專利名稱：：檢測對象的檢測、定量用試劑盒及檢測、定量方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及檢測對象的檢測、定量用試劑盒及檢測、定量方法。
背景技術：
：一直以來，作為檢測被檢體中的檢測對象的方法，4吏用膠乳凝集法。所謂膠乳凝集法，是檢測生物體樣品等流體中的抗原時，通過混合流體、和擔載有與抗原特異性結合的抗體或其片斷的膠乳，測定膠乳的凝集程度，來檢測或定量抗原的方法(例如，參照專利文獻l)。根據(jù)該膠乳凝集法，作為檢驗體添加的抗原使多個膠乳結合抗體交聯(lián)，促i^乳的凝集。這樣，由于程序筒單，因此能夠簡便且快速,測抗原。然而，抗原微量時，不易發(fā)生該交聯(lián)，因而膠乳不充分凝集。因此，難以檢測微量的抗原。為此，廣泛采用ELISA法或CLEIA法這樣的利用酶底物反應的方法。這些方法中，例如，使與抗原特異性結合的一次抗體與抗原結合，并使該一次抗體與具有酶的二次抗體結合。其中，通過添加酶底物，測定酶催化^^應的程度，來檢測或定量抗原。根據(jù)這些方法，例如如果使用發(fā)光試劑作為底物，則底物添加后的發(fā)光檢測靈敏度高，因此也能夠檢測微量的抗原。專利文獻l:特7〉昭58-11575號>^才艮
發(fā)明內容然而，在利用酶底物反應的方法中，必需要二次抗體、發(fā)光試劑、發(fā)光檢測裝置等特殊的試劑、儀器，作業(yè)成本高。此外，如圖10所示，該方法由對樣品和各試劑進行孵育的工序(ST110、ST130)、洗凈系統(tǒng)的工序(ST120)、測定發(fā)光的工序(ST140)等多個階段構成，操作復雜。而且，各個階段所需要的時間非常長，不適于大皿4處理。本發(fā)明是鑒于以上情況完成的，其課題之一是提供能夠快速、廉價且筒便地檢測、定量檢測對象的檢測、定量用試劑盒以及檢測、定量方法；進而，其課題之一是提供能夠高靈敏度地進行檢測、定量的檢測、定量用試劑盒以及檢測、定量方法。本發(fā)明人等發(fā)現(xiàn)，如果接近具有電荷的化合物，則會阻礙刺激響應性聚合物的凝集，從而完成了本發(fā)明。具體而言，本發(fā)明提供如下的內容。所述的試劑盒，其特征在于，第1物質含有孩嫩狀的磁性物質。所述的試劑盒，其特征在于，聚陽離子是聚烷基胺或聚乙烯亞胺。第1結合物通過將第1物質和第1親和性物質結合來制作。該結合方法沒有特別限定，例如在第l物質側(例如刺激響應性聚合物部分)和第1親和性物質(例如第1抗體)側的雙方，結合相互具有親和性的物質(例如抗生物素蛋白和生物素、谷胱甘肽和谷胱甘肽S轉移酶)，通過這些物質使第1物質和第1親和性物質結合。具體而言，生物素向刺激響應性聚合物的結合，如國際公開第01/09141號小冊子所記載，可以通過使生物素等與曱基丙烯基、丙烯基等聚合性官能團結合而形成加成聚合性單體，并與其他單體共聚來進行。此外，抗生物素蛋白等向第l親和性物質的結合可以依照常法進行。接著，混合生物素結合刺激響應性聚合物和抗生物素蛋白結合第1親和性物質，則通過抗生物素蛋白和生物素的結合，第1親和性物質和刺激響應性聚合物結合。作為另外的方法，可以利用在聚合物聚合時使具有羧酸、氨基或環(huán)氧基等官能團的單體與其他單體共聚，通過該官能團，根據(jù)本
技術領域：
中周知的方法使抗體親和性物質(例如、Melongel(少口7yA)、A蛋白、G蛋白)與聚合物結合的方法。通過4吏如此得到的抗體親和性物質與第l抗體結合，制作刺激響應性聚合物與對檢測對象抗原的第1抗體的第1結合物?；蛘?，可以在聚合物聚合時使具有羧酸、氨基或環(huán)氡基等官能團的單體與其他單體共聚，依照常法使對檢測對象抗原的第l抗體與這些官能團直接結合?；蛘?，可以使第1親和性物質和刺激響應性聚合物與狀的磁性物質結合。也可以將第l物質置于刺激響應性聚合物凝集的^Hf之后，通過離心分離進行分離，由此精制第l結合物。第1結合物的精制可以通過如下方法進行，即，使微粒狀的磁性物質與刺激響應性聚合物結合，進而使其與第1親和性物質結合后，施加磁力將磁性物質回收。微粒狀的磁性物質與刺激響應性聚合物的結合可以采用本
技術領域：
中周知的方法進行，即，通過反應性官能團進行結合的方法；在磁性物質中的多元醇上的活性氫或多元醇中導入聚合性不飽和鍵而進行接枝聚合的方法等(例如、參照ADV.Polym.Sci.、Vol.4、plll、1965;J.PolymerSci.、Part-A、3、p1031、1965)。接著，對使具有電荷的第2物質和對檢測對象抗原的第2抗體結合來制作第2結合物的方法進行描述。第2結合物通過將第2物質和第2親和性物質直接或間接結合來制作。沒有特別限定，例如，在第2物質側和第2親和性物質(例如第2抗體)側的雙方，結合相互具有親和性的物質(例如抗生物素蛋白和生物素、谷胱甘肽和谷胱甘肽S轉移酶)，通過這些物質^f吏第2物質和第2親和性物質間接結合。使第2物質和第2親和性物質直接結合時，可以通過官能團使其結合，例如，使用官能團時，可以依照Ghosh等人的方法(Ghoshetal:BioconjugateChem.、1、71-76、1990)的馬來酰亞胺-石危醇偶聯(lián)來結合。具體可以列舉以下兩種方法。在第1方法中，首先，在核酸的5'末端導入巰基(別名巰基)，另一方面，使6-馬來酰亞胺基己酸琥珀酰亞胺酯(例如"EMCS(商品名)"(同仁化學研究所社制))與抗體反應而導入馬來酰亞胺基。接著，將這兩種物質通過巰基和馬來酰亞胺基結合。在第2方法中，首先，與第1方法同樣地在核酸的5'末端導入巰基，在該巰基進一步與作為均二官能性試劑的N,N-1，2-亞苯基二馬來酰亞胺反應，由此在核酸的5'末端導入馬來酰亞胺基，另一方面，在抗體中導入巰基。接著，將這兩種物質通過巰基和馬來酰亞胺基而結合。此外，作為將核酸導入到蛋白質中的方法，已知例如在NucleicAcidsResearch第15巻5275頁(1987年)和NucleicAcidsResearch第16巻3671頁(1988年)中記載的方法。這些技術可以應用于核酸與抗體的結合。根據(jù)NucleicAcidsResearch第16巻3671頁(1988年)，首先,通過使寡核苷酸與胱胺、碳二亞胺和1-甲基咪哇反應，由此在寡核苷酸的5，末端的羥基中導入巰基。將導入有巰基的寡核苷酸精制后，使用二硫蘇糖醇進行還原，然后加入2,2，-二吡^二硫醚，由此在寡核苷酸的5，末端通過二硫鍵導入吡梵基。另一方面，對于蛋白質，事先使其與亞氨基四氫瘞吩反應而導入巰基。將這些導入有吡^二石危醚基的寡核苷酸和導入有巰基的蛋白質混合，使吡^&和巰基特異性地反應，從而使蛋白質和寡核苷酸結合。根據(jù)NulcldcAcidsReseach第15巻5275頁(1987年)，首先，事先12在寡核苷酸的3，末端導入氨基，并使其與作為均二官能性試劑的二硫—雙-丙酸-N-羥基琥珀酰亞胺酯(簡稱二硫-雙-丙?；狽HS)反應。反應后，通過添加二硫蘇糖醇將二硫-雙-丙醃基-NHS分子中的二硫醚鍵還原，并在寡核苷酸的3，末端導入巰基。對于蛋白質的處理，使用如特開平5-48100號公報所示那樣的雜二官能性交聯(lián)劑。首先，通過使蛋白質與具有能夠與蛋白質中的官能團(例如氨基)反應的第l反應性基團(琥珀酰亞胺基)、和能夠與巰基反應的第2反應性基團(例如馬來酰亞胺基等)的雜二官能性交聯(lián)劑反應，由此在蛋白質中導入第2反應性基團，制成預活化的蛋白試劑。將如此得到的蛋白試劑與硫醇化聚核苷酸的巰基共價結合。使用核酸以外的聚陰離子或聚陽離子時，可以通過在它們的末端等導入巰基，用與上述同樣的操作制作第2結合物。如此制造的試劑盒例如可以通過以下的方法用于檢測和/或定量檢測對象。<檢測方法>本發(fā)明的檢測方法包括如下工序首先將第l結合物、第2結合物和檢驗體混合，并置于刺激響應性聚合物凝集的條件下，判斷刺激響應性聚合物有無介歉。以下詳細說明程序。(混合、凝集)首先，在容器內將第l結合物和第2結合物混合，進而添加檢驗體，得到混合物。接著，將該混合物置于刺激響應性聚合物凝集的IHt下。這樣，檢測對象存在時，刺激響應性聚合物通過第2結合物中的電荷發(fā)生凝集阻礙而介歉，另一方面，檢測對象不存在時，刺激響應性聚合物沒有凝集阻礙地發(fā)生凝集。參照圖1~圖2說明該現(xiàn)象。如圖1所示，第1結合物10含有刺激響應性聚合物11,該刺激響應性聚合物11通過抗生物素蛋白15和生物素17與對檢測對象50的第1抗體13結合。此外，第1結合物10含有微粒狀的磁性物質19，在該磁性物質19的表面結合有刺激響應性聚合物11。另一方面，第2結合物20含有具有負電荷的第2物質21，該第2物質21與對檢測對象50的第2抗體23結合。第1抗體13和第2抗體23能夠在檢測對象50的不同部位同時與檢測對象50結合。如圖2所示，如果將第1結合物10、第2結合物20和檢驗體的混合物置于規(guī)定條件下，則檢測對象50存在時，刺激響應性聚合物11通過第2結合物20中的電荷發(fā)生凝集阻礙而^t(圖2(A))，另一方面，檢測對象50不存在時，刺激響應性聚合物11沒有凝集阻礙地發(fā)生凝集(圖2(B))。為了使刺激響應性聚合物凝集，例如使用溫度響應性聚合物時，將裝有混合液的容器轉移到溫度響應性聚合物凝集的溫度的恒溫槽即可。此外，使用pH響應性聚合物時，在裝有混合液的容器中加入酸溶液或堿溶液即可。使用光響應性聚合物時，對裝有混合液的容器照射能夠凝集聚合物的波長的光即可。另外，溫度響應性聚合物的凝集可以在第1結合物和第2結合物與檢測對象結合前進行，也可以同時并列進行，在能夠縮短處理時間方面考慮，優(yōu)選后者。但是，溫度響應性聚合物凝集的條件，與第1結合物和第2結合物與檢測對象結合的條件大為不同時，優(yōu)選前者。其中，最低臨界溶液溫度和最高臨界溶液溫度例如以下所示地確定。首先，將樣品裝入吸光光度計的比色池中，以lx:/分鐘的速度將樣品升溫。其間，記錄550nm處的透過率變化。其中，將聚合物溶解至透明時的透過率作為100%、將完全凝集時的透過率作為0%時，求出透過率達到50%時的溫度，作為LCST。(判定)有無M的判定例如可以通過目測或濁度測定來進行。濁度可以由光散射裝置測得的光透過率算出，如果濁度低則刺激響應性聚合物的凝集被阻礙，暗示檢測物質的存在。其中，使用的光的波長可以根據(jù)磁性物質的粒徑等適當設定，以便得到所需的檢測靈敏度。從可以利用以往通用的裝置方面考慮，光的波長優(yōu)選為可見光的范圍內(例如550nm)。目測或濁度測定可以在一定時刻斷續(xù)地進行，也可以經(jīng)時地連續(xù)進行。此外，也可以基于某時刻的濁度測定值與其他時刻的濁度測定值之差來進行判定。<定量方法>根據(jù)本發(fā)明的定量方法，首先，將第1結合物、第2結合物和檢驗體混合，并將該混合物置于刺激響應性聚合物凝集的規(guī)定條件下，接著，測定混合物的濁度，基于檢測對象的量與濁度在規(guī)定^下的關系式，算出檢驗體中的檢測對象的量。前半部分的程序與前述的檢測方法類似，因此省略說明。(關系式)制作與上述規(guī)定條件相同M下的、檢測對象的量與濁度的關系式。構成該關系式的檢測對象的量與濁度的測定，其數(shù)據(jù)越多則得到可靠性越高的關系式。于是，數(shù)據(jù)只要涉及2個以上檢測對象的量即可，優(yōu)選涉及3個以上檢測對象的量。其中，檢測對象的量與濁度的關系式，不僅是表示檢測對象的量與濁度的直接相關的式子，而且還可以是檢測對象的量與反映濁度的參數(shù)之間的關系式。(計算)將混合物的濁度測定值代入制作好的關系式中，由此可以算出檢驗體中的檢測對象的量。(分離)第l物質含有微粒狀的磁性物質時，本發(fā)明的檢測方法或定量方法優(yōu)選進一步含有通過施加磁力而將凝集的磁性物質分離的工序。由此，凝集的磁性物質從含有非凝集狀態(tài)的磁性物質的夾雜物中分離出來。因此，分離的磁性物質的量、分軟于溶劑時的光透過率等的測定值，排除了夾雜物的影響，更忠實地反映檢測物質的存在。磁力的施加可以使磁性物質接近磁石來進行。該磁石的磁力根據(jù)使用15的磁性物質所具有的磁力大小而不同。作為磁石，可以列舉例如MAGNA^^司制釹>^石。此外，磁力的施加可以在判定前或與判定同時并列地進行，從可以縮短工序所耗費的時間方面考慮，優(yōu)選同時進行。另外，如果施加磁力，則由于凝集的磁性物質以巻入夾雜物的方式被分離，因此推測分離后的混合物的濁度在夾雜物存在時反而變小。另夕卜，檢測方法或定量方法中的"濁度測定"，不僅包括直接測定濁度，還包括測定反映濁度的參數(shù)。作為所述M，可以列舉在多個時刻的濁度測定值的差異、所分離的凝集物量、分離后的非凝集物的濁度等。其中，多個時刻中的l點，例如，在檢測對象不存在的陰性對照中施加磁力時，優(yōu)選為濁度達到最大值的時刻附近。由此，與在另外時刻的濁度測定值之間的差異增大，可以更正確地定量檢測對象的量。(檢測對象)作為檢驗體中的檢測對象，可以列舉用于臨床診斷的物質，具體可以列#液、尿、吐的痰、糞便中等含有的人免疫球蛋白G、人免疫球蛋白M、人免疫球蛋白A、人免疫球蛋白E、人白蛋白、人纖維蛋白原(纖維蛋白及其分解產物)、a-甲胎蛋白(AFP)、C反應性蛋白(CRP)、肌紅蛋白、癌胎兒性抗原、肝炎病毒抗原、人絨毛膜促性腺激素(hCG)、人胎盤性催乳素(HPL)、HIV病毒抗原、變態(tài)反應原、細菌毒素、細菌抗原、酶、激素(例如人曱狀腺刺激激素(TSH)、胰島素等)、藥劑等。以下，對于檢測對象為抗原的情況，說明用于利用本發(fā)明方法的試劑盒的構成及其使用方法的例子。試劑盒例如由以下的試劑構成?？乖瓩z測用試劑盒試劑A:微粒狀的磁性物質和與檢測對象的抗原特異性地結合的第1抗體相結合的溫度響應性聚合物試劑B:識別與第l抗體不同的部位，并能夠與檢測對象的抗原同時結合的第2抗體相結合的、具有電荷的化合物試劑C:被測定物質的標準品(作為具體例，可以列舉精制抗原)。試劑D:稀釋用緩沖液(是用于稀釋上述試劑、并且能夠用于稀##:測定樣品的緩沖液，可以列舉TRIS鹽酸緩沖液、磷酸緩沖液等)此外，作為測定濁度的裝置，可以使用能夠將容器內保持在聚合物凝集的溫度、能夠照射200nm~卯Onm的透過光的以往周知的裝置。由上述試劑構成的試劑盒，例如可以按以下方法使用。首先，將5~IOOOjiL的試劑A和5~IOOOjiL的試劑B混合。準備在裝有試劑A和試劑B的溶液中(1)添加被測定物質的標準品而成的陽性對照、(2)什么都不添加的陰性對照、(3)添加^L檢液5~IOOOjiL的樣品，以聚合物^t的溫度(例如約0~30"C)使其反應一定時間。使用溫度響應性聚合物時，反應后，向保持在該聚合物的凝集溫度(例如42X:)的容器中加A^應液，照射550nm的透過光，測定濁度，進行有無抗原的判定或抗原的定量。作為與上述不同的^f吏用方法，可以4吏試劑A與上述(l)、(2)、和(3)以聚合物分歉的溫JL^應一定時間后，添加試劑B，反應一定時間后，向保持在凝集溫度的容器中加入反應液，照射550nm的透過光，測定濁度，進行有無抗原的判定或抗原的定量。實施例<實施例1>(第l結合物的制備)首先，將作為對檢測對象即人曱狀腺刺激激素(TSH)的第l親和性物質的抗體(克隆195小鼠、小鼠IgG、LeincoTechnology,Inc.制)，通過以往周知的sulfo-NHS-Biotin法(AsahiTechnoGlass>^>司)進行生物素化，制備生物素標記抗TSHp抗體。另一方面，取結合有鏈霉抗生物素蛋白的微粒狀磁性物質即Magnabeat公司制的Therma-MaxLSAStreptavidin(0.4質量％)250fiL到1.5mL微管中，將該微管加熱到42X:,使Therma-MaxLSAStreptavidin凝集，用磁石回收后，除去上清。向其中加入TBS緩沖液(20mMTris-HCl、150mMNaCl、pH7.5)250nL，進行冷卻從而使凝集物分散。向該分散液中加入溶解于PBS緩沖液(0.01M磷酸緩沖液、0.0027M氯化鉀、0.137M氯化鈉、pH7.4)中的生物素標記抗TSHp抗體50nL(0.75mg/mL),在室溫下顛倒混合15分鐘。將微管加熱到42匸使Therma-MaxLSAStreptavidin凝集，用>^石回收后，除去上清部分，將剩余的生物素標記抗TSHp抗體分離(B/F分離)。向其中加入TBS緩沖液250jiL，進行冷卻從而使凝集物*。接著，添加過量的生物素，將鏈霉抗生物素蛋白的生物素結合部位M后，將剩余的生物素分離(B/F分離)。進而，使其錄于含有0.5%(w/v)BSA(SIGMA公司制)、0.5%(w/v)Tween(注冊商標)20、10mMEDTA的PBS緩沖液(pH7.4)溶液中，由此制備第l結合物。(第2結合物的制備)首先，在作為對檢測對象即人甲狀腺刺激激素(TSH)的第2親和性物質的抗體(克隆176小鼠、小鼠IgG、LeincoTechnology,Inc.制、lmg/mL)lmL中加入2-5t基乙醇6mg，在37C反應120分鐘。反應后，通過Slide-A-Lyzer(商品名)透析盒、10KMWCO(Pierce)對PBS緩沖液500mL進行透析，除去過剩的2-巰基乙醇，使用截留分子量為10000的超濾膜(MILLIPORE公司制[AmiconUltra-4Ultracel10k])濃縮到0.5mL,得到小鼠抗TSHa抗體的還原抗體。將該還原抗體0.5mL和IOOjiL馬來酰亞胺化聚丙烯酸鈉(將33mg溶解于PBS緩沖液lmL中而成)在4C反應1晚，接著，使用Superdex-20010/300GL(GEHealthcare公司制)進行凝膠過濾，由此制^標記抗體。將該標記抗體(該抗體也稱為聚丙烯酸抗TSHa抗體結合物)用0.5%(w/v)BSA(SIGMA公司制)、0.5%(w/v)Tween(注冊商標)20/PBS(pH7.4)、10mMEDTA的7jC溶液稀釋到蛋白質濃度為4照/mL,由此制備第2結合物。另外，上述馬來酰亞胺化聚丙烯酸鈉如下制備。首先，在帶有氮氣導入管、溫度計和攪拌裝置的100mL三頸瓶內，將丙烯酸(和光純藥工業(yè)社制)2g、2-氨基乙硫醇(和光純藥工業(yè)社制)0.021g和偶氮雙異丁腈(和光純藥工業(yè)社制)0.023g溶解于N，N-二曱基曱酰胺50mL中，進行氮置換l小時。然后，在70t:進行聚合反應7小時。將得到的反應液減壓濃縮到10mL，用二乙基醚進行再沉淀，直到粘稠狀物形成粉狀。將白色沉淀過濾，進而用真空干i^L干躁l晚，由此得到M末端聚丙烯酸(產量1.5g)。接著將Jl^末端聚丙烯酸進行馬來酰亞胺化。在帶有氮氣導入管和攪拌裝置的50mL梨形瓶中加入41^末端聚丙烯酸0.5§和N,N-二曱基曱酰胺10mL并進行溶解。向其中加入EMCS(N-(6-馬來酰亞胺己酰氧)琥珀酰亞胺)(同仁化學研究所社制)3mg，反應一晚。將得到的反應液減壓濃縮到lmL，用二乙基醚進行再沉淀，直到粘稠物形成粉狀。將白色沉淀過濾，進而用真空干膝k干躁l晚，得到馬來酰亞胺基末端聚丙烯酸。分子量約為130000(TOSOH公司制、TSKgdSuperAW3000、6mmID.xl50mm、流動相0.1M硝酸鈉)，產量為0.4g。(才羊品的制備)將人曱狀腺刺激激素(TSBAspenBioPharma,Inc.制、活性8.5IU/mg、WHO80/558)溶解于PBS緩沖液(pH7.4)中，使得濃度為30ng/mL。將該溶液用VITROSTSHCalibrator1(TSH:OmlU/L、OrthoClinicalDiagnostics公司制)分別稀釋到0.06mIU/L、0.0012mIU/L，作為樣品。將上述的第l結合物、第2結合物和樣品*在4€的暗室內，l天l次連續(xù)3天用同樣的程序進行濁度測定。將其結果示于表l。Zl0—600zlo—ioooZl600-1000平均CV(%)平均CV(%)平均CV(%)0.0mlU/L0.56163.60.35093.80.91244.30.0012mlU/L0.43764.50.23974.90.67735.8如表1所示，在3天的任一時刻，CV(變動系數(shù))都為5.8以下的低20值。由此確認，只要是實施例的體系就可以獲得高再現(xiàn)性。<實施例2>除了在分光光度計用SEMIMICROCELL71的光路外不安裝釹永久磁石73(西興產業(yè)社制)之外，用與實施例1同樣的程序，測定TSH量為零的樣品的濁度。將其結果與實施例1的TSH量為零的樣品的濁度一并示于圖9。如圖9所示，直到約600秒，實施例1和2的濁度大致相等，實施例2的濁度在約600秒以后達到飽和。其結果是，在直到約600秒的時間內，即使不施加磁力也能夠以一定高靈敏度進行檢測或定量，以更高靈敏度進行檢測或定量時，暗示應利用施加磁力后在約600秒的測定值與在其后的時刻的測定值之間的差異。對于上述樣品，用各種體系測定TSH量。由其結果推定的M系的檢測限值示于表2。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>如表2所示，在以往的體系中，檢測限值為0.0025~0.005mIU/L。由此確認，在0.0012mlU/L也能檢測的實施例，與以往的體系相比，檢測靈敏度格外的高。并且，由于在任何時刻都依賴于TSH的量，濁度存在差異，因此可以在檢驗體中的TSH檢測中使用。1000秒以內的檢測時間與耗費約38分鐘的以往技術(參照圖10)相比，非常短。此外，對實際的檢驗體僅進行以上的ST10和ST20的操作，就能夠檢測或定量檢測物質，因此程序筒便。也就是說，本發(fā)明是不利用酶底物反應地測定濁度的體系，因此程序簡便的同時，與以往的體系相比具有格外高的檢測靈敏度，而且顯示出具有能夠在短時間內完成檢測、定量的劃時代的效果。<實施例3>(含有生物素的聚(N-異丙基丙烯酰胺)的合成)在帶有氮氣導入管、溫度計和攪拌裝置的200mL三頸瓶內，將N-異丙基丙烯酰胺13.6g、生物素單體〔N-生物素基-N，-曱基丙烯?；齺啎趸０贰?.42g、2-氨基乙硫醇(和光純藥工業(yè)社制)0.2g和偶氮雙異丁腈0.2g溶解于曱醇100mL中，進行氮置換30分鐘。然后，在70'C下進行聚合反應7小時。將得到的反應液減壓濃縮，將得到的固體溶于丙酮，用二乙基醚進行再沉淀。將白色沉淀過濾，進而用真空干躁機干躁l晚，由此得到含有生物素的聚(N-異丙基丙烯酰胺)U.84g。得到的含有生物素的聚(N-異丙基丙烯酰胺)的分子量約為2卯00(ShodexGPCLF-804、8mmID.x300mm、流動相THF)。另外，生物素單體〔N-生物素基-N，-甲基丙烯?；齺喖谆０贰车闹苽涫褂锰亻_2005-82538號公報中記載的方法，如下進行。將N-(3-M丙基)甲基丙烯酰胺鹽酸鹽18g、生物素24g和三乙基胺30g溶解于300ml的N，N—二甲基甲酰胺(DMF)中，冷卻到0*C。用1小時向該混合物中滴加將二苯基砩酰疊氮化物28g溶解于50ml的dmf中而成的溶液。滴加結束后，在or;攪拌3小時，進而在室溫(2ox:)攪拌12小時。然后，在減壓下，餾去溶劑，使用氯仿-甲醇混合溶劑，用柱色譜法精制，得到N-生物素基-N，-甲基丙烯it^三亞甲基酰胺。(鏈霉抗生物素蛋白結合N-異丙基丙烯酰胺的制備)將含有生物素的聚(N—異丙基丙烯酰胺)100mg溶解于TBS緩沖液10mL中，制成0.1%(w/v)。在0.1%(w/v)的含有生物素的聚(N-異丙基丙烯酰胺)3mL中，添加以濃度為10mg/mL的方式溶解于精制水(用MILLIPORE公司制Direct-Q(商品名)精制的水)中而得的鏈霉抗22生物素蛋白(和光純藥工業(yè)社制)15nL，在水上靜置30分鐘使其反應，由此得到鏈霉抗生物素蛋白結合聚(N-異丙基丙烯酰胺)的TBS溶液。(小鼠抗TSHa抗體結合聚(N-異丙基丙烯酰胺)的制備)在鏈霉抗生物素蛋白結合聚(N—異丙基丙烯酰胺)的TBS溶液625nL中，添加IOOjiL生物素標記小鼠抗TSHa抗體(將從COSMOBIO^^司(商品號T103)購買的小鼠抗TSHa抗體(LeincoTechnology,Inc.制)用sulfo—NHS—Biotin法(AsahiTechnoGlass公司)進行生物去化而得)，在水上靜置30分鐘使其反應，得到小鼠抗TSHa抗體結合聚(N-異丙基丙烯酰胺)的TBS溶液。(聚丙烯酸抗TSHp抗體結合物的制備)除了使用小鼠抗TSHp抗體來代替小鼠抗TSHa抗體之外，用與實施例2同樣的程序制備聚丙烯酸抗TSHp抗體結合物。(利用抗TSHa抗體結合聚(N—異丙基丙烯酰胺)—聚丙烯酸抗TSHP抗體結合物的TSH檢測)準備裝有小鼠抗TSHa抗體結合聚(N-異丙基丙烯酰胺)TBS溶液25jiL的1.5mL管4才fUa、b、c和d)。向各管中添加VITROSTSHCalibrator1(OrthoClinicalDiagnostics公司制、商品號065002)5jiL和各濃度TSH的TBS溶液lOjiL(a的TSH濃度為0、b的TSH濃度為0.001ngVL、c的TSH濃度為0.01ng/nL、d的TSH濃度為O.lng/jiL)的混合物，進而加入TBS緩沖液165nL，在水上靜置5分鐘。然后，向各管中添加聚丙烯酸抗TSH(5抗體結合物5jiL，將在冰上靜置30分鐘后的物質作為測定樣品。在恒溫槽中將分光光度計UVmini(島津制作所社制)的比色池支架保持在31.5C。將沒有^JV樣品的石英比色池(QS，Hella,光路長10mm)置于比色池支架，靜置5分鐘。然后，在石英比色池內添加管a中的測定樣品200jiL，6分鐘后測定吸光度。對于管b~d中的樣品，也用同樣程序測定吸光度。吸光度的結果是，a為0.216、b為0.199、c為0.176、d為0.168。由以上結果可知，吸光度隨著TSH的濃度而變化，換言之，通過測定吸光度就可以定量TSH的濃度。也就是說，確i^本發(fā)明的方法是無需二次抗體、發(fā)光試劑、發(fā)光檢測裝置等特殊的試劑、儀器，就能夠快速、廉價并筒便地險測、定量檢測對象的新方法。權利要求1、一種試劑盒，其特征在于，用于檢測和/或定量檢測對象，含有第1結合物和第2結合物，第1結合物含有刺激響應性聚合物的第1物質和對所述檢測對象的第1親和性物質相結合的結合物，第2結合物具有電荷的第2物質和對所述檢測對象的第2親和性物質相結合的結合物，第1親和性物質和第2親和性物質能夠在所述檢測對象的不同部位同時與所述檢測對象結合。2、根據(jù)權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，第1物質含有微粒狀的磁性物質。3、根據(jù)權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，第2物質是親水性的高分子化合物。4、根據(jù)權利要求1~3中任一項所述的試劑盒，其特征在于，第2物質是聚陰離子或聚陽離子。5、根據(jù)權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，聚陰離子是核酸或聚丙烯酸。6、根據(jù)權利要求4所述的試劑盒，其特征在于，聚陽離子是，基胺或聚乙烯亞胺。7、一種檢測檢驗體中的檢測對象的方法，其特征在于，包括如下工序將第1結合物、第2結合物和所述檢驗體混合，置于刺激響應性聚合物凝集的條件下，判斷所述刺激響應性聚合物有無介軟，所述第1結合物為含有刺激響應性聚合物的第1物質和對所述檢測對象的第1親和性物質相結合的結合物，所述第2結合物為具有電荷的第2物質和對所述檢測對象的第2親和性物質相結合的結合物，第1親和性物質和第2親和性物質能夠在所述檢測對象的不同部位同時與所述檢測對象結合。8、根據(jù)權利要求7所述的方法，其特征在于，第l物質含有微粒狀的磁性物質，所述方法還包括通過施加磁力而將凝集的磁性物質分離的工序。9、一種定量檢驗體中的檢測對象的方法，其中，包括如下工序將第1結合物、第2結合物和所述檢驗體混合，將該混合物置于刺激響應性聚合物凝集的條件下，所述第1結合物為含有刺激響應性聚合物的第1物質和對所述檢測對象的第1親和性物質相結合的結合物，所述第2結合物為具有電荷的第2物質和對所述檢測對象的第2親和性物質相結合的結合物，測定所述混合物的濁度，基于所述檢測對象的量與濁度在所述規(guī)定條件下的關系式，算出所述檢驗體中的檢測對象的量。10、根據(jù)權利要求9所述的方法，其特征在于，第l物質含有微粒狀的磁性物質，所述方法還包括通過施加磁力而將凝集的磁性物質分離的工序。全文摘要本發(fā)明提供能夠快速、廉價并簡便地檢測、定量檢測對象的檢測、定量用試劑盒以及檢測、定量方法。檢測檢驗體中的檢測對象的試劑盒，含有第1結合物和第2結合物，該第1結合物為含有刺激響應性聚合物的第1物質和對檢測對象的第1親和性物質相結合的結合物，該第2結合物為具有電荷的第2物質和對檢測對象的第2親和性物質相結合的結合物。第1親和性物質和第2親和性物質能夠在檢測對象的不同部位同時與上述檢測對象結合。文檔編號G01N33/553GK101479604SQ20078002359公開日2009年7月8日申請日期2007年6月28日優(yōu)先權日2006年6月30日發(fā)明者大西德幸,杉田悟,松井景明,長岡宏一申請人:智索股份有限公司;奧索臨床診斷股份有限公司