專利名稱：利用熒光成像觀測人工皮膚生長過程的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及觀測人工皮膚生長過程的方法，特別是涉及一種利用熒光成像觀測人工皮膚 生長過程的方法。
背景技術(shù)：
近年來人們研究發(fā)現(xiàn)體外重建的人工皮膚可以替代動物或人體皮膚而進(jìn)行相關(guān)的試驗(yàn)， 如Sanz Garcia S等人用人工皮膚研究生物制劑對表皮生長的作用(Scand J Plast Reconstr Surg Hand Surg， 2000; 34 (3) : 199-206); Hoffmann J 等人用人工皮膚檢測和鑒別化學(xué)物 質(zhì)對皮膚的腐蝕作用(Toxicol In Vitro， 2005; 19(7) :925-929); Amano S等人利用人工皮膚 模擬皮膚的光老化過程(Br J Dermatol, 2005， 153(2) :37-46); Hada N等人利用人工皮膚作 為四環(huán)素和氯霉素的經(jīng)皮給藥系統(tǒng)，顯示抗生素處理過的人造皮膚，可預(yù)防皮膚的二次感染 ，人工皮膚可作為一種新的體外經(jīng)皮給藥系統(tǒng)模型(J Control
Release, 2005; 108 (2-3) :341-350)。由于人工皮膚提供了進(jìn)行該方面研究和應(yīng)用的良好替代 平臺，因此具有較大的實(shí)際應(yīng)用前景。
在醫(yī)學(xué)臨床中，患者皮膚損傷或燒傷后所進(jìn)行的皮片移植有助于創(chuàng)面修復(fù)。這個修復(fù)過 程包括移植皮片邊緣的角質(zhì)形成細(xì)胞分裂增殖，向創(chuàng)面移行，最后覆蓋創(chuàng)面，新生表皮完成 修復(fù)和重塑的過程。這一過程涉及到皮膚的再生和發(fā)育，對這一過程的了解可以幫助人們認(rèn) 識與皮膚發(fā)育和修復(fù)相關(guān)的諸多問題，有助于了解各種理化因素對組織修復(fù)的影響，尋找傷 口愈合的新藥。 一般新藥研究比較復(fù)雜，研制過程須多個步驟，以往多采用動物或人進(jìn)行藥 物的篩選、毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)、以及生理功能研究等，這時需要大量的動物和人體皮膚進(jìn)行不同濃 度的重復(fù)試驗(yàn)。這樣，往往會導(dǎo)致人或動物的損傷，甚至導(dǎo)致動物死亡。多年來人們期望在 體外建立一種人工皮膚損傷修復(fù)模型，以便用這個模型對影響皮膚生長的各種因素(如細(xì)胞 因子、激素、物理因素及各種藥物等)進(jìn)行量化評估。
但是，由于技術(shù)的限制，尚無理想的方法客觀測量人工皮膚的生長。1986年Coulomb B 等人曾用染料染色人工培養(yǎng)的皮膚組織，觀察皮膚的生長(Br J Dermatol 1986; 114(1) :91-101)。該方法的缺點(diǎn)是染料對細(xì)胞生長有影響，難以準(zhǔn)確反映新生皮膚的 生長過程。另外他們選用混合膠原凝膠作真皮替代物，這種皮膚替代物也存在明顯的不足即 膠原凝膠會嚴(yán)重收縮，導(dǎo)致表皮生長受影響。后來，申請人曾用二乙酸熒光素結(jié)合熒光顯微
成像和圖像分析技術(shù)，以人的去表皮真皮組織(HDED)作為真皮替代物初步建立了一種客觀量 化重建皮膚生長的方法(陸洪光等，中華皮膚科雜志2005; 38 (12) :738-741)。 二乙酸熒光素 是一種細(xì)胞染色用熒光色素，為活細(xì)胞指示劑，廣泛應(yīng)用于動植物細(xì)胞活力的標(biāo)記及檢測 (Hassan M:Biotechnol Bioeng. 2002 ; 80 (6) :677-84)。但是在實(shí)際應(yīng)用中發(fā)現(xiàn)經(jīng)二乙酸熒 光素染色的人工皮膚熒光時間維持較短，時間長了以后熒光圖像易出現(xiàn)模糊，不利于較長時 間對人工皮膚生長過程的觀察。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，提供一種圖像清晰、熒光持續(xù)時間更久的利用熒光成像 來觀測人工皮膚生長過程的方法，該方法利于對人工皮膚的生長過程進(jìn)行連續(xù)性觀察并隨時 同步攝像，從而記錄、量化人工重建皮膚的生長速率。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用如下的方法利用熒光成像技術(shù)來觀測人工皮膚的生 長過程
在人工皮膚的培養(yǎng)過程中，需要觀測人工皮膚的生長情況時，吸去人工皮膚的培養(yǎng)液， 在人工皮膚表面滴加5 —氯甲基二乙酸熒光素，然后移至熒光顯微鏡下觀察，新生人工皮膚 呈蘭綠色熒光，以蘭綠色熒光判斷人工皮膚的生長情況，觀測人工皮膚的生長情況后，吸去 5 —氯甲基二乙酸熒光素，加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。
其中，5 —氯甲基二乙酸熒光素是濃度為2. 4mM的5 —氯甲基二乙酸熒光素的二甲基亞砜 溶液。
為了能真實(shí)地反映皮膚的生長過程，所用到的人工皮膚最好采用如下的方法制備將皮 片的真皮面涂上混合組織膠并表皮部分向上、真皮部分向下地置于去表皮真皮組織上，所述 混合組織膠是用體積比為l: 1: l的膠原膠、氨甲環(huán)酸和凝血酶新鮮配制的。
發(fā)明人對5—氯甲基二乙酸熒光素的熒光成像的時效和其對人工皮膚生長過程的影響進(jìn) 行了研究，具體如下
實(shí)驗(yàn)一、二乙酸熒光素和5 —氯甲基二乙酸熒光素?zé)晒獬上竦谋容^
將二乙酸熒光素150y l滴加至人工皮膚表面，將同體積的濃度為2.4yM的5 —氯甲基二 乙酸熒光素滴加至另一人工皮膚表面，分別移到熒光顯微鏡下觀察，記時觀察人工皮膚的熒 光圖像，15秒鐘后分別經(jīng)兩種熒光素處理的人工皮膚均出現(xiàn)熒光圖像，5分鐘時最為清晰， 清晰圖像保持15分鐘，經(jīng)二乙酸熒光素處理的熒光圖像30分鐘后出現(xiàn)模糊，而5-氯甲基二乙 酸熒光素處理的熒光圖像在30分鐘后依然清晰，輪廓清楚，圖像于l小時后邊緣才開始模糊 ，盡管熒光圖像隨時間的延長熒光強(qiáng)度逐漸減低，但是72小時后仍可見5-氯甲基二乙酸熒光
素處理的熒光圖像。說明5 —氯甲基二乙酸熒光素的成像效果和持續(xù)時間均優(yōu)于二乙酸熒光素。
實(shí)驗(yàn)二、 5 —氯甲基二乙酸熒光素對人工皮膚生長的影響
實(shí)驗(yàn)分5 —氯甲基二乙酸熒光素組和溶劑二甲基亞砜組每組12個人工皮膚標(biāo)本進(jìn)行器 官培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)10天。
5 —氯甲基二乙酸熒光素組在連續(xù)性培養(yǎng)的第3天，第5天，第7天及第10天加熒光素攝 取人工皮膚熒光圖像并計算新生皮膚生長面積；二甲基亞砜組作為對照組，于培養(yǎng)的第3天 ，第5天，第7天加同劑量的二甲基亞砜并于第10天加二乙酸熒光素后攝像并計算新生皮膚生 長面積。統(tǒng)計學(xué)顯示于培養(yǎng)的第10天，5-氯甲基二乙酸熒光素組新生皮膚生長面積為21.97 ±5. 03mm2 、 二甲基亞砜組為23. 37±2. 36mm2，兩組比較無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0. 05)。
結(jié)論5 —氯甲基二乙酸熒光素處理的人工皮膚熒光圖像更加清晰，輪廓清楚，在人工 皮膚生長的連續(xù)性培養(yǎng)過程中，熒光圖像維持時間較長，有利于人工皮膚生長情況的觀察， 并且5—氯甲基二乙酸熒光素作為一種活細(xì)胞指示劑不會影響人工皮膚的生長。
與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明采用5 —氯甲基二乙酸熒光素作為熒光成像物質(zhì)來觀測人工皮 膚的生長過程，其成像更加清晰，輪廓清楚，并且熒光圖像的維持時間更長，而且，5 —氯 甲基二乙酸熒光素作為活細(xì)胞指示劑不會影響人工皮膚的生長。此外，該方法還具有過程穩(wěn) 定、易操作以及重復(fù)性強(qiáng)的特點(diǎn)，便于量化檢測各種因素(尤其是藥物)對皮膚生長的影響 和調(diào)控等。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l:
表皮皮片的制備取整形外科切除的正常皮膚，置于超凈工作臺，自然平展標(biāo)本，用
2mm活檢器取樣。然后將取下的皮片放于盛有PBS的平皿中，在解剖顯微鏡下用剪刀小心去除 皮下組織及深層真皮組織，保留淺層真皮組織，即得表皮皮片。
去表皮真皮組織的制備取整形外科切除的皮膚標(biāo)本，常規(guī)消毒，在超凈工作臺中，在 解剖顯微鏡下修剪至2. 5mm厚，用10mm的活檢器取材，將取下的標(biāo)本浸于PBS中，然后置于56 。C的水浴箱中30min，取出后將表皮與真皮分離，將真皮部分置于平皿中室溫下約lh將其涼 干，然后放置于聚乙烯塑料瓶中，加一滴DMS0，封閉瓶蓋，迅速置入液氮(-12(TC -16CTC )中5 7min，取出后于室溫放置30min，然后再置入液氮中。這樣連續(xù)反復(fù)10個循環(huán)，得到 含有基底膜成分的三維基質(zhì)材料，即人的去表皮真皮組織(HDED)。
人工皮膚的構(gòu)建為使人工皮膚組織能夠在空氣一液面狀態(tài)下培養(yǎng)，將70um目篩細(xì)胞
過濾器(cell strainer)修剪成培養(yǎng)支撐架，其方法是剪去過濾器周邊的尼龍膜，將保 留的四只腿修成5mm高，然后放入6孔的培養(yǎng)皿孔中，這樣，培養(yǎng)液能夠通暢地穿過細(xì)胞過 濾器的孔篩，并保障皮膚組織在接觸空氣的液面生長。接種時，將表皮皮片的真皮面涂上混 合組織膠并表皮部分向上、真皮部分向下地置于去表皮真皮組織上，去表皮真皮組織放置在 支撐架上，所述混合組織膠是用體積比為l: 1: l的膠原膠、氨甲環(huán)酸和凝血酶新鮮配制的 。人工皮膚于37'C、 5 7。C02環(huán)境中進(jìn)行空氣一液面培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)10天左右，可以觀察到新 生表皮細(xì)胞分裂、增殖、在HDED上移行生長，直至新生表皮覆蓋整個HDED，在體外完成重建 皮膚修復(fù)和整塑過程，在整個連續(xù)性培養(yǎng)過程中，人工皮膚24 48小時需換培養(yǎng)液一次。這 里所用到的培養(yǎng)液是以DMEM: F12的體積比為3: l的比例配制的，其中，胰島素的含量為5y g/ml，腺嘌磷的含量為O. 18mM，氫化考的松的含量為O. 5 y g/ml，霍亂弧菌毒素的含量為 10—1QM，鏈霉素的含量為IOO yg/ml，青霉素的含量為100U/ml，非必需氨基酸的含量為1% ，胎牛血清的含量為10%。由于內(nèi)含較高營養(yǎng)和誘導(dǎo)皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞的生長成分，該培養(yǎng) 基利于皮膚表皮組織的培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康模稍诨A(chǔ)培養(yǎng)基中加入其它成分。
人工皮膚生長過程的觀測在人工皮膚的培養(yǎng)過程中，需要觀測人工皮膚的生長情況時 ，吸去人工皮膚的培養(yǎng)液，在人工皮膚表面滴加濃度為2.4uM的5 —氯甲基二乙酸熒光素的 二甲基亞砜溶液，然后移至熒光顯微鏡下觀察，新生人工皮膚呈蘭綠色熒光，以蘭綠色熒光 判斷人工皮膚的生長情況，并用數(shù)碼相機(jī)攝像。攝像后用吸管吸去5 —氯甲基二乙酸熒光素 溶液，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。
對人工皮膚生長模型的組織學(xué)檢査
1、 常規(guī)石蠟切片4%甲醛溶液固定標(biāo)本，4'C過夜，梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟 ，包埋，石蠟連續(xù)切片，4ym，烘干。
2、 蘇木素-伊紅染色將組織切片先后浸于二甲苯，100%、 95%、 70%酒精中脫蠟。蘇木 素浸染5min，流水沖洗，伊紅酒精染色片刻，流水沖洗，選片，70%、 95%、 100%酒精分化， 5分鐘/次。烘干后封片。
3、 透射電鏡觀察將組織用二甲苯脫蠟，酒精脫蠟，PBS浸泡，鋨酸固定，丙酮逐級脫 水一Epon812浸泡，環(huán)氧樹脂包埋劑與100%丙酮1:1比例浸泡24小時，用Epon812環(huán)氧樹脂包 埋劑包埋，修塊機(jī)修塊定位，超薄切片機(jī)切片，醋酸鈾、硝酸鉛雙重染色，投射電鏡觀察。
組織學(xué)檢測結(jié)果如下
蘇木素-伊紅染色觀察到重建皮膚的組織結(jié)構(gòu)，新生表皮由基底層、棘細(xì)胞層、顆粒細(xì) 胞、角質(zhì)細(xì)胞層組成。表皮與其下的真皮替代物(HDED)犬牙交錯，表皮突呈高低不平的乳
頭狀伸入真皮。透射電鏡觀察到重建皮膚的基底層與真皮連接處的纖維絲狀結(jié)構(gòu)，與真皮的 彈力纖維緊密相連。表皮細(xì)胞漿中可見成束排列的張力細(xì)絲，相鄰棘細(xì)胞間可見突起的橋粒 結(jié)構(gòu)。組織學(xué)檢測結(jié)論如下本發(fā)明人工皮膚損傷修復(fù)模型的組織學(xué)發(fā)育與正常人皮膚組織結(jié) 構(gòu)基本一致。 實(shí)施例2:本實(shí)施例提供利用熒光成像觀測人工皮膚生產(chǎn)過程的方法的一個應(yīng)用實(shí)例。 用于檢測細(xì)胞因子(表皮生長因子抑制劑)對人工皮膚的生長面積和生長速率的影響如下已往研究證明，表皮生長因子對皮膚生長有促進(jìn)作用，而近來正在研究和開發(fā)的表皮生長因子抑制劑(EGF rec印tor tryrosine kinase inhibitor)對皮膚生長的作用尚待研究 。發(fā)明人用本發(fā)明方法研究了EGF對人工皮膚生長面積和生長速率的影響。方法是在基礎(chǔ)培 養(yǎng)基中加入10ul表皮生長因子抑制劑(濃度為luM，以二甲基亞砜為溶劑)，以基礎(chǔ)培養(yǎng) 基中加入10yl二甲基亞砜為對照，用上述方法進(jìn)行人工皮膚培養(yǎng)，連續(xù)培養(yǎng)10天，并以5-氯甲基二乙酸熒光素染色人工皮膚的生長，用圖像分析軟件計算新生皮膚生長熒光面積(" r2)，并計算其新生皮膚生長速率。結(jié)果顯示10天后加入表皮生長因子抑制劑的新生皮膚生 長面積為15. 29±2. 33mm2，對照組為21. 18±3. 15mm2，有統(tǒng)計學(xué)差異(p〈0. 05)。加入表皮 生長因子抑制劑的新生皮膚生長速率為O. 063mm2/h，不加表皮生長因子抑制劑的新生皮膚生 長速率為O. 088mm2/h，說明表皮生長因子抑制劑對皮膚生長有抑制作用。
權(quán)利要求
1.一種利用熒光成像觀測人工皮膚生長過程的方法，其特征在于在人工皮膚的培養(yǎng)過程中，吸去人工皮膚的培養(yǎng)液，在人工皮膚表面滴加5-氯甲基二乙酸熒光素，然后移至熒光顯微鏡下觀察，新生人工皮膚呈蘭綠色熒光，以蘭綠色熒光判斷人工皮膚的生長情況，觀測人工皮膚的生長情況后，吸去5-氯甲基二乙酸熒光素，加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用熒光成像觀測人工皮膚生長過程的方法在人工皮膚的培養(yǎng)過程中，需要觀測人工皮膚的生長情況時，吸去人工皮膚的培養(yǎng)液，在人工皮膚表面滴加5-氯甲基二乙酸熒光素，然后移至熒光顯微鏡下觀察，新生人工皮膚呈蘭綠色熒光，以蘭綠色熒光判斷人工皮膚的生長情況，觀測人工皮膚的生長情況后，吸去5-氯甲基二乙酸熒光素，加入培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。本發(fā)明采用5-氯甲基二乙酸熒光素作為熒光成像物質(zhì)來觀測人工皮膚的生長過程，其成像更加清晰，輪廓清楚，并且熒光圖像的維持時間更長，而且，5-氯甲基二乙酸熒光素作為活細(xì)胞指示劑不會影響人工皮膚的生長。此外，該方法還具有過程穩(wěn)定、易操作以及重復(fù)性強(qiáng)的特點(diǎn)。
文檔編號G01N21/64GK101158646SQ200710202748
公開日2008年4月9日 申請日期2007年11月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月29日
發(fā)明者陸洪光 申請人:陸洪光