專利名稱：均相分析物檢測(cè)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及測(cè)定樣品中分析物的存在或其濃度的方法、組合物和試劑盒。
背景技術(shù)：
出于診斷和監(jiān)測(cè)疾病的目的，臨床化學(xué)領(lǐng)域需要測(cè)定生物液體中蛋白質(zhì)、藥物、有機(jī)體和其它分析物的濃度。例如，心肌梗塞時(shí)，(某些)蛋白質(zhì)從心臟中釋放出來(lái)。檢測(cè)這些蛋白質(zhì)的存在、濃度和其釋放的時(shí)間過(guò)程可幫助診斷心臟病發(fā)作。當(dāng)前在生物液體中檢測(cè)到的大多數(shù)臨床相關(guān)性蛋白存在的濃度大于I皮克/毫升。例如，前列腺特異性抗原(PSA)是可用于前列腺疾病檢測(cè)的血清蛋白，其在男性中存在的正常濃度約為0-4納克/毫升。PSA水平高于4ng/ml可懷疑患有前列腺疾病，尤其是前列腺癌。用常規(guī)的免疫檢測(cè)技術(shù)不難檢測(cè)該濃度范圍。然而，切除前列腺之后，PSA的濃度降低到用常規(guī)技術(shù)檢測(cè)不到的水平。已切除前列腺的癌癥患者中PSA水平增加是癌癥復(fù)發(fā)的指征。需要飛克/毫升靈敏度的實(shí)驗(yàn)來(lái)監(jiān)測(cè)這些患者。據(jù)估計(jì)，人類大約有35，000個(gè)基因和多達(dá)500，000種蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)相對(duì)于基因的多樣性增加可歸因于轉(zhuǎn) 錄后修飾(例如剪接)和翻譯后修飾(例如磷酸化、糖基化)。這些修飾可顯著改變蛋白質(zhì)的功能。因此，即使很細(xì)微的差別也可能是臨床相關(guān)性的。目前在人血漿中只鑒定了 290個(gè)蛋白，雖然在2D凝膠中可看到上千個(gè)斑點(diǎn)。人血漿蛋白質(zhì)組可能包括數(shù)以十萬(wàn)計(jì)的濃度極低以至現(xiàn)有技術(shù)難以檢測(cè)到的蛋白質(zhì)。目前還沒(méi)有能夠檢測(cè)到大多數(shù)這些蛋白質(zhì)的方法。臨床試驗(yàn)中可用的樣品量相對(duì)較少增加了檢測(cè)某些低濃度分析物的困難度。因此，蛋白質(zhì)分析物的大多數(shù)免疫檢測(cè)依賴于多相方法，例如ELISA (酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定)，其中將抗體結(jié)合的分析物與未結(jié)合的分析物物理分離。多相檢測(cè)方法很復(fù)雜，并且需要多個(gè)步驟(例如，與固相結(jié)合并重復(fù)進(jìn)行洗滌步驟)將結(jié)合的分析物與未結(jié)合分析物分離。這些步驟導(dǎo)致非特異性結(jié)合和靈敏度降低；而且這些步驟費(fèi)錢(qián)費(fèi)時(shí)。因此，需要避免非特異性結(jié)合的高靈敏性均相檢測(cè)。已描述了小分子如藥物的均相免疫檢測(cè)(不需要結(jié)合物質(zhì)和游離物質(zhì)的物理分離)。這些檢測(cè)包括SYVA’ s FRAT 檢測(cè)、EMIT 檢測(cè)、酶通道免疫檢測(cè)、和熒光能量轉(zhuǎn)移免疫檢測(cè)(FETI) (Dade Behring, Deerfield, Illinois);酶抑制物免疫檢測(cè)(Hoffman LaRoche和Abbott Laboratories):突光偏振免疫檢測(cè)(Dandlicker),以及其它檢測(cè)方法。所有這些方法的靈敏度都有限，只有少數(shù)幾種方法，包括FETI和酶通道檢測(cè)，適于大的多表位分析物。因此，需要用于檢測(cè)生物和臨床樣品中存在的大的和/或復(fù)雜的分析物的靈敏的均相方法。發(fā)明概述
本發(fā)明提供具有第一結(jié)合成員和第二結(jié)合成員的結(jié)合對(duì)，所述第一結(jié)合成員包含偶聯(lián)于第一核酸的第一特異性分子，所述第二結(jié)合成員包含偶聯(lián)于第二核酸的第二特異性分子，其中第一和第二核酸形成具有確定和有限的穩(wěn)定性的雙鏈體(duplex)。在某些實(shí)施方式中，第一和第二特異性分子可以是受體、配體或抗體。特異性分子可彼此相同或不同。在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明特異性分子與同一細(xì)胞上的兩種受體相互作用。在另一個(gè)實(shí)施方式中，第一和第二特異性分子均為單克隆抗體，它們可與相同抗原上不同的表位相互作用并因此包含夾心對(duì)。結(jié)合對(duì)的第一和第二核酸通常是單鏈核酸，可以是DNA、RNA或PNA，但也可以是部分雙鏈核酸或其類似物。在本發(fā)明某些實(shí)施方式中，至少一種核酸是嵌合DNA/RNA分子。本發(fā)明的核酸可通過(guò)其5’端或3’端偶聯(lián)。在本發(fā)明一方面，結(jié)合對(duì)中的一條核酸通過(guò)其5’端偶聯(lián)，另一條核酸通過(guò)其3’端偶聯(lián)。核酸間的雙鏈體可在核酸的末端之間形成，或可包含中間核酸序列。在優(yōu)選實(shí)施方式中，核酸適于用PCR、LCR、SDA或TMA擴(kuò)增。本發(fā)明還提供用結(jié)合成員檢測(cè)分析物的方法。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方式，將如上所述的結(jié)合對(duì)與分析物接觸形成復(fù)合物。然后結(jié)合對(duì)核酸解離，然后再結(jié)合。重新形成的雙鏈體(主要在分析物結(jié)合的結(jié)合對(duì)中發(fā)現(xiàn))經(jīng)3’延伸之后，通過(guò)可通過(guò)PCR擴(kuò)增包含雙鏈體的核酸來(lái)檢測(cè)重新形成的雙鏈體。當(dāng)PCR引物只結(jié)合于通過(guò)重新形成的雙鏈體的3’延伸而產(chǎn)生的位點(diǎn)而不與結(jié)合成員本身的核酸結(jié)合時(shí)，可大大減少背景?？捎枚喾N方法中的任意一種檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，這些方法包括溴化乙啶染色、銀染、放射自顯影、斑點(diǎn)印跡、狹線印跡、southern印跡、以及摻入熒光分子、熒光淬滅分子、化學(xué)發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光淬滅分子、生物發(fā)光化合物或熒光核苷。在本發(fā)明一個(gè)實(shí)施方式中，結(jié)合對(duì)核酸之一是DNA/RNA嵌合分子，另一個(gè)是DNA分子，兩個(gè)核酸之間形成的雙鏈體具有短的DNA/DNA雜合區(qū)和較長(zhǎng)的DNA/RNA雜合區(qū)。該實(shí)施方式中的完整雙鏈體是穩(wěn)定的，但可被RNA酶消化而變得不穩(wěn)定，這進(jìn)一步減少了不與分析物結(jié)合的結(jié)合對(duì)成員產(chǎn)生的背景。本發(fā)明多種實(shí)施方式可進(jìn)行組合以產(chǎn)生兼具特異性和高靈敏度的均相檢測(cè)試驗(yàn)，用于檢測(cè)臨床相關(guān)性蛋白質(zhì)、病毒和細(xì)胞。附圖
簡(jiǎn)述圖.1表示結(jié)合對(duì)的組成(content)、構(gòu)象和總體結(jié)合方案。圖.2提供包含SEQ ID N0.:1和SEQ ID N0.: 2的核酸對(duì)的雙鏈體形成、3’延伸和PCR擴(kuò)增的總體方案。圖.3提供包含SEQ ID N0.:1和SEQ ID N0.: 3的核酸對(duì)的雙鏈體形成、3’延伸和PCR擴(kuò)增的總體方案。圖.4顯示9個(gè)以及15個(gè)堿基對(duì)重疊寡核苷酸鏈的實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增(熱啟動(dòng))。圖.5顯示均相NADIA 的示意圖。圖.6顯示核酸對(duì)的取向和雙鏈體形成，其中一條寡核苷酸[SEQ ID N0.:1]通過(guò)連接于其3’端的間隔分子(spacer)連 接，而另一條寡核苷酸[SEQ ID N0.:3]通過(guò)其5’端直接連接。圖7.表示將嵌合RNA/DNA寡核苷酸用于分析物檢測(cè)的過(guò)程?！癛”表示核糖核苷酸堿基的位置，“D”表示脫氧核糖核苷酸堿基的位置，“S”表示間隔分子的位置。
圖8.表示用均相NADIA 檢測(cè)PSA。發(fā)明詳述應(yīng)理解，上文的一般性描述和下文的詳細(xì)描述只是示范性和解釋性的，而非限制本發(fā)明。本文所用的單數(shù)包括復(fù)數(shù)，除非另有說(shuō)明。本文所用的“或”指“和/或”，除非另有說(shuō)明。此外，使用的術(shù)語(yǔ)“包括”以及該術(shù)語(yǔ)的其它形式是非限制性的。本文所用各節(jié)的標(biāo)題只是出于組織行文的目的，不應(yīng)理解成限制所述的主題。本申請(qǐng)中引用的所有文件或文件的部分，包括但不限于專利、專利申請(qǐng)、文章、書(shū)籍、手冊(cè)、和論文均全文明確納入本申請(qǐng)，作為參考文獻(xiàn)用于所有目的。定義在進(jìn)一步描述本發(fā)明具體實(shí)施方式
之前，要定義和詳細(xì)描述一些術(shù)語(yǔ)。除非另有明確定義，本文所用的相關(guān)術(shù)語(yǔ)、實(shí)驗(yàn)室操作、技術(shù)和方法是其所屬領(lǐng)域所知的。標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)符號(hào)和縮寫(xiě)可與這些符號(hào) 所代表的全名互換使用。因此，例如，術(shù)語(yǔ)“氫”和“H”理解為具有相同的含義。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于化學(xué)合成、化學(xué)分析、藥物制備、配制(formulation)、遞送以及患者治療。標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)可用于重組DNA方法、寡核苷酸合成、組織培養(yǎng)等。如本領(lǐng)域通?？蓪?shí)現(xiàn)的或如本文所述的，可根據(jù)生產(chǎn)商的說(shuō)明書(shū)用試劑盒來(lái)實(shí)施反應(yīng)和純化技術(shù)。一般可根據(jù)本領(lǐng)域熟知的常規(guī)方法或如本文說(shuō)明書(shū)全文所引用和討論的各種一般性或更具體的參考文獻(xiàn)中所述的方法來(lái)實(shí)施上述技術(shù)和操作。見(jiàn)，例如Samtoook等，分子克隆:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)(第 2 版，ColdSpring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)), Harlow & Lane,抗體:實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(Antibodies:ALaboratory Manual) (Cold Spring Harbor LaboratoryPress, Cold Spring Harbor, N.Y.(1988)),全文納入本文作為參考用于所有目的。本文所用“結(jié)合成員”指特異性分子和核酸之間形成的偶聯(lián)物。含有由結(jié)合成員核酸之間形成的、具有確定和有限的穩(wěn)定性的雙鏈體連接的兩個(gè)結(jié)合成員的組合物稱為“結(jié)合對(duì)”。結(jié)合對(duì)與分析物組合形成結(jié)合對(duì)-分析物復(fù)合物，本文簡(jiǎn)單地稱為“復(fù)合物”。本文所用術(shù)語(yǔ)“分析物”指需要在試驗(yàn)中檢測(cè)以及可能存在于樣品中的任何物質(zhì)。該分析物可以是任何物質(zhì)而沒(méi)有限制。在本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施方式中，分析物包括存在天然抗體或可制備其抗體的物質(zhì)。分析物可以是例如，蛋白質(zhì)、多肽、半抗原、糖、脂質(zhì)、藥物、細(xì)胞或多種生物或非生物分子中的任何其它物質(zhì)，它們的復(fù)合物或組合。在另一個(gè)實(shí)施方式中，分析物是核酸。在另一個(gè)實(shí)施方式中，分析物是抗體。在另一個(gè)實(shí)施方式中，分析物是細(xì)胞(動(dòng)物、植物、真菌、細(xì)菌等的細(xì)胞)或其亞組分或細(xì)胞器(如線粒體)?？捎帽景l(fā)明組合物、方法和試劑盒檢測(cè)的多價(jià)配體分析物一般是多(氨基酸)，即多肽、蛋白質(zhì)、多糖、核酸，或它們的組合。這些組合包括細(xì)胞組分、組織、細(xì)菌、病毒、細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、細(xì)胞器、染色體、基因、線粒體、核等。根據(jù)本發(fā)明一方面，某些分析物不含有核酸?？捎帽景l(fā)明方法對(duì)多種蛋白質(zhì)分析物進(jìn)行方便地檢測(cè)?？蓪⑦@些蛋白質(zhì)分析物分類成各蛋白質(zhì)家族，各家族有類似的結(jié)構(gòu)特征、生物功能、與特定微生物(尤其是致病微生物)的關(guān)系等。本發(fā)明特別感興趣的蛋白質(zhì)家族包括例如，免疫球蛋白、細(xì)胞因子、酶、激素、癌抗原、營(yíng)養(yǎng)標(biāo)記、組織特異性抗原和生物戰(zhàn)爭(zhēng)物質(zhì)。這些蛋白質(zhì)分析物可存在于血液、血清、血漿、脊髓液、滑膜液、唾液、尿液、細(xì)胞或組織。
以下是可用本發(fā)明組合物、方法和試劑盒檢測(cè)的結(jié)構(gòu)相關(guān)的蛋白質(zhì)分析物類別的例子:魚(yú)精蛋白組蛋白白蛋白球蛋白硬蛋白磷蛋白粘蛋白以下是可用本發(fā)明組合物、方法和試劑盒檢測(cè)的人血漿中發(fā)現(xiàn)的臨床重要性蛋白質(zhì)的例子:α「脂蛋白α 1-抗胰蛋白酶皮質(zhì)激素傳遞蛋白

4.6S-后白蛋白色氨酸-弱(Tryptophan-poor)α「糖蛋白α1χ-糖蛋白甲狀腺素結(jié)合球蛋白間-α -胰蛋白酶抑制劑Ge-球蛋白(Ge 1-1)(Ge 2-1)(Ge 2-2)七珠蛋白(Hp 1-1)(Hp 2-1)(Hp 2-2)血漿銅藍(lán)蛋白乙酰膽堿酯酶α2-脂蛋白肌紅蛋白C-反應(yīng)性蛋白α 2 -巨球蛋白a2-HS-糖蛋白Ζη-α2-糖蛋白α 2-神經(jīng)氨糖酸糖蛋白促紅細(xì)胞生成素β_脂蛋白
轉(zhuǎn)鐵蛋白血紅素蛋白纖維蛋白原纖溶酶原β2_ 糖蛋白 Iβ2_ 糖蛋白 II免疫球蛋白G(IgG)或 Y G-球蛋白分子式:Y2k2 或 Y 2 λ 2免疫球蛋白A(IgA)或YA-球蛋白分子式:(α2 K 2)η 或(α 2 κ 2)η免疫球蛋白M (IgM)或Y M-球蛋白分子式:(μ2 K 2) 5 或(μ 2 λ 2) 5免疫球蛋白D(IgD)或Y D-球蛋`白UD)分子式:(.δ.2 κ 2)或(.δ.2 λ 2)免疫球蛋白E(IgE)或Y E-球蛋白UE)分子式:(ε2 κ 2)或(ε 2 λ 2)游離κ和λ輕鏈補(bǔ)體因子:C1 IC1 IqC' IrC' IsC1 2C1 3β ^a 2DC1 4C1 5C1 6C1 7C1 8C1 9可用本發(fā)明組合物、方法和試劑盒檢測(cè)的重要血液凝固因子包括下表中所列的例子:
權(quán)利要求
1.一種結(jié)合對(duì)，其包含: 第一結(jié)合成員，其含有偶聯(lián)于第一核酸的5’端的第一特異性分子；和第二結(jié)合成員，其含有偶聯(lián)于第二核酸的3’端的第二特異性分子，其中所述第一和第二核酸形成具有確定和有限的穩(wěn)定性的雙鏈體，其中所述第一特異性分子是第一抗體，所述第二特異性分子是第二抗體，其中所述抗體結(jié)合選自以下的分析物: 魚(yú)精蛋白 組蛋白 白蛋白 球蛋白 硬蛋白 憐蛋白 粘蛋白 脂蛋白 α 1-抗胰蛋白酶 皮質(zhì)激素傳遞蛋白. 4.6S-后白蛋白 色氨酸 _ 弱(Trypt ophan-poor) O1-糖蛋白 α1χ_糖蛋白 甲狀腺素結(jié)合球蛋白 間- α-胰蛋白酶抑制劑 Ge-球蛋白 (Ge 1-1)(Ge 2-1)(Ge 2-2) 七珠蛋白 (Hp 1-1)(Hp 2-1)(Hp 2-2) 血漿銅藍(lán)蛋白 乙酰膽堿酯酶 α2-脂蛋白 肌紅蛋白 C-反應(yīng)性蛋白 α 2 -巨球蛋白 Ci2-HS-糖蛋白 Zn- α 2 -糖蛋白 α2-神經(jīng)氨糖酸糖蛋白 促紅細(xì)胞生成素β-脂蛋白 轉(zhuǎn)鐵蛋白 血紅素蛋白 纖維蛋白原 纖溶酶原 β2-糖蛋白I β2-糖蛋白II 免疫球蛋白G (IgG)或Y G-球蛋白 分子式:Y2k2或Υ2λ2免疫球蛋白A(IgA)或YA-球蛋白 分子式:(α 2 κ2)η或(α2 K 2)η免疫球蛋白M(IgM)或Y M-球蛋白 分子式:(μ2 κ2)5或(μ 2 λ 2)5免疫球蛋白D(IgD)或YD-球蛋白(Y D) 分子式:(.δ.2 κ2)或(.δ.2 λ 2)免疫球蛋白E(IgE)或YE-球蛋白UE) 分子式:(ε 2 K 2)或(ε 2 λ 2) 游離K和λ輕鏈 補(bǔ)體因子: C' I C' Iq C' Ir C' Is C' 2 C' 3 β !A a 2D C' 4 C' 5 C' 6 C' 7C' 8 C' 9 血液凝固因子1:纖維蛋白原；因子I1:凝血酶原；因子IIa:凝血酶；因子II1:組織凝血致活酶；因子V和V1:促凝血球蛋白原，加速球蛋白；因子VI1:前轉(zhuǎn)化素；因子VII1:抗血友病球蛋白(AHG);因子IX:血小板輔因子II血漿凝血激酶(PTC);因子X(jué) =St-P因子，自身凝血酶原III ;因子X(jué)1:血漿凝血活酶；因子X(jué)II1:血纖維穩(wěn)定因子； 肽和蛋白質(zhì)激素 甲狀旁腺激素(甲狀旁腺素) 甲狀腺降鈣素 胰島素 高血糖素松弛酞促紅細(xì)胞生成素促黑激素(黑素細(xì)胞-刺激激素；垂體中間葉激素)成長(zhǎng)激素(生長(zhǎng)激素)促腎上腺皮質(zhì)激素(促皮質(zhì)素)促甲狀腺激素卵胞刺激素促黃體(生成)激素(促間質(zhì)細(xì)胞激素)催乳(Luteomammotropic)激素(催乳素,泌乳素)絨促性素(絨毛膜促性腺激素)組織激素分泌素胃泌素血管緊張素I和II緩激肽人胎盤(pán)催乳激素細(xì)胞因子IL IIL 2IL 4IL 6IL 8ILlOEGFTNFNGF癌抗原PSACEAα-胎蛋白酸性磷酸酯酶CA19.9CA1 25組織特異性抗原堿性磷酸酶肌紅蛋白CPK-MB肌鈣蛋白BNPPro-BNP降鈣素髓磷脂堿性蛋白來(lái)自神經(jīng)垂體的肽激素催產(chǎn)素抗利尿激素釋放因子(RF) CRFj LRFj TRFj 成長(zhǎng)激素-RF，GRFj FSH-RF，PIFj MIF 蓖麻毒素白喉(Diptheria)毒素肉毒桿菌毒素葡萄球菌腸毒素B棒狀桿菌白喉棒狀桿菌(Corynebacterium diphtheria)肺炎球菌月市炎雙球菌(Diplococcus pneumoniae)鏈球菌釀胺鏈球菌(Streptococcus pyrogenes)唾液鏈球菌(Streptococcus sal ivarus)葡萄球菌金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)白色葡萄球菌(Staphylococcus albus)奈瑟菌腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhea)腸桿菌(Enterobacteriaciae)大腸菌大腸桿菌(Escherichia coli)產(chǎn)氣桿菌(Aerobacter aerogenes)肺炎克雷伯桿菌(Klebsiellapneumoniae)沙門(mén)氏菌傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhosa)豬霍亂沙門(mén)氏菌(Salmonellacholeraesuis)鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)志賀氏桿菌痢疾志賀氏桿菌(Shigella dysenteria) 施氏志賀桿菌(Shigella schmitzii)阿糖遲酵志賀氏菌(Shigella arabinotard)弗氏志賀氏桿菌(Shigella fIexneri)鮑氏志賀氏桿菌(Shigella boydii)索氏志賀氏桿菌(Shigella sonnei)其它腸桿菌普通變形桿菌(Proteus vulgaris)奇異變形桿菌(Proteus mirabilis)變性桿菌種(Proteus species)摩氏變形菌(Proteus morgani)綠胺假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)類產(chǎn)減桿菌(Alcaligenes faecalis)霍亂弧菌(Vibrio cholerae)嗜血桿菌-博德特氏菌屬(Hemophilus-Bordetella Group)流感嗜血桿菌 Hemophilus influenza,Hemophilus ducryiHemophilus hemophilusHemophilus aegypticus副流感嗜血桿菌(Hemophilus parainfluenza)百日咳博德特氏菌(Bordetalla pertussis)巴斯德菌屬鼠疫巴斯德菌(Pasteurella pestis)土拉熱巴斯德菌(Pasteurella tulareusis)布氏桿菌(Brucellae)羊流產(chǎn)布氏桿菌(Brucella melitensis)流產(chǎn)布氏桿菌(Brucella abortus)豬流產(chǎn)布氏桿菌(Brucella suis)需氧芽孢桿菌屬炭疽桿菌(Bacillus anthracis)枯草桿菌(Bacillus subtilis)巨大芽胞桿菌(Bacillus megaterium)錯(cuò)樣芽胞桿菌(Bacillus cereus)厭氧芽孢桿菌屬肉毒梭狀芽胞桿菌(Clostridium botulinum)破傷風(fēng)梭狀芽胞桿菌(Clostridium tetani)產(chǎn)氣莢膜梭狀芽胞桿菌(Clostridium perfringens)諾維(氏)動(dòng)作狀芽胞桿菌(Clostridium novyi)敗血梭狀芽胞桿菌(Clostridium septicum)溶組織梭狀芽胞桿菌(Clostridium histolyticum)第三羧狀芽胞桿菌(Clostridium tertium)雙酶梭狀芽胞桿菌(Clostridium bifermentans)產(chǎn)芽胞梭狀芽胞桿菌(Clostridium sporogenes)分枝桿菌人結(jié)核分支桿菌(Mycobacterium tuberculosis hominis)牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis) 鳥(niǎo)分枝桿菌(Mycobacterium avium) 麻風(fēng)分枝桿菌(Mycobacterium leprae) 副結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium paratuberculosis) 放線菌(真菌樣細(xì)菌) 布氏放線菌(Actinomyces Isaeli) 牛放線菌(Actinomyces bovis) 內(nèi)氏放線菌(Actinomyces naeslundii) 星形諾卡氏菌(Nocardia asteroides) 巴西諾卡氏菌(Nocardia brasiliensis) 螺旋菌 梅毒密螺旋體(Treponema pallidum) 細(xì)弱密螺旋體(Treponema pertenue) 品他病密螺旋體(Treponema carateum) 回歸熱疏螺旋體(Borrelia recurrentis) 出血性黃痕鉤端螺旋體(Leptospira icterohemorrhagiae) 犬鉤端螺旋體(Leptospira canicola) 睡病蟲(chóng)(Trypanasomes) 支原體 月市炎支原體(Mycoplasma pneumoniae) 其它病原體 立克次氏體(細(xì)菌樣i者蟲(chóng)) 普氏立克次氏體(Rickettsia prowazekii) 莫塞爾立克次氏體(Rickettsia mooseri) 立克(氏)立克次氏體(Rickettsia rickettsii) 康氏立克次氏體(Rickettsia conori) 澳洲立克次氏體(Rickettsia australis) 西伯利亞立克次氏體(Rickettsia sibiricus) 螨立克次氏體(Rickettsia akari) 恙蟲(chóng)熱立克次氏體(Rickettsia tsutsugamushi) 衣原體(不可分 類的諸蟲(chóng)細(xì)菌/病毒(unclassif iable parasites bacterial/viral)) 衣原體物質(zhì)(不確定的名稱) 麵 新型隱球菌(Cryptococcus neoformans) 皮膚炎芽生菌(Blastomyces dermatidis)Hisoplasma capsulatum粗球抱子菌(Coccidioides immitis) 巴西副球抱子菌(Paracoccidioides brasiliensis)白色念珠菌(Candida albicans)煙曲霉(Aspergillus fumigatus)傘狀毛霉菌(Mucor corymb if er)(傘狀犁頭霉(Absidia corymb if era))稻根霉菌(Rhizopus oryzae)Rhizopus arrhizua藻狀菌(Phycomycetes)黑色根霉(Rhizopus nigricans)Sporotrichum schenkiiFlonsecaea pedrosoiFonsecacea compactFonsecacea dermatidis卡氏分支著色霉菌(Cladosporium carrionii)撫狀著色霉菌(Phialophora verrucosa)構(gòu)巢曲霉(Aspergillus nidulans)足腫馬杜拉分支菌(Madurella mycetomi)灰色馬杜拉分支菌(Madurella grisea)波氏霉樣真菌(Allescheria boydii)瓊?cè)麪柮肥掀棵咕?Phialophora jeanselmei)石膏樣小抱子菌(Microsporum gypseum)須瘡癬菌(Trichophyton mentagrophytes)埃吉羅氏角質(zhì)線菌(Keratinomyces ajelloi)犬小抱子菌(Microsporum canis)Microsporum adouini紅色發(fā)癬菌(Trichophyton rubrum)病毒腺病毒桐瘡病毒單純痕疫病毒(Herpes simplex)水痘(Varicella)(禽痘(Chicken pox))帶狀皰疫(Herpes Zoster) (Shingles)B 病毒(Virus B)細(xì)胞巨化病毒(Cytomegalovirus)痘病毒天花(Variola) (smallpox)牛痘(Vaccinia)牛痘病毒(Poxvirus bovis)副牛痘(Paravaccinia)觸染性軟撫 (Molluscum contagiosum)微小核糖核酸病毒脊髓灰質(zhì)炎病毒(Poliovirus)柯薩奇腸道病毒(Coxsackievirus)埃可病毒(Echoviruses)鼻病毒(Rhinoviruses)粘病毒副流感(Parainfluenza) (1-4)月思腺炎病毒(Mumps Virus)新城疫病毒(Newcastle Disease Virus)麻疫病毒(Measles Virus)牛痕麻疫病毒(Rinderpest Virus)犬痕熱病毒(Canine Distemper Virus)呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncyt ial Virus)風(fēng)疫病毒(Rubella Virus)蟲(chóng)媒病毒東方馬腦炎病毒(Eastern Equine Encephalitis Virus)西方馬腦炎病毒(Western Equine Encephalitis Virus)辛德比斯病毒(Sindbis Virus)屈曲病毒(Chikugunya Virus)塞姆利基森林病毒(Semliki Forest Virus)Mayora Virus圣路易斯腦炎病毒(St.Louis Encephalitis Virus)普氏立克次氏體(Rickettsia prowazekii)加利福尼亞腦炎病毒(California Encephalitis Virus)科羅拉多婢熱病毒(Colorado Tick Fever Virus)黃熱病病毒(Yellow Fever Virus)登革熱病毒(Dengue Virus)呼腸病毒呼腸病毒 1_3 型(Reovirus Types 1-3)逆轉(zhuǎn)錄病毒人免疫缺陷病毒I和II (HIV)嗜人T淋巴細(xì)胞病毒I和II (HTLV)肝炎病毒甲肝病毒乙肝病毒丙肝病毒腫瘤病毒勞舍爾白血病病毒(Rauscher Leukemia Virus)格羅斯病毒(Gross Virus)馬羅尼白血病病毒(Maloney Leukemia Virus)人乳頭狀瘤病毒(Human Papilloma Virus)。
2.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合對(duì)，其特征在于，所述第一和第二抗體是單克隆抗體。
3.如權(quán)利要求2所述的結(jié)合對(duì)，其特征在于，所述第一和第二抗體獨(dú)立地與同一抗原上的表位相互作用。
4.如權(quán)利要求2所述的結(jié)合對(duì)，其特征在于，所述第一和第二抗體包含夾心對(duì)。
5.如權(quán)利要求4所述的結(jié)合對(duì)，其特征在于，所述第一和第二特異性分子與不同分子相互作用。
6.如權(quán)利要求5所述的結(jié)合對(duì)，其特征在于，所述不同的分子是同一細(xì)胞上的兩種受體，其中所述兩種受體可以在細(xì)胞分析物表面有多個(gè)拷貝的同一種受體，或不同的受體。
7.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合對(duì)，其特征在于，所述第一和第二核酸是單鏈核酸。
8.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合對(duì)，其特征在于，所述第一核酸包含SEQID N0.1，所述第二核酸包含 SEQ ID N0.:2 或 SEQ ID N0.:3。
9.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合對(duì)，其特征在于，所述第一和第二核酸各自獨(dú)立地選自DNA、RNA 或 PNA。
10.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合對(duì)，其特征在于，所述第一和第二核酸中的至少一個(gè)是嵌合 DNA/RNA、DNA/PNA 或 RNA/PNA 分子。
11.如權(quán)利要求10所述的結(jié)合對(duì)，其特征在于，在所述第一核酸的3’末端和所述第二核酸的內(nèi)部序列之間形成所述雙鏈`體。
12.如權(quán)利要求1所述的結(jié)合對(duì)，其特征在于，所述核酸雜合體適于用PCR、LCR、SDA或TMA擴(kuò)增。
13.權(quán)利要求1所述的結(jié)合對(duì)的用途，其特征在于，用于制備用于檢測(cè)分析物的方法的試劑盒，所述方法包括: (a)提供分析物； (b)提供結(jié)合對(duì)，其包含: (i )第一結(jié)合成員，其含有偶聯(lián)于第一核酸的第一特異性分子；和 (ii)第二結(jié)合成員，其含有偶聯(lián)于第二核酸的第二特異性分子，其中所述第一和第二核酸形成具有確定和有限的穩(wěn)定性的雙鏈體； (C)使所述結(jié)合對(duì)與所述分析物接觸，從而形成復(fù)合物； Cd)加熱所述復(fù)合物至超過(guò)所述雙鏈體解鏈溫度的溫度，使所述雙鏈體解離； (e)在允許結(jié)合于所述細(xì)胞的結(jié)合成員重新結(jié)合、但不允許過(guò)量的游離結(jié)合成員大量重新結(jié)合的條件下，孵育所述雙鏈體，從而產(chǎn)生重新形成的雙鏈體； (f)延伸所述重新形成的雙鏈體的3’端；和 (g)檢測(cè)重新形成的雙鏈體，從而檢測(cè)所述分析物。
14.如權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于，在含有鹽的水溶液中形成所述復(fù)合物，步驟(d)包括降低所述水溶液鹽濃度。
15.如權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于，步驟(d)還包括稀釋所述復(fù)合物。
16.如權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于，步驟(g)包括擴(kuò)增含有重新形成的雙鏈體的核酸分子并檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。
17.如權(quán)利要求16所述的用途，其特征在于，所述擴(kuò)增用PCR、LCR、SDA或TMA完成。
18.如權(quán)利要求16所述的用途，其特征在于，所述擴(kuò)增用PCR采用只結(jié)合于通過(guò)步驟Cf)中延伸重新形成的雙鏈體的3’末端而產(chǎn)生的位點(diǎn)的引物來(lái)完成。
19.如權(quán)利要求16所述的用途，其特征在于，所述擴(kuò)增產(chǎn)物用選自以下的方法檢測(cè):溴化乙啶染色、銀染、放射自顯影、斑點(diǎn)印跡、狹線印跡和southern印跡。
20.如權(quán)利要求14所述的用途，其特征在于，通過(guò)將檢測(cè)分子摻入以下至少一種物質(zhì)中來(lái)檢測(cè)重新形成的雙鏈體:第一單鏈核酸，第二單鏈核酸，結(jié)合對(duì)的雙鏈區(qū)和擴(kuò)增產(chǎn)物。
21.如權(quán)利要求20所述的用途，其特征在于，所述檢測(cè)分子選自:熒光分子、熒光淬滅分子、化學(xué)發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光淬滅分子、生物發(fā)光分子、放射性分子和熒光核苷酸。
22.如權(quán)利要求13所述的用途，其特征在于，第一和第二核酸中的至少一個(gè)是嵌合DNA/RNA、DNA/PNA或RNA/PNA分子，在步驟(d)解離雙鏈體之前，用RNA酶消化步驟(c)中的復(fù)合物。
23.如權(quán)利要求17所述的用途，其特征在于，通過(guò)將檢測(cè)分子摻入擴(kuò)增產(chǎn)物來(lái)檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，所述檢測(cè)分子選自:熒光分子、熒光淬滅分子、化學(xué)發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光淬滅分子、生物發(fā)光分子、放射性分子和突光核苷酸。
24.結(jié)合對(duì)的用途，其特征在于，用于制備用于試劑盒，所述試劑盒用于包括以下步驟的方法: (a)提供第一結(jié)合成員和第二結(jié)合成員，所述第一結(jié)合成員包含偶聯(lián)于第一單鏈核酸的5’端的、針對(duì)前列腺特異性抗原上的第一表位的單克隆抗體，所述第二結(jié)合成員包含偶聯(lián)于第二單鏈核酸3’端的、針對(duì)前列腺特異性抗原上的第二表位的單克隆抗體，其中所述第一單鏈核酸與第二單鏈核酸雜交，從而在所述第一核酸的3’端和所述第二結(jié)合成員的內(nèi)部序列之間形成確定和有限的穩(wěn)定性的雙鏈體，從而形成通過(guò)核酸雙鏈連接的結(jié)合對(duì)； (b)將所述結(jié)合對(duì)與樣品接觸，從而形成結(jié)合對(duì)-PSA復(fù)合物，其中所述樣品含有存在于溶液中的PSA ； (c)加熱所述結(jié)合對(duì)-PSA復(fù)合物以解離核酸雙鏈體； Cd)在允許結(jié)合于PSA的結(jié)合成員重新結(jié)合、但不允許溶液中過(guò)量的游離結(jié)合成員大量重新結(jié)合的條件下，孵育所述結(jié)合對(duì)-PSA復(fù)合物； Ce)檢測(cè)結(jié)合對(duì)復(fù)合物，從而檢測(cè)PSA。
25.如權(quán)利要求24所述的用途，其特征在于，所述第一和第二單克隆抗體一起形成針對(duì)PSA的單克隆抗體夾心對(duì)。
26.如權(quán)利要求24所述的用途，其特征在于，所述樣品選自:血液樣品、血清樣品、血漿樣品或組織樣品。
27.如權(quán)利要求24所述的用途，其特征在于，所述第一單鏈核酸包含SEQIDN0.:1，所述第二單鏈核酸包含SEQ ID N0.:2或3。
28.如權(quán)利要求24所述的用途，其特征在于，步驟(c)在45°C進(jìn)行，步驟(d)在室溫進(jìn)行。
29.如權(quán)利要求24所述的用途，其特征在于，所述檢測(cè)步驟包括擴(kuò)增所述雙鏈區(qū)。
30.如權(quán)利要求29所述的用途，其特征在于，所述擴(kuò)增包括以下步驟: (a)用DNA聚合酶延伸所述雙鏈體的3’端，其中所述延伸產(chǎn)生至少一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)；和(b)用與步驟(a)中所述至少一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的至少一個(gè)引物在所述延伸的雙鏈體上進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
31.結(jié)合對(duì)的用途，其特征在于，用于制備試劑盒，所述試劑盒用于包括下列步驟的方法: (a)提供包含至少一個(gè)細(xì)胞的樣品； (b)提供第一結(jié)合成員和第二結(jié)合成員，所述第一結(jié)合成員包含偶聯(lián)于第一單鏈核酸5’端的、針對(duì)所述細(xì)胞上的表位的抗體，所述第二結(jié)合成員包含偶聯(lián)于第二單鏈核酸3’端的、針對(duì)所述細(xì)胞上的表位的抗體，其中所述第一單鏈核酸與第二單鏈核酸雜交，在所述第一核酸的3’端和所述第二結(jié)合成員的內(nèi)部序列之間形成確定和有限的穩(wěn)定性的雙鏈體，從而形成通過(guò)核酸雙鏈連接的結(jié)合對(duì)； (c)將所述結(jié)合對(duì)與樣品接觸，從而形成結(jié)合對(duì)-細(xì)胞復(fù)合物； (d)通過(guò)加熱至超過(guò)所述雙鏈體解鏈溫度的溫度使核酸雙鏈體解離，其中所述復(fù)合物中的所述結(jié)合成員被鎖定在其在細(xì)胞內(nèi)結(jié)合時(shí)非常接近的位置； (e)在允許結(jié)合于所述細(xì)胞的結(jié)合成員重新結(jié)合、但不允許過(guò)量的游離結(jié)合成員大量重新結(jié)合的條件下，孵育所述雙鏈體，從而產(chǎn)生重新形成的雙鏈體； (f)檢測(cè)含有所述重新形成的雙鏈體的核酸，從而檢測(cè)所述細(xì)胞。
32.如權(quán)利要求31所述的用途，其特征在于，所述細(xì)胞選自:細(xì)菌細(xì)胞、動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞或真菌細(xì)胞。
33.如權(quán)利要求32所述的用途，其特征在于，所述動(dòng)物細(xì)胞是人類細(xì)胞。
34.如權(quán)利要求33所述的用途，其特征在于，所述人類細(xì)胞是患病細(xì)胞。
35.如權(quán)利要求31所述的用途，其特征在于，所述第一核酸包含SEQIDN0.: 1，所述第二核酸包含SEQ ID N0.:2或3。
36.如權(quán)利要求31所述的用途，其特征在于，所述第一和第二抗體是多克隆抗體。
37.如權(quán)利要求36所述的用途，其特征在于，所述第一和第二抗體是同一多克隆抗體的等份。
38.如權(quán)利要求31所述的用途，其特征在于，所述加熱約在45°C進(jìn)行。
39.如權(quán)利要求31所述的用途，其特征在于，步驟(e)包括稀釋所述復(fù)合物；并在室溫孵育所述稀釋的復(fù)合物。
40.如權(quán)利要求39所述的用途，其特征在于，所述復(fù)合物稀釋至少10倍。
41.如權(quán)利要求39所述的用途，其特征在于，所述復(fù)合物稀釋至少100倍。
42.如權(quán)利要求31所述的用途，其特征在于，步驟(f)包括擴(kuò)增包含所述重新形成的雙鏈體的核酸。
43.如權(quán)利要求42所述的用途，其特征在于，所述擴(kuò)增包括以下步驟: Ca)用DNA聚合酶延伸所述雙鏈體的3’端，其中所述延伸產(chǎn)生至少一個(gè)引物的結(jié)合位點(diǎn)；和 (b)用與步驟(a)中產(chǎn)生的結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的至少一個(gè)引物在所述延伸的雙鏈體上進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
44.如權(quán)利要求43所述的用途，其特征在于，所述至少一個(gè)引物包含SEQIDN0.:4或50
45.如權(quán)利要求31所述的用途，其特征在于，所述第一核酸通過(guò)其3’末端偶聯(lián)于所述第一抗體，所述第二核酸通過(guò)其5’末端偶聯(lián)于所述第二抗體。
46.如權(quán)利要求45所述的用途，其特征在于，所述第一和第二核酸中的至少一個(gè)通過(guò)間隔分子連接于各自的抗體。
47.結(jié)合對(duì)的用途，其特征在于，用于制備試劑盒，所述試劑盒用于包括以下步驟的方法: (a)提供第一結(jié)合成員和第二結(jié)合成員，所述第一結(jié)合成員包含偶聯(lián)于第一單鏈核酸的5’端的、針對(duì)前列腺特異性抗原上的第一表位的單克隆抗體，所述第二結(jié)合成員包含偶聯(lián)于第二單鏈核酸3’端的、針對(duì)前列腺特異性抗原上的第二表位的單克隆抗體，其中所述第一單鏈核酸與第二單鏈核酸雜交，從而在所述第一核酸的3’端和所述第二結(jié)合成員的內(nèi)部序列之間形成確定和有限的穩(wěn)定性的雙鏈體，從而形成通過(guò)核酸雙鏈連接的結(jié)合對(duì) (b)使所述樣品與所述結(jié)合對(duì)接觸，其中所述樣品在溶液中含有肌鈣蛋白T，從而形成結(jié)合對(duì)-肌鈣蛋白T復(fù)合物； (c)加熱結(jié)合對(duì)-肌鈣蛋白T復(fù)合物，解離所述核酸雙鏈體； Cd)在允許結(jié)合于所述分析物的結(jié)合成員與肌鈣蛋白T重新結(jié)合、但不允許過(guò)量的游離結(jié)合成員大量重新結(jié)合的條件下，孵育結(jié)合對(duì)-肌鈣蛋白T復(fù)合物； Ce)檢測(cè)結(jié)合對(duì)雙鏈體，從而檢測(cè)肌鈣蛋白T。
48.如權(quán)利要求47 所述的用途，其特征在于，所述第一和第二單克隆抗體形成對(duì)肌鈣蛋白T的單克隆抗體夾心對(duì)。
49.如權(quán)利要求47所述的用途，其特征在于，所述樣品選自尿樣、血液樣品、血清樣品、血漿樣品或組織樣品。
50.如權(quán)利要求47所述的用途，其特征在于，所述第一單鏈核酸包含SEQIDN0.:1，所述第二單鏈核酸包含SEQ ID N0.:2或3。
51.如權(quán)利要求47所述的用途，其特征在于，所述步驟(c)在45°C進(jìn)行，而所述步驟(d)在室溫下進(jìn)行。
52.如權(quán)利要求47所述的用途，其特征在于，所述檢測(cè)步驟包括擴(kuò)增雙鏈體區(qū)域。
53.如權(quán)利要求52所述的用途，其特征在于，所述擴(kuò)增包括用DNA聚合酶延伸所述雙鏈體的3’端，其中所述延伸產(chǎn)生至少一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)。
54.如權(quán)利要求53所述的用途，其特征在于，所述擴(kuò)增還包括用與步驟(a)中所述至少一個(gè)引物結(jié)合位點(diǎn)互補(bǔ)的至少一個(gè)引物在所述延伸的雙鏈體上進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。
全文摘要
本發(fā)明提供具有確定和有限的穩(wěn)定性的新結(jié)合對(duì)組合物，其包含用于均相、靈敏的分析物檢測(cè)的核酸檢測(cè)標(biāo)記。還提供分析物尤其是臨床相關(guān)性分析物的靈敏、均相檢測(cè)的方法。還提供制備本發(fā)明結(jié)合配對(duì)的試劑盒以及實(shí)施本發(fā)明方法的試劑盒。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK103146808SQ201210299560
公開(kāi)日2013年6月12日 申請(qǐng)日期2005年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月3日
發(fā)明者T·亞當(dāng)斯, E·雅布隆斯基 申請(qǐng)人:意力速分子診斷股份有限公司