專利名稱：：快速檢測陰道毛滴蟲的免疫層析試條及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種診斷試條，具體是快速檢測陰道毛滴蟲的免疫層析試條及制備方法。技術(shù)背景陰道毛滴蟲(Trichomonasvaginalis,T.u)是一種寄生于男女泌尿、生殖道的鞭毛蟲，可引起滴蟲性陰道炎、前列腺炎和尿道炎等多種生殖系統(tǒng)疾病。滴蟲病是常見的性傳播疾病(STD)，該病呈全球分布，人群普遍易感。此病也與男性不育有關(guān)。除引起泌尿生殖道感染外，T.u也是HIV感染和誘發(fā)宮頸癌的危險因素之一。目前國內(nèi)外臨床常規(guī)檢査方法有生理鹽水涂片法、培養(yǎng)檢測法及免疫學方法(如ELISA、直接熒光抗體試驗(DFA)、乳膠凝集試驗(LAT)等)等。生理鹽水涂片法(濕片法)簡便易行，但該法只能檢測活蟲，蟲體易與白細胞相混淆，檢測結(jié)果與操作人員技術(shù)熟練程度有關(guān)，檢出率僅為35%80%。而培養(yǎng)檢測法有利于提高檢出率，但檢測周期較長，一般需要27d(天)。免疫學方法雖然敏感性高，但操作較繁瑣。PCR技術(shù)檢測陰道毛滴蟲雖具有較高的敏感性和特異性，但容易出現(xiàn)假陽性或假陰性反應。因此有必要研制一種特異性強、靈敏度高、簡便快速、不易出現(xiàn)假陽性或假陰性反應的滴蟲病診斷方法。而近年來發(fā)展起來的膠體金免疫層析檢測技術(shù)具有特異性強、靈敏度高、簡便快速、不易出現(xiàn)假陽性或假陰性反應的特點。膠體金免疫層析檢測技術(shù)通常采用試條檢測方式。試條一般包括襯板和設(shè)置在襯板上依次搭接的樣品墊層、噴有金標單抗的結(jié)合墊層、NC膜及吸水層，將試紙條浸入待檢標本，標本中抗原與結(jié)合墊中的金標單抗結(jié)合后形成抗原抗體復合物，通過層析運動到NC膜上，與包被單抗發(fā)生反應，形成雙抗體夾心復合物，出現(xiàn)紅色可見條帶，達到檢測目的。目前尚無用于快速檢測陰道毛滴蟲的免疫層析試條。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于為克服現(xiàn)有技術(shù)的不足而提供一種特異性強、靈敏度高、簡便快速、不易出現(xiàn)假陽性或假陰性反應的快速檢測陰道毛滴蟲的免疫層析試條及制備方法。本發(fā)明為達到上述目的所采用的技術(shù)解決方案如下一種快速檢測陰道毛滴蟲的免疫層析試條及制備方法，包括襯板和設(shè)置在襯板上依次搭接的樣品墊層、噴有金標單抗的結(jié)合墊層、噴有包被點膜單抗和羊抗鼠二抗的NC膜及吸水層，其特征在于所述的金標單抗為膠體金標記的單克隆抗體AP33中的一株，所述點膜單抗為單克隆抗體AP33中的另一株。制備試條的方法包括以下步驟1)單抗的純化雜交瘤細胞培養(yǎng)上清和腹水，用孔徑為0.22ym的微孔濾膜過濾，除去較大的凝塊及脂肪滴，然后分別依次用50%、33%飽和硫酸銨沉析l次，再通過蛋白A親和層析柱收集、合并洗脫液中含蛋白的部分，然后將其置于O.Olmol/LPB或O.01mol/LPBS或0.Olmol/LTris-HC1中透析，換液3-5次，4""C條件下9000-12000r/min離心lh，除去聚合物，得到純化好的單抗，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；2)膠體金的制備取0.0P/。HAuCl4水溶液100ml，加入1%檸檬酸三鈉l-2ml，加熱煮沸使溶液由藍逐漸變?yōu)樽霞t色，直至變紅，即為膠體金溶液，并用紫外分光法確定膠體金最大吸收峰；3)膠體金探針的制備確定膠體金標記蛋白的最適穩(wěn)定量，將膠體金的PH值調(diào)至8.2，加入最適穩(wěn)定量的單抗，攪拌混合15-30min，加1%的BSA或O.05。/。的PEG20000，繼續(xù)攪拌15-60min，在4。C環(huán)境中靜置1-2h;4。C條件下1500-3000r/min離心10-20min，取上清液，接著在4。C條件下，9000-12000r/min離心20-60min，小心吸棄上清液，沉淀用金標保存液0.01mol/LPB或0.01mol/LPBS或0.Olmol/LTris-HC1重新懸浮至原體積的1/10，用0.45ym濾膜過濾，4。C環(huán)境中避光保存?zhèn)溆?，所述金標保存液中?%的BSA或O.05%PEG20000、0.05%NaN3;4)試紙條的組裝①將襯板、樣品墊層、結(jié)合墊層、包被NC膜及吸水層裁剪成適當尺寸，浸泡在處理液0.05mol/LPBS中至少3h以上，在37。C烘干16h以上備用，所述處理液中含1%BSA、0.02%PEG20000、0.lmol/LNaCl、l%NaN3;②將金標單抗、點膜單抗、羊抗鼠二抗制成工作濃度，將金標單抗噴涂在結(jié)合墊層上，將點膜單抗和羊抗鼠二抗噴涂在NC膜上制成檢測線和質(zhì)控線，將樣品墊層、噴有金標單抗的結(jié)合墊層、噴有點膜單抗和羊抗鼠二抗的NC膜及吸水層依次搭接在襯板上組成試條，置37。C烘箱烘20-30min，將試條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)，4'C密封貯存。與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果是本發(fā)明采用近年來發(fā)展起來的具有特異性強、靈敏度高、簡便快速特點的膠體金免疫層析檢測技術(shù)，利用雜交瘤技術(shù)篩選出的抗重組AP33蛋白的5株單克隆抗體，通過不同株單抗配對，優(yōu)化最佳反應模式，制成快速檢測陰道毛滴蟲的免疫層析試條。下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。附圖l為本發(fā)明試條具體實施例結(jié)構(gòu)示意圖；附圖2為本發(fā)明膠體金在400-600nm吸收曲線附圖3為本發(fā)明膠體金標記蛋白最適穩(wěn)定量曲線圖。具體實施方式快速檢測陰道毛滴蟲的免疫層析試條包括襯板和設(shè)置在襯板上依次搭接的樣品墊層、噴有金標單抗的結(jié)合墊層、噴有包被點膜單抗和羊抗鼠二抗的NC膜及吸水層，金標單抗為膠體金標記的單克隆抗體AP33中的一株，點膜單抗為單克隆抗體AP33中的另一株。先選擇任一株作為點膜單抗，然后與其他4株單抗配伍(金標)，選擇反應最強的配伍對，本實驗用4A2點膜，4F8做金標反應最強，然后以反應最強的金標抗體4F8為金標，再與其他4株單抗配伍，選擇反應最強配伍對。重復上述步驟，通過試驗篩選出4對反應較好的配伍對，即當點膜單抗為4A2，金標單抗為4F8，或點膜單抗為4A2，金標單抗為4F11，或點膜單抗為4F8，金標單抗為4E7，或點膜單抗為4F8，金標單抗為4F11時具有較高的靈敏度。試條的制備步驟如下1)單抗的純化雜交瘤細胞培養(yǎng)上清和腹水，用孔徑為0.22ym的微孔濾膜過濾，除去較大的凝塊及脂肪滴，然后分別依次用50%、33%飽和硫酸銨沉析1次，再通過蛋白A親和層析柱收集、合并洗脫液中含蛋白的部分，然后將其置于O.Olmol/LPB或O.01mol/LPBS或0.Olmol/LTris-HC1中透析，換液3-5次，4""C條件下9000-12000r/min離心lh，除去聚合物，得到純化好的單抗，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度并記錄。2)膠體金的制備取0.0P/。HAuCl4水溶液100ml，加入1%檸檬酸三鈉l-2ml，加熱煮沸使溶液由藍逐漸變?yōu)樽霞t色，直至變紅，即為膠體金溶液，將膠體金滴在覆有Formvar膜的銅網(wǎng)上，37'C烘箱干燥，透射電鏡下觀察拍照，測量金顆粒的直徑，并計算100個膠體金顆粒直徑的平均值及標準差，其顆粒直徑應在20-40nm之間，以30nm為佳，然后以雙蒸水作對照，用紫外分光光度計(如UV-7502PC紫外分光光度計)對制備的膠體金在400-600nm范圍內(nèi)進行掃描，測定其吸收曲線及最大吸收峰，如圖2所示，經(jīng)測定最大吸收峰在524nm處，且OD524nm=0.685，記錄最大吸收波長，選擇該波長為膠體金標記過程中特定的檢測波長。3)膠體金探針的制備先用光電比色法確定膠體金標記蛋白的最適穩(wěn)定量取膠體金5ml，用O.2mol/LK2C03調(diào)PH至8.2;將單抗AP33中所選的如4A2、4F11、4F8、4E7禾口4H115株單抗的蛋白濃度調(diào)至0.5mg/ml;在IO個EP管里分別加入O.5mg/ml單抗0、5、1045yl，用0.01mol/LPB補充體積到50y1，并編號；依次加入膠體金500yl混勻，靜置5min;加入50yl10。/。NaCl搖勻，靜置5min;以l號管為空白對照，用紫外分光光度計測定1-10號管OD580nm值，如圖3所示，以O(shè)D580nm值為縱坐標，蛋白用量為橫坐標，繪制曲線。選取曲線上最先與橫軸相近的那一點所對應的蛋白量作為蛋白最小穩(wěn)定量x，膠體金標記蛋白的最適穩(wěn)定量即為x(l+20。/。)，從曲線上可以看出，單抗?jié)舛葹?0yg/ml時曲線與橫軸最接近，即標記單抗的最小穩(wěn)定量x為30yg/ml，標記時在此基礎(chǔ)上再加20%即為膠體金標記蛋白的最適穩(wěn)定量為36yg/ml。然后將膠體金的PH值調(diào)至8.2，加入最適穩(wěn)定量的單抗，攪拌混合15-30min，加1。/。的BSA或0.05。/。的PEG20000，繼續(xù)攪拌15-60min，在4。C環(huán)境中靜置l-2h;以4。C條件下1500-3000r/min離心10-20min，取上清液，再以4。C條件下9000-12000r/min離心20-60min，小心吸棄上清液，沉淀物用O.01mol/lPB或0.01mol/LPBS或0.Olmol/LTris-HC1重新懸浮至原體積的1/10，用0.45ym濾膜過濾得到膠體金探針，4。C環(huán)境中避光保存?zhèn)溆?膠體金探針的鑒定(l)定量測定以金標保存液O.01mol/LPB或0.01mol/LPBS或0.01mol/LTris-HCl為空白對照測膠體金最大吸收峰524nm處0D值，所述金標保存液中含1%的BSA或O.05。/。的PEG20000、0.05%NaN3;(2)質(zhì)量鑒定采用斑點免疫吸附實驗對膠體金探針進行質(zhì)量鑒定，方法如下①將NC膜剪成lcmXlcm方格，裝入自制的反應板內(nèi)(中央有一小孔，下墊有吸水材料)；②將0.5mg/ml金標單抗分別做l:l，1:2，1:4，1:6，l:8倍稀釋，各取稀釋液2ul，同時取2ulPB緩沖液做陰性對照，分別點于剪好的膜片中央，37°Clh烘干；③將標記金溶液(1:10稀釋)和待測滴蟲抗原預混，取30yl預混液加到膜上，同時設(shè)裸針對照取0D^.2的30nm膠體金30yl加到膜上；④雙蒸水沖洗。4)試紙條的組裝①將襯板1、樣品墊層2、結(jié)合墊層3、包被NC膜4及吸水層5裁剪成適當尺寸，浸泡在處理液0.05mol/LPBS中至少3h以上，在37。C烘干16h以上備用，所述處理液中含1。/。BSA、0.02%PEG20000、0.lmol/LNaCl、l%NaN3;②將金標單抗、點膜單抗、羊抗鼠二抗制成工作濃度，將金標單抗噴涂在結(jié)合墊層3上，將點膜單抗和羊抗鼠二抗噴涂在NC膜4上制成檢測線6和質(zhì)控線7，將樣品墊層2、噴有金標單抗的結(jié)合墊層3、噴有點膜單抗和羊抗鼠二抗的NC膜4及吸水層5依次搭接在襯板1上組成試條，置37。C烘箱烘20-30min，將試條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)，4"C密封貯存。其中NC膜4為硝酸纖維素膜，結(jié)合墊層3由玻璃纖維膜構(gòu)成。使用方法將試紙條浸入待檢標本，標本中AP33抗原與結(jié)合墊中金標抗AP33的單抗結(jié)合后形成抗原抗體復合物，通過層析運動到NC膜4上，與包被單抗發(fā)生反應，形成雙抗體夾心復合物，出現(xiàn)紅色可見條帶，全部實驗過程需要3-15min。結(jié)果判斷陰性試紙條檢測帶(T帶)不顯色，僅質(zhì)控帶(C帶)顯色，出現(xiàn)l條紅色帶；陽性試紙條檢測帶和質(zhì)控帶均顯色，出現(xiàn)2條紅色帶。試紙條的性能測試靈敏度測定將重組AP33抗原按0，0.25，0.5，1.0，5.0，10，20，40，80ng/ml稀釋度進行檢測，檢測線出現(xiàn)紅色的最低可檢測量，結(jié)果顯示本試紙條檢測重組抗原的最低可檢測量為20ng/ml。特異性試驗本試紙條檢測18例大腸埃希菌、20例陰道桿菌、22例白色念珠菌，結(jié)果與3例白色念珠菌有弱交叉反應，特異性為95%。重復性試驗用同一批不同試紙條測定同一樣品，或用不同批號試紙條測定同一樣品時，其測試帶、質(zhì)控帶的顯色時間、顏色深淺和最終結(jié)果判斷基本相同。穩(wěn)定性試驗將該試紙條4'C條件下放置半年，每月抽檢，測定滴蟲感染人群和健康人群，其敏感性和特異性未見明顯改變。將該試紙條37。C溫箱放置14d，做熱穩(wěn)定性試驗與4。C條件下放置的試紙條對照，結(jié)果無明顯差別。臨床敏感性檢測從臨床收集120份陰道分泌物標本，分別用膠體金免疫層析法(GICA)和濕片法檢測陰道毛滴蟲黏附蛋白AP33，兩種方法比較見下表GICA和濕片法檢測臨床標本黏附蛋白AP33結(jié)果比較'<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>由上表可見，以濕片法檢測陰道毛滴蟲黏附蛋白AP33為參照，則GICA法的敏感性為90。/。，特異性為95%，兩法符合率為92.5%。權(quán)利要求1.一種快速檢測陰道毛滴蟲的免疫層析試條及制備方法，包括襯板和設(shè)置在襯板上依次搭接的樣品墊層、噴有金標單抗的結(jié)合墊層、噴有點膜單抗和羊抗鼠二抗的NC膜及吸水層，其特征在于所述的金標單抗為膠體金標記的單克隆抗體AP33中的一株，所述點膜單抗為單克隆抗體AP33中的另一株。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的快速檢測陰道毛滴蟲的免疫層析試條及制備方法，其特征在于所述的單克隆抗體AP33為4A2、4E7、4F8、4F11、4H11。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速檢測陰道毛滴蟲的免疫層析試條及制備方法，其特征在于所述點膜單抗為4A2，金標單抗為4F8。4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速檢測陰道毛滴蟲的免疫層析試條及制備方法，其特征在于所述點膜單抗為4A2，金標單抗為4F11。5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速檢測陰道毛滴蟲的免疫層析試條及制備方法，其特征在于所述點膜單抗為4F8，金標單抗為4E7。6.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的快速檢測陰道毛滴蟲的免疫層析試條及制備方法，其特征在于所述點膜單抗為4F8，金標單抗為4F11。7.種制備權(quán)利要求l所述試條的方法，其特征在于包括以下步驟1)單抗的純化雜交瘤細胞培養(yǎng)上清和腹水，用孔徑為0.22ym的微孔濾膜過濾，除去較大的凝塊及脂肪滴，然后分別依次用50%、33%飽和硫酸銨沉析l次，再通過蛋白A親和層析柱收集、合并洗脫液中含蛋白的部分，然后將其置于O.Olmol/LPB或O.01mol/LPBS或0.Olmol/LTris-HC1中透析，換液3-5次，4""C條件下9000-12000r/min離心lh，除去聚合物，得到純化好的單抗，用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度；2)膠體金的制備取0.0P/。HAuC14水溶液100ml，加入1%檸檬酸三鈉l-2ml，加熱煮沸使溶液由藍逐漸變?yōu)樽霞t色，直至變紅，即為膠體金溶液，并用紫外分光法確定膠體金最大吸收峰；3)膠體金探針的制備確定膠體金標記蛋白的最適穩(wěn)定量，將膠體金的PH值調(diào)至8.2，加入最適穩(wěn)定量的單抗，攪拌混合15-30min，加1%的BSA或O.05。/。的PEG20000，繼續(xù)攪拌15-60min，在4。C環(huán)境中靜置1-2h;4。C條件下1500-3000r/min離心10-20min，取上清液，接著在4。C條件下，9000-12000r/min高速離心20-60min，小心吸棄上清液，沉淀用金標保存液O.Olmol/LPB或O.01mol/LPBS或0.Olmol/LTris-HC1重新懸浮至原體積的1/10，用0.45ym濾膜過濾，4'C環(huán)境中避光保存?zhèn)溆茫鼋饦吮４嬉褐泻?%的BSA或O.05%的PEG20000、0.05%NaN3;4)試紙條的組裝①將襯板、樣品墊層、結(jié)合墊層、包被NC膜及吸水層裁剪成適當尺寸，浸泡在處理液0.05mol/LPBS中至少3h以上，在37。C烘干16h以上備用，所述處理液中含1。/。BSA、0.02%PEG20000、0.lmol/LNaCl、l%NaN3;②將金標單抗、點膜單抗、羊抗鼠二抗制成工作濃度，將金標單抗噴涂在結(jié)合墊層上，將點膜單抗和羊抗鼠二抗噴涂在NC膜上制成檢測線和質(zhì)控線，將樣品墊層、噴有金標單抗的結(jié)合墊層、噴有點膜單抗和羊抗鼠二抗的NC膜及吸水層依次搭接在襯板上組成試條，置37。C烘箱烘20-30min，4"C密封貯存。全文摘要本發(fā)明涉及一種試條，具體是檢測陰道毛滴蟲的免疫層析試條及制備方法。本發(fā)明采用近年來發(fā)展起來的具有特異性強、靈敏度高、簡便快速特點的膠體金免疫層析檢測技術(shù)，利用雜交瘤技術(shù)篩選出的抗重組AP33蛋白的5株單克隆抗體，通過不同株單抗配對，優(yōu)化最佳反應模式，制成快速檢測陰道毛滴蟲的免疫層析試條。文檔編號G01N33/577GK101144820SQ200710202218公開日2008年3月19日申請日期2007年10月23日優(yōu)先權(quán)日2007年10月23日發(fā)明者潘長旺申請人:溫州醫(yī)學院