGGGGAGATCCAG, P6: CTCTAGACTCATGGCTGCGCCCCGA,聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件是94°C、2分鐘，94°C、50秒，55 °C、60秒，72 °C、30秒，30個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物如前所述，回收后與pGEMT easy載體連接，獲得的陽(yáng)性克隆稱為pGEMT/SV40polyA。
使用合成引物P7-P8為模板和引物，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增嚴(yán)謹(jǐn)型最小人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子Tight-PminCMV序列，并在5’端引入Sal I位點(diǎn)，3’端引入EcoR I位點(diǎn)，P7 :GGTCGACTAGGCGTGTACGGTGGGAGGCCTATATAAGCAGAGCTCGT, P8:GGAATTCGCGATCTGACGGTTCACTAAACGAGCTCTGCTTATATAGG。合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件是94°C、2分鐘，94°C、50秒，55°C >60秒，72 0C >20秒，30個(gè)循環(huán)，產(chǎn)物經(jīng)過(guò)瓊脂糖電泳回收后與pGEMT easy載體連接，獲得的陽(yáng)性克隆稱為 pGEMT/Tight-PminCMV。載體pTet-on advanced,購(gòu)自 CL0NTECH 公司，以 pTet-on advanced 為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)模板，經(jīng)過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)獲得反式四環(huán)素轉(zhuǎn)錄激活因子rtTA2S-M2序列，并在5’端引入EcoR I位點(diǎn)，3’端引入Spe I位點(diǎn)，P9-P10為一對(duì)擴(kuò)增引物P9 :GGAATTCATGTCTAGACTGGACAAG, PlO GACTAGTTTACCCGGGGAGCATGTC0 合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增條件是94 °C、2分鐘，94°C、50秒，55 °C、60秒，72 °C、60秒，30個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物如前所述，回收后與pGEMT easy載體連接，獲得的陽(yáng)性克隆稱為pGEMT/rtTA2S_M2。3、構(gòu)建帶有復(fù)合元件TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2的中間載體 載體pTRE2pur載體購(gòu)自CL0NTECH公司，經(jīng)Xho I與EcoR I雙酶切后，經(jīng)反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I. 0%的瓊脂糖電泳后回收帶有四環(huán)素反應(yīng)元件TRE的最小人巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子TRE-PminCMV片段，與經(jīng)相同酶切的載體pShuttle-KSL-SV40polyA-KB (步驟I中所述)進(jìn)行連接，連接條件是2μ I酶切純化的TRE-PminCMV片段，5 μ I 2ΧΤ4連接酶緩沖液，O. 5 μ I pShutt I e-KSL-SV40po I yA-KB 載體，O. 5 μ I Τ4 連接酶，2 μ I 三蒸水，25°C連接I小時(shí)，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)的DH5a細(xì)胞，挑取克隆，經(jīng)過(guò)Xho I與EcoR I雙酶切鑒定后所獲得的陽(yáng)性克隆稱為pShuttle-TRE-PminCMV-SV40polyA，見(jiàn)圖2。將pShuttle-TRE-PminCMV-SV40polyA 經(jīng)過(guò) Kpn I 酶切，T4DNA 聚合酶將粘性末端補(bǔ)平，T4DNA連接酶連接后，使TRE-PminCMV片段中的Kpn I位點(diǎn)消失，轉(zhuǎn)化并酶切鑒定后獲得的陽(yáng)性克隆稱為 pShuttle-TRE-KB-PminCMV-SV40polyA，見(jiàn)圖 2。將載體 pGEMT/rtTA2S_M2 經(jīng) EcoR I與Spe I雙酶切后，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I. 0%的瓊脂糖電泳后回收得到片段rtTA2S-M2，將其與經(jīng)相同酶切的載體pShuttle-TRE-KB-PminCMV-SV40polyA連接，獲得的陽(yáng)性克隆稱為pShuttle-TRE-KB-PminCMV-rtTA2S-M2-SV40polyA，見(jiàn)圖 2。將此載體再經(jīng)過(guò) EcoR I 酶切，補(bǔ)平末端，連接后，使TRE-KB-PminCMV-rtTA2S-M2之間的EcoR I位點(diǎn)消失，獲得的陽(yáng)性克隆稱為 pShuttle-TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2-SV40polyA，見(jiàn)圖 2。此載體即為構(gòu)建過(guò)程中需要的中間載體，其上包含復(fù)合元件TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2。4、構(gòu)建單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)將載體pGEMT/CMV經(jīng)過(guò)Kpn I與Cla I雙酶切，并經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I. 0%的瓊脂糖電泳后回收得到的CMV片段與經(jīng)相同酶切的載體pShuttle-KSL-SV40pOlyA進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化并酶切鑒定獲得的陽(yáng)性克隆稱為pShuttle-CMV-SV40polyA。將載體pGEMT/TetR-KRAB經(jīng)Cla I與Not I雙酶切并經(jīng)I. 0%的瓊脂糖電泳后回收得到的TetR-KRAB片段與經(jīng)相同酶切后的載體pShuttle-CMV-SV40polyA進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化并酶切鑒定，獲得的陽(yáng)性克隆稱為 pShuttle-CMV-TetR-KRAB-SV40polyA。載體 pGEMT/SV40polyA 經(jīng) Not I 與 Xba I 雙酶切，并經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I. 0%的瓊脂糖電泳后回收得到SV40polyA片段，步驟2中獲得的中間載體 pShuttle-TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2-SV40polyA 經(jīng) Spe I 與 Xho I 雙酶切，并經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為I. 0%的瓊脂糖電泳后回收得到組合元件片段5’ -TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2-3’，載體 Shuttle-CMV-TetR-KRAB-SV40polyA 經(jīng) Not I 與 Xho I 雙酶切后，同時(shí)與片段SV40polyA和片段TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S_M2進(jìn)行連接，連接條件是'2 μ I片段SV40polyA,2y I 片段 TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S_M2，5 μ I 2ΧΤ4 連接酶緩沖液，O. 5 μ IpShuttle-CMV-TetR-KRAB-SV40polyA 載體，O. 5μ I Τ4 連接酶，25°C連接 I 小時(shí)。經(jīng)轉(zhuǎn)化，酶切鑒定后獲得的陽(yáng)性克隆稱為 pShuttle-CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-SV40polyA，此載體中復(fù)合元件 5’ -TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2_3’ 的連接方式為其3’端與CMV-TetR-KRAB-SV40polyA的3 ’端相連，而5’端位于載體上Xho I位點(diǎn)。載體pGEMT/Tight-PminCMV經(jīng)Sal I與EcoR I雙酶切后，經(jīng)2. 0%的瓊脂糖電泳后回收得到片段Tight-PminCMV，將其與經(jīng)Xho I與EcoR I酶切后的載體pShuttle_CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-SV40polyA 進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化并酶切鑒定，獲得的陽(yáng)性克隆為 pShuttle-CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-SV40polyA,并將其命名為 pEl-K-Bi-Tet-on，見(jiàn)圖 3，此載體上的 5_’ CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoRI -Spe I -SV40polyA-3’結(jié)構(gòu)即為單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，載體上的EcoR I -Spe I位點(diǎn)間可以插入目的基因或者DNA linker。本實(shí)施例中所構(gòu)建的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)具有雙向啟動(dòng)結(jié)構(gòu)，TRE右側(cè)的Tight-PminCMV啟動(dòng)目的基因的表達(dá)，而TRE左側(cè)的PminCMV則表達(dá)轉(zhuǎn)錄激活因子rtTA2S_M2，而轉(zhuǎn)錄激活因子rtTA2S-M2可以結(jié)合TRE序列，同時(shí)激活TRE兩側(cè)的基因表達(dá)，故rtTA2S_M2在自身啟動(dòng)子調(diào)控下，形成了自我激活的結(jié)構(gòu)。而此結(jié)構(gòu)在于當(dāng)誘導(dǎo)藥物不存在時(shí)，轉(zhuǎn)錄激活因子自身的表達(dá)彳艮少，除能降低目的基因非誘導(dǎo)時(shí)的本底滲漏外，也可以減少rtTA2S-M2對(duì)細(xì)胞的干擾。并且此系統(tǒng)也引入了轉(zhuǎn)錄沉默因子TetR-KRAB，此基因的產(chǎn)物蛋白，會(huì)結(jié)合TRE序列，抑制TRE兩側(cè)的基因表達(dá)，降低本底滲漏，而當(dāng)加入誘導(dǎo)藥物強(qiáng)力霉素后，TetR-KRAB會(huì)脫離TRE序列，解除轉(zhuǎn)錄抑制作用，而與此同時(shí)激活因子rtTA2S-M2會(huì)在藥物作用下改變構(gòu)相，并結(jié)合到TRE序列上，激活自身和目的基因的表達(dá)。且此系統(tǒng)結(jié)構(gòu)中TRE序列位于系統(tǒng)中部，故消除了 TetR-KRAB具有的對(duì)TRE上下游2KB左右的轉(zhuǎn)錄抑制作用，故此系統(tǒng)應(yīng)用到如腺病毒等病毒載體上時(shí)，不會(huì)影響到病毒基因組基因的轉(zhuǎn)錄，從而減少對(duì)腺病毒包裝的影響。同時(shí)構(gòu)建了載體 pShuttle-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-SV40polyA,并命名為pEl-Bi-Tet-on，見(jiàn)圖4，其構(gòu)建方法與構(gòu)建載體pEl-K-Bi-Tet-on類似，只是不連入CMV和TetR-KRAB這兩個(gè)元件，其后的SV40polyA，TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2 和 Tight-PminCMV 均按上述酶切位點(diǎn)連入載體pShuttle-KSL-SV40polyA 中。另外，作為對(duì)照構(gòu)建了 pEl-CMV-rtTA2S-M2-SV40polyA_TRE-Tight-PminCMV，另稱為pEl-r-Tet-on，見(jiàn)圖5，其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為非雙向啟動(dòng)，rtTA2S_M2由CMV啟動(dòng)子啟動(dòng)，目的基因由TRE-PminCMV啟動(dòng)。實(shí)施例2本實(shí)施例的表達(dá)eGFP基因的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，元件的連接順序?yàn)?5-’CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR I -eGFP-Spe I -SV40polyA_3’，兩個(gè)酶切位點(diǎn)EcoR I和Spe I中插入了報(bào)告基因eGFP。
其構(gòu)建方法步驟如下該實(shí)施例1-4步驟與實(shí)施例I完全相同。5、構(gòu)建表達(dá)eGFP基因的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)以載體pLVCT-tTR-KRAB為模板，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增eGFP基因，并在5’端引入EcoR I位點(diǎn)，3’端引入Spe I位點(diǎn)。P11-P12為一對(duì)擴(kuò)增引物，Pll: CGAATTCATGGTGAGCAAGGGCGAG, P12: CACTAGTTTACTTGTACAGCTCGTC。產(chǎn)物回收后與 pGEMTeasy載體連接，獲得的陽(yáng)性克隆稱為pGEMT/eGFP。使用EcoR I與Spe I雙酶切后，回收純化獲得片段，與經(jīng)相同酶切的載體pEl-K-Bi-Tet-on進(jìn)行連接，獲得的陽(yáng)性克隆稱為pEl-K-Bi-Tet-on-eGFP,此載體上的 5_’ CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR I -eGFP-Spe I -SV40polyA_3’ 結(jié)構(gòu)即為表達(dá) eGFP基因的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。另外為作為對(duì)照，將eGFP片段連接入經(jīng)EcoR I與Xba I雙酶切的載體pcDNA3. I中，獲得的載體稱為pcDNA3. I/eGFP,連入 pEl-r-Tet-on中獲得的載體稱為pEl-r-Tet-on-eGFP,連入pEl-Bi-Tet-on中，獲得的載體稱為 pEl-Bi-Tet-on-eGFP。6、測(cè)試表達(dá)eGFP基因的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)性能將本實(shí)施例構(gòu)建的pEl-K-Bi-Tet-on-eGFP、pEl-Bi-Tet-on-eGFP、pEl-r-Tet-on-eGFP, pcDNA3. 1/eGFP、pcDNA3. I 載體轉(zhuǎn)染入 HEK293 細(xì)胞。4 小時(shí)后換含有10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。每種質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩盤細(xì)胞，并于其中一盤細(xì)胞中加入強(qiáng)力霉素，使其終濃度為2 μ g/ml，48小時(shí)后觀察各個(gè)載體的表達(dá)強(qiáng)度和本底滲漏情況。使用倒置熒光顯微鏡照相，觀察各組載體的誘導(dǎo)和非誘導(dǎo)狀態(tài)下eGFP的表達(dá)情況，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖6，由圖6可見(jiàn)，5為空載體pcDNA3. I組，此組為陰性對(duì)照組，無(wú)論是否加入誘導(dǎo)劑強(qiáng)力霉素均無(wú)綠色熒光信號(hào)；4為pcDNA3. Ι/eGFP組，此組為陽(yáng)性對(duì)照組，無(wú)論是否加入強(qiáng)力霉素均有綠色熒光信號(hào)；3為pEl-r-Tet-on-eGFP，此單向啟動(dòng)結(jié)構(gòu)的Tet-on系統(tǒng)在不加強(qiáng)力霉素時(shí)可見(jiàn)少許綠色突光 目號(hào)，提不存在本底滲漏；2為pEl-Bi-Tet-on-eGFP組,本組具有雙向啟動(dòng)結(jié)構(gòu)，本底滲漏明顯少于pEl-r-Tet-on-eGFP組；I為pEl-K-Bi-Tet-on-eGFP組，即單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)組，本組只有加入了強(qiáng)力霉素后，才出現(xiàn)綠色熒光信號(hào)，說(shuō)明本系統(tǒng)具有低的本底滲漏，而加入強(qiáng)力霉素其綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度與陽(yáng)性對(duì)照基本一致，說(shuō)明本系統(tǒng)的誘導(dǎo)強(qiáng)度足夠。實(shí)施例3本實(shí)施例的表達(dá)螢火蟲(chóng)螢光素酶基因(firefly luciferase, Flu)的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，元件的連接順序?yàn)?-’CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR I -Flu-Spe I -SV40polyA_3’，兩個(gè)酶切位點(diǎn)EcoR I和Spe I中插入了報(bào)告基因Flu。其構(gòu)建方法步驟如下該實(shí)施例1-4步驟與實(shí)施例I完全相同。5、構(gòu)建表達(dá)Flu基因的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)載體Luciferase_pcDNA3 購(gòu)自 addgene 公司，以載體 Luciferase_pcDNA3 為模板，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增Flu基因，并在5’端引入EcoR I位點(diǎn)，3’端引入Spe I位點(diǎn)。P13-P14為一對(duì)擴(kuò)增引物，P13: CGAATTCATGGAAGACGCCAAAAAC，P14: CACTAGTTTACACGGCGATCTTTCC。產(chǎn)物如前所述，回收后與PGEMT easy載體連接，獲得的陽(yáng)性克隆稱為pGEMT/Flu。使用EcoRI與Spe I雙酶切后，回收純化獲得片段，與經(jīng)相同酶切的載體pEl-K-Bi-Tet-on進(jìn)行連接，獲得的陽(yáng)性克隆稱為pEl-K-Bi-Tet-on-Flu。此載體上的5-’CMV-TetR-KRAB_SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR I -Flu-Spe I -SV40polyA_3’結(jié)構(gòu)即為表達(dá)Flu基因的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。另外為作為對(duì)照，將Flu片段連接入經(jīng)EcoR I與Xba I雙酶切的載體pcDNA3. I中，獲得的載體稱為pcDNA3. I/Flu。6、測(cè)試表達(dá)Flu基因的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的誘導(dǎo)性能接種HEK293細(xì)胞到24孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，使用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，分別取等摩爾數(shù)的pEl-K-Bi-Tet-on-Flu，陰性對(duì)照pcDNA3. I以及陽(yáng)性對(duì)照pcDNA3. Ι/Flu質(zhì)粒與海腎螢光素酶內(nèi)參質(zhì)粒pRL_CMV (購(gòu)自Promega公司)(O. 4 μ g)共轉(zhuǎn)染入HEK293細(xì)胞,每個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染兩組細(xì)胞，每組3個(gè)重 復(fù)，轉(zhuǎn)染4小時(shí)后更換新的培養(yǎng)基，并于其中一組細(xì)胞中加入強(qiáng)力霉素，使其終濃度為2 μ g/ml ο 48小時(shí)后收集細(xì)胞,使用雙螢光素酶測(cè)定試劑盒Dual-Luciferase Reporter AssaySystem(購(gòu)自Promega公司)提供的方法裂解細(xì)胞，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)螢光素酶活力測(cè)定。測(cè)定方法如下(I)將24孔板中的細(xì)胞培養(yǎng)基吸掉，每孔加入試劑盒中提供的IXlysis Buffer200mL，搖床IOOrpm下裂解10分鐘。(2)收集每空裂解產(chǎn)物入Eppendorf管中，4°C下16000g離心10分鐘，收集上清入新的預(yù)冷的Eppendorf管中。(3)使用白色96孔板，每孔加入裂解液20 μ L,每孔加入螢火蟲(chóng)熒光素酶底物50 μ L，進(jìn)行第一次螢光素酶活力測(cè)定。(4)每孔加入lXStop&Glo反應(yīng)液,終止螢火蟲(chóng)螢光素酶活力，并提供海腎螢光素酶反應(yīng)底物，進(jìn)行第二次螢光素酶活力測(cè)定。(5)得出標(biāo)準(zhǔn)突光素酶活力=螢火蟲(chóng)突光素酶活力值(relative light unit,RLU)/海腎螢光素酶活力值(RLU)。通過(guò)對(duì)比3種載體誘導(dǎo)前后的標(biāo)準(zhǔn)熒光素酶活力值，來(lái)定量反映攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的載體pEl-K-Bi-Tet-on的誘導(dǎo)強(qiáng)度，本底滲漏程度，誘導(dǎo)倍數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖7，圖中6為pEl-K-Bi-Tet-on-Flu組，此組表現(xiàn)出明顯的誘導(dǎo)差異，及高的誘導(dǎo)倍數(shù)(137倍)，而本底滲漏很小，未誘導(dǎo)時(shí)，表達(dá)量接近陰性對(duì)照水平，7為陽(yáng)性對(duì)照，8為陰性對(duì)照組，此兩組均無(wú)明顯的誘導(dǎo)差異。說(shuō)明pEl-K-Bi-Tet-on載體具有良好的誘導(dǎo)能力。7、測(cè)定表達(dá)Flu基因的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)時(shí)間誘導(dǎo)曲線接種CH0-K1細(xì)胞到24孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，使用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒分轉(zhuǎn)染細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)共分12組，每組3個(gè)平行樣，將載體pEl-K-Bi-Tet-on-Flu與pRL_CMV共轉(zhuǎn)染入細(xì)胞，4小時(shí)后更換含有10%新生牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)；在每孔細(xì)胞中加入強(qiáng)力霉素，使其終濃度為2 μ g/ml，每4小時(shí)收集一組細(xì)胞測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)熒光素酶活力值，將數(shù)值繪制成關(guān)于時(shí)間的曲線圖，從而得到表達(dá)Flu基因的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的時(shí)間誘導(dǎo)曲線，見(jiàn)圖8。結(jié)果可以看出40小時(shí)后系統(tǒng)的誘導(dǎo)強(qiáng)度達(dá)到最大，證明該系統(tǒng)誘導(dǎo)速度較快。8、測(cè)定表達(dá)Flu基因的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的藥物劑量依賴曲線接種CHO-Kl細(xì)胞到24孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，使用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒分轉(zhuǎn)染細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)共分6組每組兩個(gè)平行樣，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEl-K-Bi-Tet-on-Flu與pRL-CMV入HEK293細(xì)胞，4小時(shí)后更換含有10%新生牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)；每組分別加入強(qiáng)力霉素，使終濃度分別為10ng/ml，100ng/ml, 1000ng/ml,2000ng/ml,4000ng/ml,8000ng/ml,48小時(shí)后收集細(xì)胞，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)熒光素酶活力值，而得到表達(dá)Flu基因的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的藥物劑量曲線，見(jiàn)圖9。由圖可以確定，該系統(tǒng)在2 μ g/ml的強(qiáng)力霉素濃度下有最大誘導(dǎo)強(qiáng)度。9、測(cè)定表達(dá)Flu基因的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)去除誘導(dǎo)劑后關(guān)閉曲線
接種CH0-K1細(xì)胞到24孔板，待細(xì)胞密度達(dá)到70%時(shí)，使用Lipofectamine 2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑盒分轉(zhuǎn)染細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)共分6組每組三個(gè)平行樣，均轉(zhuǎn)染pEl-K-Bi-Tet-on-Flu與pRL_CMV入HEK293細(xì)胞，4小時(shí)后更換含有10%新生牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)；每組均加入強(qiáng)力霉素，使終濃度為2000ng/ml，72小時(shí)后更換含有10%新生牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)，并不再添加強(qiáng)力霉素，每天收集一組樣品，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)熒光素酶活力值，從而得到表達(dá)Flu基因的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的去藥后關(guān)閉曲線，結(jié)果見(jiàn)圖10。圖中可以看到去除誘導(dǎo)藥物后，誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)24小時(shí)后表達(dá)量就下降為最高表達(dá)量的10%以下，證明單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)具有快速關(guān)閉的特性。實(shí)施例4本實(shí)施例的表達(dá)融合蛋白FAM76B_Flag的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，元件的連接順序?yàn)?5_’ CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR I -Xho I -FAM76B-Flag-SV40polyA_3’，兩個(gè)酶切位點(diǎn) EcoR I 和Spe I 中先后插入了 DNA linker (EcoR I -Xho I -Spe I )和報(bào)告基因 FAM76B_Flag。其構(gòu)建方法步驟如下該實(shí)施例1-4步驟與實(shí)施例I完全相同。5、構(gòu)建表達(dá)融合蛋白FAM76B_Flag的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)以人cDNA文庫(kù)為模板，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增FAM76B_Flag融合蛋白基因，并在5’端引入經(jīng)Xho I位點(diǎn)，3’端引入Xba I位點(diǎn)。引物P15-P16為一對(duì)擴(kuò)增引物，P15 :CTCGAGATGGCGGCCTCGGCCCTG，P16 TCTAGATTATTTGTCATCGTCATCTTTGTAATCAGGAGATGTTAGTATGCT?；蜻B接到pGEMT easy載體上獲得的陽(yáng)性克隆稱為pGEMT/FAM76B-Flag，經(jīng)Xho I與Xba I雙酶切后純化回收獲得片段FAM76B-Flag。兩條合成的DNA單鏈，LI: AATTCCTCGAGA，L2:CTAGTCTCGAGG，兩條單鏈稀釋成20μΜ濃度，各取20 μ I混合，室溫退火兩個(gè)小時(shí)，則形成 DNA linker (EcoR I -Xho I -Spe I )。載體 pEl-K-Bi-Tet-on 經(jīng) EcoR I 與Spe I雙酶切后與DNA IinkeHEcoR I -Xho I -Spe I )連接，獲得的陽(yáng)性克隆稱為pEl-K-Bi-Tet-on-ESLo 載體 pEl-K-Bi-Tet-on-ESL 經(jīng)過(guò) Xho I 與 Spe I 雙酶切獲得載體，與片段FAM76B-Flag連接轉(zhuǎn)化后獲得陽(yáng)性克隆，命名為pEl-K-Bi-Tet-on-FAM76B_Flag，此載體上的 5-’CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR I -Xho I -FAM76B-Flag-SV40polyA-3’的結(jié)構(gòu)即為表達(dá) FAM76B-Flag 基因的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。將片段FAM76B-Flag連接入經(jīng)Xho I與Xba I雙酶切的載體pcDNA3. I中，獲得的載體稱為pcDNA3. l/FAM76B_Flag。6、測(cè)定表達(dá)融合蛋白FAM76B_Flag的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的本底滲漏情況培養(yǎng)HEK293細(xì)胞于4 個(gè)60mm平板中，待細(xì)胞覆蓋率達(dá)到50%時(shí)，使用磷酸鈣法分別轉(zhuǎn)染在實(shí)施例3步驟5中獲得的質(zhì)粒pEl-K-Bi-Tet-on-FAM76B-Flag、陽(yáng)性對(duì)照質(zhì)粒pcDNA3. 1/FAM76B-Flag以及陰性對(duì)照pcDNA3. I入HEK293細(xì)胞；每組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染2盤。置3 7 °C細(xì)胞培養(yǎng)箱中，4小時(shí)后換含有IO %新生牛血清的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)；并于每組其中一盤細(xì)胞中加入強(qiáng)力霉素，使其終濃度為2 μ g/ml ο 48小時(shí)后收獲細(xì)胞,裂解并收獲蛋白，之后將6種蛋白各取適量體積的樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE電泳。半干法從凝膠中電轉(zhuǎn)移蛋白樣至PVDF膜上。一抗為小鼠抗Flag標(biāo)簽單克隆抗體，二抗為稀釋辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG, ECL發(fā)光檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖11,圖中
9、10為陰性對(duì)照pcDNA3. I組，11、12為攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)載體pEI-K-Bi-Tet-on-FAM76B-Flag 組，13、14 為陽(yáng)性對(duì)照 pcDNA3. l/FAM76B_Flag 組，結(jié)果可以看出，在加入強(qiáng)力霉素時(shí)可以誘導(dǎo)表達(dá)載體pEl-K-Bi-Tet-on-FAM76B-Flag可以檢測(cè)到FAM76B-Flag的表達(dá)，強(qiáng)度與陽(yáng)性對(duì)照組一致，不加入強(qiáng)力霉素時(shí)檢測(cè)不到FAM76B_Flag的表達(dá)，與陰性對(duì)照一致。Western Blot檢測(cè)不到本底滲漏，果證明了該系統(tǒng)在非誘導(dǎo)時(shí)具有嚴(yán)密性。實(shí)施例5本實(shí)施例的表達(dá)TRAIL的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，元件的連接順序?yàn)?5-，CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoRI -Xho I -TRAIL-Spe I -SV40polyA_3’，兩個(gè)酶切位點(diǎn) EcoR I 和 Spe I 之間先后插入DNAlinkerCEcoR I -Xho I -Spe I )和治療基因TRAIL，并將表達(dá)TRAIL的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)重組到腺病毒骨架載體上，獲得帶有單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并調(diào)控表達(dá)治療基因TRAIL的重組腺病毒。步驟1-4同實(shí)施例I。5、構(gòu)建表達(dá)治療基因TRAIL的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)以人cDNA文庫(kù)為模板，通過(guò)設(shè)計(jì)引物聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增人Trail基因胞外段，即氨基酸序列114-281，P17-P18為一對(duì)擴(kuò)增引物，P17 ACTCGAGATGGTGAGAGAAAGAGGTCCTCAG, P18 :ATCTAGATTAGCCAACTAAAAAGGCC。產(chǎn)物經(jīng) 1% 瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，將此片段亞克隆到pGEMT easy載體中，經(jīng)過(guò)酶切及測(cè)序鑒定后，將陽(yáng)性克隆經(jīng)Xho I和Xba I酶切消化后并純化回收后獲得的TRAIL基因片段與經(jīng)Xho I和Spe I酶切的載體pEl-K-Bi-Tet-on-ESL (實(shí)施例4，步驟5中獲得)進(jìn)行連接，連接條件是4 μ I酶切純化片段，5μ I 2ΧΤ4連接酶緩沖液，O. 5μ I酶切載體，O. 5μ IΤ4連接酶，25° C連接I小時(shí)。隨后經(jīng)過(guò)轉(zhuǎn)化、提取質(zhì)粒DNA、酶切鑒定獲得陽(yáng)性克隆就是攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL的腺病毒El區(qū)穿梭載體，命名為pEl-K-Bi-Tet-on-Trail。同法將TRAIL基因片段與經(jīng)Xho I和Spe I酶切的載體pShuttle-CMV-SV40polyA (實(shí)施例1，步驟4中獲得)進(jìn)行連接，獲得的陽(yáng)性克隆稱為pEl-CMV-TRAIL，此載體為非誘導(dǎo)表達(dá)TRAIL基因的腺病毒El區(qū)穿梭載體。另外將EcoR I與Xba I酶切獲得的eGFP基因片段與經(jīng)EcoR I與Spe I雙酶切的載體pShuttle-CMV-SV40polyA進(jìn)行連接，獲得的陽(yáng)性克隆稱為pEl-CMV_eGFP，此載體為表達(dá)eGFP的腺病毒El區(qū)穿梭載體。6、構(gòu)建El區(qū)攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并調(diào)控表達(dá)目的基因TRAIL的腺病毒載體采用磷酸I丐法將Pac I線性化的攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)調(diào)控表達(dá)目的基因TRAIL的El區(qū)穿梭載體pEl-K-Bi-Tet-on-Trail與經(jīng)Pac I線性化的腺病毒骨架PAdEasy-I (購(gòu)自addgene公司)按摩爾比3:1共轉(zhuǎn)染HEK 293細(xì)胞系。經(jīng)過(guò)7 10天后,可見(jiàn)明顯的細(xì)胞病變(cytopathic effect, CPE),然后經(jīng)過(guò)離心收獲病毒原液,經(jīng)過(guò)2 3輪的病毒擴(kuò)增后，進(jìn)一步將所獲得的病毒原液感染10個(gè)150cm的細(xì)胞培養(yǎng)平皿，從而擴(kuò)增獲得足夠量的病毒原液用于后續(xù)的進(jìn)一步純化。感染的病毒的細(xì)胞經(jīng)過(guò)反復(fù)凍融3次(37° C水浴鍋和酒精干冰中返去切換)后經(jīng)3500rpm離心15分鐘，通過(guò)兩次氯化銫密度梯度超速離心獲得純化的El區(qū)攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并調(diào)控表達(dá) 目的基因TRAIL的腺病毒載體，命名為Ad-K-Bi-Tet-on-Trail。同法將pEl-CMV-TRAIL和pEl-CMV-eGFP分別與pAdEasy-Ι重組包裝獲得的病毒稱為Ad-CMV-TRAIL和Ad-CMV_eGFP。用微量分光光度計(jì)(Nanodrop),測(cè)樣品260nm吸光值，再根據(jù)公式病毒滴度(vp/mL)=A260nmX I. I X IO120 24孔板培養(yǎng)HEK293至每孔細(xì)胞數(shù)約2 X IO4個(gè)，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%DMEM培養(yǎng)基將病毒液稀釋成7個(gè)濃度(10' 10_4、10_5、10_6、10' 10_8、10_9)，每個(gè)濃度重復(fù)3個(gè)，每孔加入病毒稀釋液400 μ L。另留不加病毒液的孔作為陰性對(duì)照。37°C下，培養(yǎng)箱培養(yǎng)5-7天，每天觀察細(xì)胞，記數(shù)每孔出現(xiàn)CPE的個(gè)數(shù)。在病毒液稀釋梯度為1X10—9條件下，計(jì)算病毒活力(IU/mL)=CPE個(gè)數(shù)X2.5X109。計(jì)算病毒的滴度/活力。在同一次測(cè)試中，病毒Ad-K-Bi-Tet-on-Trail的滴度/活力值為76vp/IU，而病毒Ad-CMV-TRAIL的滴度/活力值為220vp/IU?？梢钥闯觯诓《据d體上的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)可有效調(diào)控TRAIL基因表達(dá)，減少包裝過(guò)程中因TRAIL基因的細(xì)胞毒性而造成的病毒活力下降。實(shí)施例6單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在制備治療結(jié)腸癌藥物中的用途，制備El區(qū)攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并調(diào)控表達(dá)目的基因TRAIL的腺病毒載體，制備治療結(jié)腸癌藥物以注射液來(lái)使用，制備該藥物1000支用原料及其配比如下El區(qū)攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并調(diào)控表達(dá)目的基因TRAIL的腺病毒載體2 X IO15Vp注射用水加至2000mL制備方法按藥劑學(xué)注射劑的常規(guī)方法進(jìn)行。每支2mL，每mL含活性成分El區(qū)攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并調(diào)控表達(dá)目的基因TRAIL的腺病毒載體I X IO12Vp。使用時(shí)每日I次注射,按瘤體積計(jì)算,瘤體<3cm3，用量為2X IO12Vp病毒即I支；3cm3<瘤體<5cm3，用量為3X 1012vp病毒即I. 5支；瘤體>5cm3，用量為4X IO12Vp病毒即2支，每次多點(diǎn)瘤內(nèi)注射。治療一個(gè)療程用藥連續(xù)5天。用藥期間同時(shí)按常規(guī)抗生素用量口服強(qiáng)力霉素。
為了驗(yàn)證本發(fā)明應(yīng)用于腺病毒載體，作為治療結(jié)腸癌藥物的有益效果，發(fā)明人采用本發(fā)明實(shí)施例5中El區(qū)攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并調(diào)控表達(dá)目的基因 TRAIL 的腺病毒載體 Ad-K-Bi-Tet-on-Trail (以下 Ad-K-Bi-Tet-on-Trail)，來(lái)進(jìn)行體外結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)情況如下取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480，O. 1%胰酶消化后接種于96孔板，每孔細(xì)胞數(shù)為2X104，每孔中分別加入5X106vp的腺病毒Ad-CMV-eGFP (陰性對(duì)照)，腺病毒Ad-CMV-TRAIL (陽(yáng)性對(duì)照)，腺病毒Ad-K-Bi-Tet-on-Trail，以及PBS (空白對(duì)照)。此4組中，每組都分為兩小組，其中一小組中，要加入終濃度為2μ g/ml的強(qiáng)力霉素，72小時(shí)后使用MTT法測(cè)定570nm處吸光值，反映各組腺病毒對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞SW480的生長(zhǎng)抑制作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖12。圖12中15為PBS組，16為Ad-CMV-eGFP組，17為Ad-CMV-TRAIL組，18為Ad-K-Bi-Tet-on-Trail組，結(jié)果顯不Ad-K-Bi-Tet-on-Trail即El區(qū)攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并調(diào)控表達(dá)目的基因TRAIL的腺病毒載體，在不加入強(qiáng)力霉素的情況下，與空白對(duì)照和陰性對(duì)照組基本一致，沒(méi)有細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用，而加入強(qiáng)力霉素后，表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)抑制作用，與陽(yáng)性對(duì)照組接近。說(shuō)明該單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá) 系統(tǒng)能成功應(yīng)用于腺病毒載體，并能調(diào)控抗腫瘤基因TRAIL的表達(dá)。核苷酸或氨基酸序列表〈110〉陜西師范大學(xué)<120>單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)及其構(gòu)建方法和應(yīng)用<160>13<210>1<211>420<212>DNA〈213〉人工合成〈220〉<221>PolyA_signal<400>1tctagacaca gcggggagat ccagacatga taagatacat tgatgagttt ggacaaacca 60caactagaat gcagtgaaaa aaatgcttta tttgtgaaat ttgtgatgct attgctttat 120ttgtaaccat tataagctgc aataaacaag ttaacaacaa caattgcatt cattttatgt 180ttcaggttca gggggaggtg tgggaggttt tttaaagcaa gtaaaacctc tacaaatgtg 240gtatggctga ttatgatccg gctgcctcgc gcgtttcggt gatgacggtg aaaacctctg 300acacatgcag ctcccggaga cggtcacagc ttgtctgtaa gcggatgccg ggagcagaca 360agcccgtcag ggcgcgtcag cgggtgttgg cgggtgtcgg ggcgcagcca tgagagatct 420<210>2<211>44<212>DNA〈213〉人工合成〈220〉<221>mi sc_recomb
<400>2ggtaccatcg atgcggccgc ctcgaggaat tcactagtac tagt44<210>3<211>603<212>DNA〈213〉人巨細(xì)胞病毒〈220〉<221>Promoter <400>3ggtaccaata gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg 60gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc 120cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat 180tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat 240catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat 300gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc 360gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac 420tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa 480aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt 540aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatcatc 600gat603<210>4<211>1022<212>DNA〈213〉人工合成〈220〉<221>CDS<400>4atcgatatgg ctagattaga taaaagtaaa gtgattaaca gcgcattaga gctgcttaat 60gaggtcggaa tcgaaggttt aacaacccgt aaactcgccc agaagctagg tgtagagcag 120cctacattgt attggcatgt aaaaaataag cgggctttgc tcgacgcctt agccattgag 180atgttagata ggcaccatac tcacttttgc cctttagaag gggaaagctg gcaagatttt 240ttacgtaata acgctaaaag ttttagatgt gctttactaa gtcatcgcga tggagcaaaa 300gtacatttag gtacacggcc tacagaaaaa cagtatgaaa ctctcgaaaa tcaattagcc 360tttttatgcc aacaaggttt ttcactagag aatgcattat atgcactcag cgctgtgggg 420cattttactt taggttgcgt attggaagat caagagcatc aagtcgctaa agaagaaagg 480gaaacaccta ctactgatag tatgccgcca ttattacgac aagctatcga attatttgat 540caccaaggtg cagagccagc cttcttattc ggccttgaat tgatcatatg cggattagaa 600aaacaactta aatgtgaaag tgggtcgcca aaaaagaaga gaaaggtcga cggcggtggt 660gctttgtctc ctcagcactc tgctgtcact caaggaagta tcatcaagaa caaggagggc 720
權(quán)利要求
1. 一種單載體 雙向啟動(dòng)的Tet-οη誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng),其特征在于其元件的連接順序?yàn)?-,CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR I -Spe I -SV40polyA-3’，Tight-PminCMV左側(cè)的復(fù)合元件rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB_TRE 的連接方式為 3’ -rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-5’ -5’ -Tight-PminCMV-3’，其余元件均按與該系統(tǒng)相同方向5’-3’順序連接；兩個(gè)酶切位點(diǎn)EcoR I和Spe I位于元件Tight-PminCMV和元件SV40polyA之間，該系統(tǒng)序列如下 ggtaccaata gttattaata gtaatcaatt acggggtcat tagttcatag cccatatatg60gagttccgcg ttacataact tacggtaaat ggcccgcctg gctgaccgcc caacgacccc120cgcccattga cgtcaataat gacgtatgtt cccatagtaa cgccaatagg gactttccat180tgacgtcaat gggtggagta tttacggtaa actgcccact tggcagtaca tcaagtgtat240catatgccaa gtacgccccc tattgacgtc aatgacggta aatggcccgc ctggcattat300gcccagtaca tgaccttatg ggactttcct acttggcagt acatctacgt attagtcatc360gctattacca tggtgatgcg gttttggcag tacatcaatg ggcgtggata gcggtttgac420tcacggggat ttccaagtct ccaccccatt gacgtcaatg ggagtttgtt ttggcaccaa480aatcaacggg actttccaaa atgtcgtaac aactccgccc cattgacgca aatgggcggt540aggcgtgtac ggtgggaggt ctatataagc agagctggtt tagtgaaccg tcagatcatc600gatatggcta gattagataa aagtaaagtg attaacagcg cattagagct gcttaatgag660gtcggaatcg aaggtttaac aacccgtaaa ctcgcccaga agctaggtgt agagcagcct720acattgtatt ggcatgtaaa aaataagcgg gctttgctcg acgccttagc cattgagatg780ttagataggc accatactca cttttgccct ttagaagggg aaagctggca agatttttta840cgtaataacg ctaaaagttt tagatgtgct ttactaagtc atcgcgatgg agcaaaagta900catttaggta cacggcctac agaaaaacag tatgaaactc tcgaaaatca attagccttt960ttatgccaac aaggtttttc actagagaat gcattatatg cactcagcgc tgtggggcat1020tttactttag gttgcgtatt ggaagatcaa gagcatcaag tcgctaaaga agaaagggaa1080acacctacta ctgatagtat gccgccatta ttacgacaag ctatcgaatt atttgatcac1140caaggtgcag agccagcctt cttattcggc cttgaattga tcatatgcgg attagaaaaa1200caacttaaat gtgaaagtgg gtcgccaaaa aagaagagaa aggtcgacgg cggtggtgct1260ttgtctcctc agcactctgc tgtcactcaa ggaagtatca tcaagaacaa ggagggcatg1320gatgctaagt cactaactgc ctggtcccgg acactggtga ccttcaagga tgtatttgtg1380gacttcacca gggaggagtg gaagctgctg gacactgctc agcagatcgt gtacagaaat1440gtgatgctgg agaactataa gaacctggtt tccttgggtt atcagcttac taagccagat1500gtgatcctcc ggttggagaa gggagaagag ccctggctgg tggagagaga aattcaccaa1560gagacccatc ctgattcaga gactgcattt gaaatcaaat catcagttta agcggccgcc1620acagcgggga gatccagaca tgataagata cattgatgag tttggacaaa ccacaactag1680aatgcagtga aaaaaatgct ttatttgtga aatttgtgat gctattgctt tatttgtaac1740cattataagc tgcaataaac aagttaacaa caacaattgc attcatttta tgtttcaggt1800tcagggggag gtgtgggagg ttttttaaag caagtaaaac ctctacaaat gtggtatggc1860tgattatgat ccggctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg1920cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt1980
2.按照權(quán)利要求I所述的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于所述的TRE元件左側(cè)的PminCMV元件的方向與右側(cè)的Tight-PminCMV啟動(dòng)方向相反，均與TRE元件相鄰。
3.按照權(quán)利要求I所述的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，其特征在于在EcoR I與Spe I位點(diǎn)間連入的目的基因是報(bào)告基因或腫瘤治療基因。
4.一種單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建方法,其特征在于它包括下述步驟 (I)構(gòu)建含有Kpn I -Cla I -Not I -Xho I -EcoR I -Spe I限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的腺病毒El區(qū)穿梭載體 使用酶切連接法將 DNA IinkerCKpn I -Cla I -Not I -Xho I -EcoR I -SpeI -SpeI )連接入腺病毒El區(qū)穿梭載體，獲得所需要的載體；(2)擴(kuò)增構(gòu)建單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)所需的元件 通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增構(gòu)建單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)所需的元件，元件包括 CMV、TetR-KRAB, SV40polyA、Tight-PminCMV, rtTA2S_M2 ； (3)構(gòu)建帶有復(fù)合元件TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2的中間載體 通過(guò)酶切連接,將 TRE-PminCMV 連接至 pShuttle-KSL-SV40polyA_KB，并使用 Kpn I酶切后，T4DNA聚合酶補(bǔ)平末端，再用T4DNA連接酶進(jìn)行平末端連接，使TRE-PminCMV序列中304位的Kpn I位點(diǎn)消失，獲得TRE-KB-PminCMV元件；再將rtTA2S_M2連接到TRE-KB-PminCMV 的 3’ 端，同樣方法使 TRE-KB-PminCMV 與 rtTA2S_M2 間的 EcoR I 位點(diǎn)消失，得到帶有復(fù)合元件 TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2 的中間載體 pShuttIe-TRE-KB-PminCMV-EB-rtTA2S-M2-SV40polyA ； (4)構(gòu)建單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng) 使用連接酶連接法，將元件5’ -CMV-3’，5’ -TetR-KRAB-3’先后連接到pShuttle-KSL-SV40polyA 上，5’ -SV40polyA_3’ 與 3’ -rtTA2S-M2-TRE-PminCMV_5’ 連接為5’ -SV40polyA-3’ -3’ -rtTA2S-M2-TRE-PminCMV_5’，并一起連接到元件 TetR-KRAB 的 3’端，再將 5’ -Tight-PminCMV-3 連接到 3’ -rtTA2S-M2-TRE-PminCMV_5’ 的 5’ 端，得單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)。
5.權(quán)利要求I單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在制備治療結(jié)腸癌藥物中的用途。
6.按照權(quán)利要求5所述的單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在制備治療結(jié)腸癌藥物中的用途，其特征在于單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)在制備治療結(jié)腸癌藥物中使用，有效成分制備El區(qū)攜帶單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)并調(diào)控表達(dá)目的基因TRAIL的腺病毒載體，制備治療腫瘤藥物用常規(guī)注射液的形式來(lái)使用。
全文摘要
一種單載體雙向啟動(dòng)的Tet-on誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，元件的連接順序?yàn)?-’CMV-TetR-KRAB-SV40polyA-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-Tight-PminCMV-EcoR Ⅰ-Spe Ⅰ-SV40polyA-3’，Tight-PminCMV左側(cè)的復(fù)合元件rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE的連接方式為3’-rtTA2S-M2-EB-PminCMV-KB-TRE-5’-5’-Tight-PminCMV-3’，其余元件均按與該系統(tǒng)相同方向5’-3’順序連接；兩個(gè)酶切位點(diǎn)EcoR Ⅰ和Spe Ⅰ位于元件Tight-PminCMV和元件SV40polyA之間。
文檔編號(hào)C12N15/64GK102816793SQ20121030057
公開(kāi)日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2012年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2012年8月22日
發(fā)明者夏海濱, 陳皓 申請(qǐng)人:陜西師范大學(xué)